Fisetin diminye repons enflamatwa lipopolisakarid yo nan makrofaj.

Pou plis enfòmasyon, kontaktetina.xiang@wecistanche.com

Plizyè etid yo te rapòte efikasite ak sekirite polifenol nan sante moun; sepandan, verifikasyon an nan efikasite yo rete ensifizan. Objektif etid sa a se te egzamine si fisetin, youn nan flavonoid yo ki te prezan nan fwi ak legim, te kapab siprime lipopolysaccharide-(LPS-) pwovoke.enflamatwarepons nan macrophages. LPS ogmante abondans mRNA pro-enflamatwa (MCP 1, IL-1ß, ak iNOS) men yo te siprime pa fisetin. Enkreman nan oksid nitrique pa LPS, yon faktè estrès oksidatif, te atenye pa fisetin. Anplis de sa, fosforilasyon LPS-amelyore nan mitogen-aktive kinaz pwoteyin (ERK ak JNK) te redwi. Finalman, fisetin diminye ekspresyon oswa aktivite uPA, uP AR, MMP-2, ak MMP-9, ke yo rekonèt kòm faktè ki asosye nan rekritman macrophage oswa enfiltrasyon. An konklizyon,fisetinse yon ajan terapetik pwomèt pou maladi enflamasyon ki gen rapò ak makrofaj, tankou sepsis ak ateroskleroz.

Klike la a pou aprann plis enfòmasyon.

1. Entwodiksyon

Itilizasyon terapetik konpozan natirèl yo te genyen plis atansyon nan 2 dènye deseni yo. Dapre gwo eff-cacy yo ak toksisite ki ba, 40 pousan nan ajan terapetik FDA apwouve yo se eleman ki baze sou natirèl oswa dérivés yo [1]. Toksisite ki asosye ak lòt dwòg te avèk siksè anpeche pa diferan pwodwi natirèl [2]. Kidonk, li trè enpòtan ak enpòtan yo eksplore konpoze natirèl ki sòti nan plant yo pi lwen.

Polifenolse metabolit segondè plant yo epi yo lajman prezan nan manje ak bwason ki gen orijin plant, fwi, legim, epis santi bon, te, ak diven. Malgre ke yo pa konsidere kòm mikronutriman esansyèl, plizyè kalite literati montre efè benefik yo sou sante moun, espesyalman nan rejim ki asosye ak gwo konsomasyon nan fwi ak legim [3-5]. Plizyè etid yo te fèt pandan plizyè dizèn ane pou envestigasyon efè famasi polifenol yo, ki sijere benefis pou sante. Prèv k ap grandi yo montre ke kèk polifenol posedeanti-enflamatwapwopriyete yo

[6-8].Anplis de sa, etid resan yo te demontre ke plizyè kalite polifenol ka anpeche anzim regilasyon oswa faktè transkripsyon ki enplike nan enflamasyon [9].

Rejim enfliyanse diferan etap nan enflamasyon ak demontre yon enpak enpòtan sou plizyè maladi enflamatwa [10,11]. Enflamasyon jwe yon wòl kle nan devlopman maladi tankou dyabèt, opresyon, maladi kadyovaskilè, ak kansè [12]. Se poutèt sa, kontwole enflamasyon ka anpeche maladi sa yo. Depi makrofaj yo se gwo medyatè enflamasyon, yo gen divès fonksyon nan omeyostazi tisi ak enflamasyon. Kidonk, ajan yo efektivman modulation fonksyon yo gen gwo valè klinik depi deklanchman aberan nan macrophages ka lakòz repons iminitè prejidis. Tandans rechèch aktyèl la endike klèman ke pwodwi natirèl yo se youn nan sous ki pi enpòtan nan nouvo dwòg [13].

Yon polifenol, isetin (3,3',4',7-tetrahydroxyflavone), genyen anpil nan frèz, pòm, tomat, zonyon, zoranj, pèch, rezen, kiwi, kaki, te, ak diven [14] . Jiskaprezan, fisetin rapòte fò anti-enflamatwa [15-17],

antioksidan [18], antitumorigenic [19,20, antiangiogenic [21], antidyabetik [22], neuroprotective [23], ak cardioprotective efè [24] tou de nan kilti selil ak nan modèl bèt ki gen rapò ak maladi imen. Malgre ke fisetin gen anpil efè fizyolojik, efè li sou makrofaj pa anpil rapòte.

