Farnesyltransferase Inhibitor LNK -754 atenye distwofi aksonal epi redwi patoloji amiloid nan sourit Pati 2

D vivan nan newòn

Pou eksperyans k ap viv imaj, newòn yo te prepare menm jan pi wo a epi yo te plake nan asyèt anba vè 35mm (MatTek # P35G-1.5-14C) pou 7 jou nan kilti. Lè sa a, 10nM LNK-754 oswa lonafarnib te ajoute nan medya kondisyone, kilti kontwòl yo te trete ak DMSO kòm yon machin. Apre 48 èdtan nan tretman, medya yo te ranplase ak medya kondisyone ki soti nan plak paralèl newòn ki pa trete. 25nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) te ajoute nan medya kondisyone yo, epi newòn yo te enkube pou 30 minit nan 37 degre.

Newòn yo se yon pati enpòtan nan sistèm nève a, ki kapab resevwa, trete, ak transmèt enfòmasyon, epi yo se baz materyèl nan entèlijans imen ak konpòtman. Iminite se yon garanti enpòtan pou kò imen an reziste maladi. Li ka idantifye ak detwi patojèn ak selil nòmal epi kenbe sante kò a.

Rechèch montre ke gen yon koneksyon solid ant newòn ak sistèm iminitè a. Newòn yo ka afekte sistèm iminitè a lè yo lage yon varyete nerotransmeteur, tankou norepinephrine, epinephrine, elatriye nerotransmeteur sa yo ka chanje aktivite selil iminitè yo, amelyore pwopagasyon ak fonksyon selil iminitè yo, epi amelyore iminite kò a. An menm tan an, sistèm iminitè a kapab tou afekte fonksyon newòn atravè divès chemen. Selil iminitè yo ka sekrete yon varyete sitokin ak òmòn, ki afekte kwasans, devlopman, ak fonksyon newòn atravè chemen iminitè yo.

Anplis de sa, faktè sikolojik ak sosyal ka enfliyanse iminite ak fonksyon newòn. Emosyon negatif tankou estrès, enkyetid, ak depresyon ka yon move efè sou sistèm iminitè a ak newòn, diminye iminite kò a. Emosyon pozitif, relasyon sosyal pozitif, ak yon vi ki an sante ka ankouraje devlopman an sante nan iminite ak newòn.

Pou rezime, gen yon relasyon entèaktif ak mityèlman sipò ant newòn ak iminite. Kenbe sante mantal, fè fas a lavi pozitivman, ak adopte bon abitid k ap viv ka ankouraje iminite kò a ak devlopman an sante nan newòn. Li ka wè ke nou bezwen amelyore memwa nou an. Cistanche deserticola ka siyifikativman amelyore memwa, paske Cistanche deserticola kapab tou kontwole balans nerotransmeteur, tankou ogmante nivo asetilkolin ak faktè kwasans. Sibstans sa yo trè enpòtan pou memwa ak aprantisaj. Anplis de sa, vyann kapab tou amelyore sikilasyon san ak ankouraje livrezon oksijèn, sa ki ka asire ke sèvo a resevwa ase eleman nitritif ak enèji, kidonk amelyore vitalite nan sèvo ak andirans.

Klike sou konnen fason pou amelyore fonksyon nan sèvo

Yo te fè imaj time-lapse nan newòn lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Ti2 widefield. Imaging te kòmanse imedyatman nan 30 minit epi li te kontinye pou pa plis pase 30 minit. Ekspozisyon 1- yo te pran chak minit, epi 20-30 zòn separe pou chak plat yo te imajine nan 30 minit. Kantiifikasyon distans ak vitès patikil LysoTracker ak analiz kimograf yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl NIS Elements epi yo dekri an detay anba a. Nan eksperyans separe, yo te ajoute 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) nan medya kondisyone, epi yo te pran imaj ki te kaptire nan newòn ap viv pou pa plis pase 15 minit lè l sèvi avèk yon mikwoskòp konfokal Nikon A1 ak yon objektif 60X. (NA 1.4) ak lojisyèl NIS Elements.

D vivan nan tisi nan sèvo

{{0}}sourit 5XFAD ki gen yon mwa yo te enjekte ip chak jou pandan 3 semèn epi apre tretman an fini, yo te anestezi sourit, epi yo te perfuze ak yon solisyon ki gen 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1mM kynurenate. , 0.01mM DL-2-Amino{-5-asid fosfonopentanoik, 5mM glutatyon, 25mM glikoz, 125mM NaCl, 1.4mM NaH2PO4 ak 25mM NaHCO3.

