Gossypitrin, yon flavonoid ki fèt natirèlman, diminye domaj newòn ak mitokondriyo ki soti nan fè pati 3.

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

4. Materyèl ak Metòd 4.1.Reyaktif

Tout reyaktif yo te jwenn nan Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA). Solisyon Stock nan Gos yo te prepare nan DMSO epi ajoute nan kilti selil yo oswa preparasyon mitokondriyo nan 1/1000 (o/o) dilution.

Tanpri klike la a pou w konnen plis

4.2.Plant Materyèl

Materyèl plant (flè) ki soti nan Talipariti elatum (Sw.)(Syn. Hisbiscus elatus Sw.)(Malvaceae) yo te kolekte pandan mwa mas 2020 nan zòn ki antoure Sant pou Rechèch ak Evalyasyon Byolojik, Enstiti famasetik ak syans manje, La Lisa. , Lahavàn, Kiba. Yo te otantifye pa espesyalis nan herbaria nan University of Camagüey "Ignacio Agramonte Loynaz", kote espesimèn bon yo te depoze: G. Pardo., HPC-12 520 (HIPC).

Cistanche ka amelyore iminite

4.3. Ekstrè ak preparasyon echantiyon

LaetanolikEkstrè yo te prepare nan flè wouj Telatum jan yo te rapòte deja [29]. Apre rotoevaporasyon, solid yo te pirifye pa pwosedi re-kristalizasyon [29]. Konpoze izole yo te karakterize pa mwayen 1D 'H (400 MHz) ak 13C (100 MHz) NMR. Pwosesis done NMR yo te fèt ak vèsyon lojisyèl MestReNova 6.1.0-6224 pou Windows (Materyèl Siplemantè, Figi S1-S3). Done NMR yo kolekte nan Gos yo te konpare ak rezilta anvan yo [56].

4.4. UV/Vis ak IR Spectroscopic Etid

Spectre UV/Vis yo te fèt nan kuvèt kwatz ki gen 10 mm longè chemen optik epi yo te anrejistre absorbans nan yon UV-Vis.espektrofotomètrUltrospec 2100 Pro soti nan Amersham BioSci (Little Chalfont, UK) makonnen ak yon òdinatè ak Wave Scan Software (SWIFT I, 1.2) nan tanperati chanm. Entèraksyon ki genyen ant Gos ak iyon fer yo te mezire pa kontwole chanjman ki fèt nan spectre UV/Vis la. Yo te itilize metòd Job pou detèmine rapò esteyyometrik ant Gos ak ion Fe(II). Solisyon stock Gos ak Fe(lI) yo te prepare chak jou nan metanol ak tanpon fosfat, respektivman. Yo te anrejistre spectre IR yo sou yon espektwomèt JASCO FI/IR-440 sou ranje 4000-400 cm-I, lè l sèvi avèk granules bromur potasyòm pou prepare echantiyon yo.

4.5. Kilti selil yo

SouritipokanpSelil HT-22 (ATCC) yo te kiltive nan yon mwayen DMEM ki te konplete ak 10 pousan FCS, L-glutamin (1 mM), ak penisilin/streptomycin (1 pousan), epi yo te kenbe a 37 degre nan yon imidite 5 pousan CO2. enkibatè. Selil yo (2 × 104 selil/pi) yo te simen nan 96-plak byen（Nunc, Roskilde, Denmark）, nan 200 μL nan mwayen kilti pou 24 èdtan nan 37C.

4.6.Induction nan selil Oxidaticoe domaj ak tretman ak Gos

Yo te teste aksyon neropwotektif Gos （0.001-100 μM） sou HT-22 pa mwayen ko-enkubasyon pou 24 èdtan ak Gos oswa Trolox（500 μM), FeCl2 （100μM） , ak sitrat (1 mM). Apre 24 èdtan, yo te retire supernatant selil la epi yo te mezire viabilite selil la pa [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolyom bromur] (MTT) tès kolorimetrik.