Nan etid sa a, nou te envestige efè benefik fisetin sou repons enflamatwa makwofaj yo aktive pa.lipopolisakarid(LPS).

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Izolasyon makwofaj peritoneal rezidan yo.

Sourit BALB/c yo te jwenn nan Enstiti Syans Medikal nan Inivèsite Tokyo epi yo te kenbe nan Sant Resous Animal nan Inivèsite Okayama. Tout eksperyans bèt yo te fèt pou konfòme yo ak direktiv NIH yo (Gid pou Swen ak Itilizasyon Bèt Laboratwa). Pwotokòl eksperimantal la te apwouve pa Komite Revizyon Etik pou Eksperyans bèt nan Lekòl Gradye Medsin, Dexter, ak Syans Famasetik Inivèsite Okayama (OKU{0}}). Tout sourit yo te kenbe nan yon etablisman baryè epi yo te manje yon rejim laboratwa nòmal. Gason ak fi sourit BALB/c, 16 ± 4 semèn ki gen laj yo te anestezi ak isoflurane ak euthanized atravè dislokasyon nan matris. Macrophages yo te rekòlte atravè lavaj peritoneal lè l sèvi avèk saline (5mL). Solisyon lavaj peritoneal la te santrifuje nan 1500rpm pou 5 minit. Sediman an te sispann nan yon ti DMEM(SIGMA, Cat. No.D6046). Selil wouj yo te lysed lè l sèvi avèk yon solisyon nan klori amonyòm. Kantite makrofaj yo te kalkile lè l sèvi avèk yon emositomèt, answit yo te resispann nan DMEM ki gen FBS ki inaktive chalè (10 pousan vv), penisilin (10 U/mL), ak streptomycin (10mg/mL), epi yo te plake nan 6-byen. plak (Corning Incorporated, Cat. No.3516) [25,26].

2.2. Kondisyon Kilti Selil.

Apre grangou serom lannwit lan, macrophages yo te enkube ak konsantrasyon chwazi nan fisetin (10, 30, ak 100 μM; SIGMA, chat. No F4043)oswa veyikil pou 3 èdtan epi enkube nan prezans oswa absans LPS(10ng/mL; SIGMA, Cat. No.L4391) pou yon tan apwopriye. Lè sa a, mwayen an ak selil yo te kolekte. Yo te itilize mwayen an pou tès oksid nitrique (NO) ak zimografi jelatin. Lysates selil yo te itilize pou reyaksyon chèn polymerase quantitative (qPCR) ak Western blotting.

2.3. Reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl.

mRNA yo te ekstrè nan makrofaj lè l sèvi avèk RNeasy Mini Kits (QIAGEN, Cat. No.74104). Transkripsyon ranvèse te fèt lè l sèvi avèk yon Twous sentèz cDNA iScript (Bio-Rad, Cat. No. 1708891). qPCR te fèt ak yon ABI Step One Real-Time PCR System (Applied Biosystems, QuantStudio 3) lè l sèvi avèk yon Fast SYBR Green PCRMixture an tan reyèl (Applied Biosystems, Cat. No.4385612)[27). Prensipal pou pwoteyin chemotaktik monosit 1(MCP-1)(Takara Bio Inc, Cat. No. MA066003), interleukin 1 beta (IL{-1) (Takara Bio Inc., Cat. No. MA025939), inductible nitrique oksid synthase (iNOS)(Takara Bio Inc, Cat. No MA083369), matris metaloproteinase-(MMP-)2 (Takara Bio Inc., Cat. No. MA127110), MMP-9(Takara Bio Inc. ., Cat. No.MA031311), and18S ribosomal RNA(18S)(Takara Bio Inc., Cat. No. MA050364)te disponib nan komès. Chak echantiyon te nòmalize nan valè pou ekspresyon 18S mRNA (metòd AACT) [27].