Lè sa a, sèvo yo te rapidman diseke nan glas-frèt oksijene ACSF ki gen 2.5mM KCl, 85mM NaCl, 1.25mM NaH2PO4, 25mM NaHCO3, {{10}}.5mM CaCl2, 4mM 4MgCl2M, sikwoz, 4MgCl2M, sikwoz, glikoz. 50uM C6H7NaO6, 0.1mM kynurenate, 0.{01mM DL-2-Amino-5-asid fosfonopentanoik ak 5mM glutatyon. 300μm tranch coronal yo te jwenn lè l sèvi avèk yon mikrotom Compresstome VF-200 vibre (Enstriman Precision) epi yo te pèmèt yo repoze pou 30 minit pou rekiperasyon nan 32 degre nan solisyon oksijene ACSF ki gen 2.5mM KCl sa a, 85mM NaCl, 1.25mM, NaH25,M 25mM NaHCO3, 0.5mM CaCl2, 4mM 4 MgCl2, 75mM sikwoz, 25mM glikoz, 50uM C6H7NaO6, 0.1mM kynurenate, 0.01mM DL2-Amino asid ak{5.

Lè sa a, tranch yo te transfere nan asyèt anba vè 35mm (MatTek # P35G-1.5-14C) ki gen ACSF oksijene ak 25nM LysoTracker-Green ak yon dilution 1:10,000 nan 1mg / mL Tiazine Wouj (#S570435, Sigma Aldrich) ki te otreman idantik ak ACSF yo te itilize pandan peryòd rekiperasyon an. Yo te konfime viabilite tranch lè l sèvi avèk D 'time-lapse nan tisi yo. Tranch yo te enkube ak LysoTracker-Green ak Tiazine Wouj pou 15 minit nan tanperati chanm ak Lè sa a, rejyon nan sèvo cortical yo te imaj imedyatman nan menm solisyon an nan 32 degre sou yon mikwoskòp konfokal Nikon A1 ak yon objektif 60X (NA 1.4) ak lojisyèl NIS Elements pou pa plis pase 30 minit.

Ekstraksyon nan sèvo ak imunoblot

Sourit yo te anestezi pa piki intraperitoneal xylazine (15mg/kg) ak ketamin (100mg/kg), perfused ak fosfat-tanpon saline (1XPBS) ak fliyò phenylmethylsulfonyl (20ug/ml), leupeptin (0.5ug/ml), orthovanadate sodyòm (20μM), ak dithiothreitol (0.1mM), ki te swiv pa retire sèvo. Tout tanpon yo te itilize pou fè ekstraksyon pwoteyin genyen bwason inibitè proteaz III (#535140, Millipore) ak inhibitor Halt fosfataz (#78420, Thermo Fisher Scientific). Tisi Hemibrain yo te peze ak manyèlman omojeneize lè l sèvi avèk yon homogenizer dounce 1:10 (w / v) nan 1XPBS.

Apre omojenizasyon, lisat yo te santrifuje nan 20,8{{10}}0g pou 30 minit nan 4 degre. Yo te retire fraksyon i ka fonn (supernatant), epi yo te resispann i grenn nan pipèt nan tanpon radyo-imunoprecipitation (RIPA) [50mM Tris, 0.15M NaCl, 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (IGEPAL), 1mM EDTA, 1mM EGTA, SDS5, 0.10%. % deoxycholate sodyòm nan pH8] pou enkube sou glas pou 30 minit.

Echantiyon yo te sonike (Misonix XL{{0}}) pou 20 segonn sou glas ak Lè sa a, santrifuje nan 20,800g pou 30 minit nan 4 degre. Yo te retire fraksyon nan RIPA-idrosolubl (supernatant), epi yo te repoze i grenn nan nan 5M guanidine (pH 8.0) pou analiz de pwoteyin ensolubl. Chak echantiyon yo te sonike pou 20 segonn sou glas la, vire pou 1 èdtan nan tanperati chanm, ak Lè sa a, santrifuje nan 20,800 g pou 30 minit nan 4 degre. Yo te itilize tès asid bicinchoninic (BCA) (#23225, Thermo Fisher Scientific) pou mezire konsantrasyon pwoteyin chak echantiyon.