4.7. Selil Viabilite Essay

Apre tretman yo, selil yo (2 × 104) yo te enkube ak 10 uM MTT pou 3 èdtan nan 37C. Lè sa a, derive MTT ki gen koulè pal la fonn nan 50μL nan DMSO, epi yo te konte absòbe a nan 570 nm sou yon lektè microplate (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Almay). Viabilite selil yo eksprime kòm yon pousantaj kont kontwòl selil ki pa trete yo.

4.8.Essay potansyèl manbràn mitokondriyo (△Y) nan selil HT-22

Mitokondriyopotansyèl manbràn te evalye sou baz retansyon selil fliyoresan cationic sond rhodamine 123 [57,58]. Apre 2 èdtan blesi fè/ascorbate nan absans （kontwòl） oswa prezans Gos （0.001-100 μM） oswa Trolox（500 μM), selil newòn yo （2 ×10*) yo te enkube 10 minit ak 1 μM rhodamine 123. Apre santrifujasyon, ak re-sispansyon nan 1 mL 0.1 pousan Triton X-100, yo te detèmine konsantrasyon ankèt la nan surnatant la lè l sèvi avèk yon lektè microplate (FLUOstar Omega, BMG). LABTECH, Ortenberg, Almay) nan pè eksitasyon/emisyon 505/535 nm. Done yo eksprime kòm pousantaj kont Kontwòl selil ki pa trete yo.

4.9.ATP esè

ATP selilè te detèmine pa sistèm tès luciferin/luciferase [59] nan menm kondisyon ak AY. Bioluminesans te mezire ak yon twous tès Sigma-Aldrich dapre enstriksyon manifakti a, lè l sèvi avèk opsyon nan luminesans nan lektè a mikroplak (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Almay).

4.10.Bèt

Rat Wistar Gason (200 g) yo te jwenn nan Sant pou Pwodiksyon Bèt Laboratwa (CENPALAB dapre akwonim Panyòl li yo, Lahavàn, Kiba) epi yo te loje nan etablisman swen bèt la pou 1 semèn anvan eksperyans nan yon tanperati- anviwònman kontwole (22-24 degre ), ak yon sik limyè/fè nwa 12-h ak aksè a manje ak dlo ad libitum.

4.11.Izolasyon mitokondriyo

Yo te izole mitokondri forèvan rat pa santrifujasyon diferans jan sa dekri deja [60]. Digitonin 10 pousan, te itilize pou deranje synaptosomes ak bay yon melanj de mitokondri ki pa synaptozomal plis synaptosome. Tout pwosedi a te fèt nan 4 degre. Rapò kontwòl respiratwa a (eta 3/eta 4 to respiratwa) te toujou nan ranje 4.5 a 6.0, mezire lè l sèvi avèk 5 mM succinate kòm substra a.

4.12. Kontinyèl-Siveyans Mitokondriyo Assays

Yo te detèmine potansyèl manbràn mitokondriyo a spectrofluorimetrically lè l sèvi avèk 10 μM safranine O kòm yon sond 【58,61】 nan yon lektè microplate （FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Almay) nan 495/586 nm eksitasyon / longèdonn emisyon; tès sa yo te fèt nan prezans EGTA 0.1 mM ak 2 mM K, HPOA. Yo te estime anfle mitokondriyo spectrophotometrically soti nan diminisyon nan absòbe aparan nan 540 nm. Pou tès yo, mitokondri yo te kouran ak 5 mM succinate potasyòm (plis 2.5 uM rotenone) nan yon mwayen estanda ki gen ladan 125 mM sikwoz, 65 mM KC, ak 10 mM HEPES-KOH, pH 7.4, nan 30 degre.

4.13.Essay peroksidasyon lipid

Peroksidasyon lipid te estime nan jenerasyon malondialdehyde (MDA) [28,62]. Mitokondri (1 mg/mL) yo te ekspoze a 4 mM tert-butylhydroperoxide oswa 50uM Fe (II) plis 1 mM sitrat sodyòm nan 37 degre C. Yo te kalkile konsantrasyon MDA lè l sèvi avèk koyefisyan disparisyon li yo (c =1. 56×105 M-1.cm-1).

4.14. Detèminasyon konsantrasyon Fe(II).

Konsantrasyon Fe(ⅡI) te detèmine nan 10 mM tanpon fosfat pH 6.5 (2 mL) pa fòmasyon nan yon konplèks wouj ak 1,10-phenanthroline (5 mM), jan yo dekri deja [24,28].