2.4. Esè oksid nitrique.

Supernatant kilti selil endividyèl yo te kolekte epi santrifuje 10min nan 14,000rpm nan 4 degre. Lè sa a, yo te itilize supernatant la pou tès oksid nitrique (NO). Yo te fè tès NO a jan sa dekri nan twous ki disponib nan komès (BioAssay Systems, Cat. No. D2NO-100). BioAssay Systems'QuantiChrom Nitric Oxide Assay Kit se yon tès kolorimetrik pou detèminasyon NO pwodiksyon apre rediksyon nitrat nan nitrite lè l sèvi avèk metòd Griess amelyore.

2.5. Western Blotting.

Pwoteyin antye-selil yo te ekstrè soti nan macrophages lè l sèvi avèk yon tanpon lysis(Cell Signaling, Cat. No.9803). Chak echantiyon te aplike nan 10 pousan SDS-PAGE ak transfere nan yon manbràn fliyò polyvinylidene, immunoblotted ak antikò prensipal (fosforilasyon nan kinaz la siyal ki kontwole ekstraselilè (p-ERK); Siyal selil, Cat. No.9101, fosforilasyon an nan c-Jun N-terminal kinase(p-JINK);Siyal selilè, Cat. No.9251, urokinase plasminogen activator(uPA);Abcam, Cat. No.

ab20789, urokinase plasminogen activator, ak reseptè (uPAR); R & D, Cat.No.AF534, ak -aktin; Sigma chat. Nimewo A5441)[28]. Lè sa a, manbràn yo te enkube ak antikò segondè ki apwopriye, ak konplèks iminitè yo te vizyalize sou chemiluminescence (Merck Millipore, Cat. No. WBLUF0100, Cat.no. WBLUC0100) ak quantifye lè l sèvi avèk yon General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini) [29].

2.6. Zimografi jelatin.

Supernatant kilti selilè yo te rezoud nan kondisyon ki pa diminye pa SDS-PAGE (10 pousan wt/vol) polimerize nan prezans jelatin (0.1 pousan wt/wt) pou evalye aktivite MMP{ {4}}. Jèl yo te lave ak Triton X-100(2.5 pousan vol/vo) pou 60min ak dlo distile pou 15min de fwa. Lè sa a, jèl yo te enkube lannwit lan nan 37 degre Cin 50mM Tris tanpon ki gen klori kalsyòm (5mM)pH8.0.Apre enkubasyon, jèl yo te tache ak Coomassie Brilliant Blue R-250(Bio-Rad, Cat. No.{ {18}})pou 30min nan tanperati chanm, apresa detache ak Coomassie Brilliant Blue R-250 Solisyon Destaining (Bio-Rad, Cat. No.161-0438) jiskaske bann klè parèt. Imaj jèl yo te quantifye lè l sèvi avèk yon General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); rejyon yo san tach, translusid dijere reprezante zòn nan aktivite MMP [30].

2.7. Estatistik.

Tout analiz estatistik yo te fè lè l sèvi avèk Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, Kalifòni, USA). Done yo prezante kòm mwayèn ± erè estanda nan mwayèn nan. Siyifikasyon estatistik ant plizyè gwoup te evalye pa yon sèl-fason oswa de-fason analiz nan divèjans ki te swiv pa tès Holm-Sidak post hoc oswa Student-Newman-Keuls post hoc tès. pvalè<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezilta yo

3.1. Fisetin atténué medyatè enflamatwa nan makrophages stimulé ak LPS.

Depi makrofaj aktive pwodui sitokin pro-enflamatwa ak medyatè enflamatwa tankou NO[8], nou egzamine efè fisetin sou medyatè enflamatwa nan makrofaj ankouraje ak LPS. Premyèman, pou etidye si wi ou non fisetin egzèse efè anti-enflamatwa nan nivo transkripsyon an, nou detèmine nivo ekspresyon mRNA A nan jèn enflamatwa tankou MCP-1, IL-1, ak iNOS (Figi 1 (a) ). Kòm espere, ekspresyon jèn enflamatwa sa yo te siprime pa fisetin nan yon fason ki depann de dòz la. Apre sa, konfime si wi ou non fisetin siprime repons enflamatwa nan makrofaj, nou evalye kapasite li nan siprime NO pwodiksyon nan makrofaj LPS-trete (Figi 1 (b)). Kòm espere, fisetin diminye pwodiksyon NO nan yon fason ki depann de dòz la.