Pou tach lwès yo, yo te chaje 20ug pwoteyin chak echantiyon sou 4-12% jèl NuPAGE (Invitrogen) epi yo te separe lè l sèvi avèk tanpon MOPS nan kondisyon redwi ak denatire. Pwoteyin yo te transfere sou manbràn polyvinylidene difluoride epi devlope lè l sèvi avèk Pierce ECL (enhanced chemiluminescence; Thermo Fisher Scientific). Siyal yo devlope yo te vizyalize lè l sèvi avèk ProteinSimple FCR (FluorChem R) ak siyal kimiluminesan ki vin apre yo te quantifye lè l sèvi avèk lojisyèl AlphaView (ProteinSimple). Tout tach yo te analize avèk zouti Koreksyon Fond Lokal eksepte HDJ-2 blot, ki te analize lè l sèvi avèk zouti Lyen Background an konjonksyon avèk Koreksyon Background Milti-rejyonal (lojisyèl AlphaView).

A 42 ELISA

Pou mezire A 42 nan omojèn hemibrain ki soti nan sourit 5XFAD, yo te itilize yon tès Enzyme-LinkedImmunosorbent-Assay (ELISA) ki disponib nan komès (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) swiv enstriksyon manifakti a pou analize guanidine ak PBS-soluble A 42 nan hemibrains. Pou mezire A 42 nan sèvo sourit hAPP/PS1 yo, yo te itilize yon ELISA ki disponib nan komès (h amyloid 42 ELISA high sensitive, Te Genetics Company, Zurich, Swis). ELISA a te fèt selon pwotokòl manifakti a.

Iminofluoresans tisi nan sèvo sourit

Apre perfusion, sèvo yo te ekstrè ak hemibrains yo te fiks nan 10% fòmalin ki te swiv pa kriyokonservasyon nan 30% solisyon sikwoz nan 1XPBS. Yo te itilize yon mikrotom glisman konjelasyon pou rekòlte 30-μm seksyon koron oswa sagittal. Seksyon yo te seri yo mete nan yon plak 12-byen nan yon solisyon kriyopwotektif (1xPBS, 30% sikwoz, ak 30% ethylene glycol) epi estoke nan -20 degre jiskaske yo itilize. Tach imunofluoresan te fèt pa premye lave seksyon twa fwa nan 1XTBS ak Lè sa a, seksyon enkubasyon nan 16 mM glisin nan 1XTBS pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Apre 3 lave adisyonèl nan 1XTBS, seksyon yo te bloke nan 5% serom kabrit nan 0.25% Triton X-100 nan 1XTBS pou 2 èdtan nan tanperati chanm.

Lè sa a, seksyon yo te enkube lannwit lan nan antikò prensipal nan yon solisyon nan 0.25% Triton X-100, 1% albumin serom bovin, ak 1XTBS nan 4 degre. Lè sa a, yo te fè imunostaining segondè ak antikò segondè ki make AlexaFluor nan yon konsantrasyon 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) te itilize pou monte seksyon anvan yo te imajine sou yon mikwoskòp Ti2 lajè oswa yon mikwoskòp konfokal Nikon A1 lazè eskanè pou quantifikasyon imaj lè l sèvi avèk lojisyèl Nikon NIS Elements pou akizisyon.

Tout paramèt akizisyon yo te rete menm jan an ant jenotip ak tout imaj yo te akeri nan menm peryòd D 'pou eksperyans endividyèl (Northwestern University Center for Advanced Microscopy and Nikon Imaging Center).

Kantifikasyon imaj

Sèvo sourit

Kantifikasyon imunofluoresans nan imunostaining tisi nan sèvo sourit yo te fèt sou 3-5 seksyon pou chak bèt, ki soti nan kowòdone Bregma nan apeprè -0.94 a -2.55mm, ki te imajine lè l sèvi avèk yon objektif 10X sou yon mikwoskòp Ti2 lajè jaden. Analiz Quantification, ki gen ladan gwosè ak papòt entansite, yo te fèt lè l sèvi avèk Nikon NIS-Elements Software (Northwestern University Nikon Imaging Center).