3.2. Fisetin redwi Mitogen-aktive Pwoteyin Kinaz nan Macrophages ankouraje ak LPS.

Depi yo te rapòte fisetin pou anpeche mitogen-aktive pwoteyin kinaz (MAPK) chemen nan divès kalite selil [31, 32], nou te egzamine efè fisetin sou MAPK nan makrofaj. Premyèman, yo te obsève aktivasyon MAPK yo pwovoke pa LPS nan makrofaj (Figi 2 (a)). Ogmantasyon nan p-ERK pa LPS te pik nan 15 minit apre eksitasyon, pandan y ap ogmantasyon nan p-JNK pa LPS te pik nan 30 minit. Kidonk, nan eksperyans ki vin apre yo, macrophages yo te ankouraje ak LPS pou 30 minit. Cotreatment ak fisetin siyifikativman diminye LPS-induit amelyorasyon nan p-ERK ak p-JNK (Figi 2 (b) ak 2 (c)).

3.3. Fisetin redwi uPA ak uPAR nan makrofaj ki ankouraje ak LPS.

Aktivasyon makrofaj yo byen asosye ak envazivite selil yo. Anplis de sa, uPA ak uPAR nan makrofaj kontribye nan enfiltrasyon nan selil yo. Kidonk, yo te envestige efè fisetin sou ekspresyon uPA ak uPAR. LPS pwovoke abondans pwoteyin nan uPA (Figi 3 (a)) ak uPAR (Figi 3 (b)). Cotreatment nan fisetin redwi ogmantasyon nan uPA (Figi 3 (a)) ak uPAR pa LPS (Figi 3 (b)).

3.4. Fisetin redwi MMP-2 ak MMP-9 nan makrofaj ki ankouraje ak LPS.

Anplis de sa, pou nou eksplike efè fise-tin sou MMP yo, nou te egzamine ekspresyon MMP-2 ak MMP{-9, medyatè en nan uPA/uPAR. Konsènan nivo mRNA a, LPS ogmante siyifikativman MMP-2 ak MMP-9 ekspresyon mRNA, konpare ak tretman veyikil la (Figi 4 (a)). Fisetin redwi amelyorasyon nan ekspresyon jèn sa yo nan MMP -2 oswa MMP9 pwovoke pa LPS nan yon fason ki depann de dòz (Figi 4 (a)). Anplis, aktivite pwoteyin MMP-9 yo te evalye pa zimografi (Figi 4 (b)). Aktivite pwoteyin MMP-9(92kDa) te ogmante pa eksitasyon LPS, ki te redwi pa fisetin (Figi 4 (b)).

4. Diskisyon

Nou te jwenn yon efè enpòtan nan fisetin kont enflamasyon nan macrophages. Etid la te demontre ke fisetin diminye endiksyon konpozan enflamatwa tankou MCP-1, IL{-1, iNOS, ak NO, pwovoke pa LPS nan makrofaj yo. Anplis de sa, fisetin siprime deklanchman MAPK ak atenue enkreman LPS-induit nan ekspresyon uPA ak uPAR. Anplis, fisetin diminye ogmantasyon abondans mRNA MMP-2 ak MMP-9 ak aktivite MMP-9.

Nan sepsis ki te koze pa enfeksyon gram-negatif, LPS se souvan rekonèt kòm ajan kozatif nan sepsis. Nan anpil etid, LPS yo te itilize kòm yon modèl nan sepsis osi byen ke enflamasyon. Anplis, enflamasyon kwonik pwovoke kansè bonè pa aktivasyon selil enflamatwa ak move pwodiksyon yon medyatè proenflamatwa tankou iNOS ak faktè transcription tankou faktè transkripsyon nikleyè kappa B (NF-xB) [33]. Anplis, li te rapòte tou ke estrès oksidatif redwi lè yo diminye ekspresyon iNOS [34]. Etid nou an demontre ke fisetin ka efikas nan prevansyon ak tretman nan sepsis ak chòk septik, akòz efè a sipresyon sou abondans mRNA nan jèn pro-enflamatwa ak pwodiksyon an nan NO. Nan etid sa a, fisetin siprime NO pwodiksyon pa diminye ekspresyon mRNA nan jèn proinflammatory (iNOS); Se poutèt sa, li te gen anpil chans ke fisetin atenue estrès oksidatif. Kontinwe, rezilta sa yo sipòte efè anti-enflamatwa, antitumorigenic, ak antioksidan nan fisetin.