Tou depan de siyal la, papòt yo te etabli lè l sèvi avèk zouti analiz jeneral la ki baze sou gwosè objè, fòm, ak kontras, ak Lè sa a, mask binè yo te kreye pou chak chanèl ak rejyon nan enterè yo. Thresholding te fèt separeman sou chak chanèl pou izole siyal enterè yo pa optimize rapò siyal-a-bri ak elimine siyal background ki pa espesifik. Pou kalkil la nan LAMP1, BACE1, oswa LysoTracker-Green kouvri zòn, osi byen ke LAMP1 ak Lysosensor mezi entansite fluoresans nan newòn prensipal yo, rejyon nan enterè yo te manyèlman trase lè l sèvi avèk NIS-Elements ak yon kouch binè te kreye pou chak rejyon nan enterè yo.

Pou kalkile rapò LAMP1 ak A 42, zòn LAMP1 nan neurit distrofik yo te nòmalize nan zòn A 42 sou yon baz plak endividyèl ak rapò mwayèn pou chak sourit ant gwoup tretman yo te kantite. Analiz koyefisyan korelasyon Pearson pou BACE1 ak LAMP1 te fèt lè l sèvi avèk NIS-Elements sou yon baz pou chak plak sou pwojeksyon maksimòm entansite nan 30μm Z-stack imaj yo te pran lè l sèvi avèk yon Nikon A1 lazè optik konfokal mikwoskòp ak yon gwosè etap 1μm.

Pou kalkile rapò LysoTrackerGreen ak Tiazine wouj, yo te nòmalize zòn LysoTracker-Green nan neurit distrofik ak zòn Tiazine Wouj sou yon baz plak endividyèl epi yo te kalkile rapò mwayèn pou chak sourit ant gwoup tretman yo. Kat seksyon coronal soti nan kowòdone Bregma nan apeprè -1.70 a -2.55mm yo te itilize pou kalkile zòn oswa entansite chak siyal nan chak rejyon nan sèvo respektif pou chak sourit. Analiz zòn plak ki kouvri ak gwosè plak yo te fèt lè l sèvi avèk mwayèn senk seksyon pou chak sourit soti nan kowòdone Bregma nan apeprè -0.94 a -2.55mm. Seleksyon seksyon, akizisyon imaj, trase imaj, ak quantifications te fèt pa yon moun avèg nan gwoup tretman ak jenotip.

Newòn prensipal yo

Pou quantification immunostaining LAMP1 nan newòn prensipal sourit fiks yo, yo te trase somas manyèlman baze sou mòfoloji lè l sèvi avèk NIS-Elements, epi yo te kreye yon mask binè pou chak rejyon enterè ak chanèl. Yo te itilize Thresholding pou optimize siyal LAMP1 ak distenge LAMP1 nan neurit, ki gen ladan tou de dendrit ak axons, lè yo izole piksèl LAMP1 pozitif pou piksèl tubulin.

Selil soma LAMP1 siyal yo te eskli nan zòn total LAMP1 pou analize vesik LAMP1 nan neurites. Pou analiz de mobilite LysoTracker-Green nan newòn, imaj yo te quantifye lè l sèvi avèk NISElements. Vitès ak distans total patikil LysoTrackerGreen nan chak ankadreman yo te swiv lè l sèvi avèk karakteristik swiv mouvman otomatik nan NIS-Elements. Yo te fikse yon papòt epi aplike nan tout fim ki baze sou gwosè ak entansite fluoresans nan patikil LysoTracker-Green pou elimine bri background.

Pou jenerasyon kimograf yo, yo te fè imaj ki depase nan newòn sèl sou yon mikwoskòp konfokal 60X ak axon yo te idantifye mòfolojikman. Pousantaj nan frekans nan patikil k ap deplase nan yon direksyon anterograd oswa retwograd, oswa estasyonè, yo te mezire lè yo divize kantite patikil pou chak gwoup pa kantite total patikil. Pou analiz kimograf, patikil k ap deplase yo te defini kòm yon vitès ki pi wo a 0.1μM / sec.

Analiz estatistik

Lojisyèl GraphPad Prism v8 te itilize pou fè analiz estatistik, ki gen ladan analiz divèjans (ANOVA) ak tès posthoc lè yo konpare plis pase de echantiyon ak tès t ki pa pè lè sèlman de echantiyon yo te konpare. Detay espesifik tès ki gen ladan kantite replike, kalite tès posthoc, ak valè P yo endike nan lejand figi yo. Tout quantifcations yo trase nan mwayen an±SEM. Siyifikasyon yo te konkli lè valè P a te mwens pase 0.05, ki endike pa *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com