Plizyè etid yo te rapòte ke LPS pwovoke fosforilasyon MAPK yo, ki gen ladan ERK ak JNK [35].Anplis de sa, li te rapòte ke fisetin inibit migrasyon ak envazyon nan selil imen nan matris pa downregulating ekspresyon uPA nan siprime MAPK [36]. -phages, kèk rapò ki disponib konsènan efè fisetin sou ekspresyon ak aktivite uPA ak uPAR. Etid nou an te demontre pou premye fwa ke fisetin siprime ekspresyon uPA ak uPAR ki te pwovoke pa LPS atravè siyal MAPK nan makwofaj yo, jan yo te deja rapòte nan selil kansè yo.

MMP yo se yon fanmi nan proteaz ki gen ekspresyon ki gen rapò ak sèten pwosesis, tankou devlopman, fizyoloji, ak patoloji. An komen, yo rekonèt MMP-9 kòm yon makè divès maladi enflamatwa, tankou ateroskleroz, atrit, ak lupus eritematos sistemik [37]. Anplis de sa, MMP-9 te asosye byen ak migrasyon selil [38,39]. Plizyè etid yo te rapòte patikilyèman ke MMP-2 ak MMP{-9 patisipe nan aterojenèz epi yo jwe yon wòl enpòtan nan estabilizasyon plak ateroskleroz 40-42].Sou pwen sa a, rezilta nou yo sijere ke inhibiteurs. nan MMP-9 ka ofri pwomès kòm yon apwòch terapetik pou estabilizasyon nan plak vilnerab yo. Anplis, dènye envestigasyon yo te demontre ke gerizon blesi nan po a gen pwoblèm pa twòp aktivasyon nan MMP -9 [43]. Se poutèt sa, li te sijere ke fisetin tou gen potansyèl kòm yon apwòch terapetik pou geri nan po a. Syans nan lavni yo pral oblije elicide detay li yo sou mekanis molekilè.

Yon tandans resan nan endistri pharmaceutique la dekouvri estrateji pou devlope plant natirèl la tèt li kòm nouvo dwòg la. Vreman vre, de etid bèt resan yo te demontre ke LPS-pwovoke egi enflamasyon poumon ak atrit kolagen-induit te amelyore pa tretman fisetin |32,44. Yon lòt etid ansyen vivo te demontre tou ke fisetin te kapab diminye lage cytokine LPS-induit nan leukocytes nan pasyan ki gen maladi kwonik obstriktif poumon oswa dyabèt tip 2 [45]. Yo te devlope anpil medikaman imunosuppressive pou diminye maladi enflamatwa ak otoiminitè [46-50]; kanmenm, pifò com-pounds montre efè segondè enpòtan. Depi polifenol yo souvan prezan nan fwi ak legim dyetetik, yo prezimableman ka pi an sekirite ajan imunosuppressive [51, 52]. Fwi ak legim gen yon pakèt fitochimik ki gen ladan laktòn sesquiterpene, terpenoid, polisakarid, ak konpoze fenolik. Rezilta nou yo, ki demontre efè anti-enflamatwa, antitumorigenic, ak antioksidan nan fisetin, fòtman endike ke li ka devlope kòm yon nouvo dwòg. Malgre ke fisetin se yon kandida pwomèt pou iminoterapi, potansyèl pwodwi natirèl ki gen fisetin kòm yon ajan terapetik pou yon sèten maladi bezwen plis verifye nan anviwònman klinik la.

5. Konklizyon

Etid la prezan demontre ke fisetin atténue ogmantasyon yo nanenflamatwajèn (MCP-1, IL-1b, ak iNOS), pwodiksyon NO, ak fosforilasyon MAPK, uPA, uPAR, ak MMPs, pwovoke LPS nan makrofaj yo. Rezilta sa yo sigjere ke fisetin ka yon ajan terapetik pou plizyè maladi ki gen rapò ak macrophage.