4.15.Siveyans Konsomasyon Oksijèn

Konsomasyon O, ki gen rapò ak Fe(ⅡI) oksidasyon te mezire ak yon elektwòd Clark-type (Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, UK) nan yon chanm vè 1.3-ml ekipe ak yon brase mayetik, nan 30 degre. Pousantaj konsomasyon oksijèn (ROC) te eksprime kòm nmol O2/mL pou chak min.

4.16.2-Asal oksidasyon dezoksiriboz

Fòmasyon idwoksil ("OH) radikal yo te estime pa swiv degradasyon 2-desoksiriboz nan MDA, ki te kalkile apati koyefisyan disparisyon li yo (e=1.56 × 10 degre M-1·) cm-) jan yo te deja rapòte [26,27].

4.17. Gos-Fe(II) Deteksyon konplèks

Fe（ⅡI）（FeCl,0.4-1.6 μM) te ajoute nan 2 mL (10 mM) tanpon fosfat (pH 6.5) ki gen 2 mM sitrat ak 1.6 μM Gos. Yo te fè yon eskanè longèdonn soti nan 200-600 nm nan yon espektrofotomèt Hitachi 2001 (Hitachi, Tokyo), nan 28 degre.

4.18. Analiz estatistik

GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) yo te itilize. Analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk yon ANOVA yon sèl-fason, ki te swiv pa yon tès posthoc Student-Newman-Keuls pou konparezon ki gen bon konprann. Rezilta ak p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Materyèl Siplemantè: Sa ki annapre yo disponib sou Entènèt. Figi S1: lH-NMR (400 MHz) spectre nan gossypitrin nan DMSO-fè, Figi S2: 13C-NMR (101 MHz) spectre nan gossypitrin nan DMSO-d, Figi S3: HSQCspectre nan gossypitrin nan DMSO-dg. Tablo S1:'H (400 MHz) ak 13C (100 MHz) done gossypitrin kont rapò anvan an.

Kontribisyon otè:Konsepyalizasyon, G.LP.-A.; metodoloji, MAB-V., RFD, YM-P.ak GLP-A.; validation, MAB-V., JM-P., YM-P, ak RFD; analiz fòmèl, YM-P, JM-P, RF-A. ak GLP-A.; ankèt, MAB-V, AA-L., DA-A., YM-P., RFDand GLP-A.; Done curation, MAB-V.YM.-PJM-P.and RF-A.; ekri—preparasyon bouyon orijinal, MAB-V.; ekri—revizyon ak koreksyon, IM.-P, RF-A., YM-P ak GLP-A.; vizyalizasyon, YM-P., ak GLP-A.; sipèvizyon, GLP-A.; akizisyon finansman, GLP-A.Tout otè yo te li ak dakò ak vèsyon ki te pibliye maniskri a.

Finansman: Rechèch sa a te finanse pa VLIR (Bèljik); nimewo sibvansyon CU2018TEA457A103, ak pa Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Kiba); nimewo sibvansyon PN223LH010-035. APC a te finanse pa VLIR (Bèljik); nimewo sibvansyon CU2018TEA457A103.

Deklarasyon Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl:Etid la te fèt dapre direktiv yo nan Deklarasyon èlenki a, ak apwouve pa Komite Etik Enstitisyonèl la nan Enstiti famasetik ak syans manje, Inivèsite Lahavàn, Kiba (Kod Pwotokòl IFAL-CEI 087-2019, Oktòb 2019) .

Deklarasyon Konsantman Enfòme: Pa aplikab. Deklarasyon Disponibilite Done: Pa aplikab.

Rekonesans:Travay sa a te sipòte pasyèlman pa Vlaamse Interuniversitaire Raad (VLIR)-Bèljik/Ministerio de Educacion Superior (MES)-Kuba Pwojè CU2018TEA457A103, ki te kouvri tou frè pwosesis atik yo, ak pa pwojè PN223LH010-035 nan "Ministerio de". Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Kiba), Programa de Ciencias Basicas y Naturales". Konfli enterè: Otè yo pa deklare okenn konfli enterè.

Egzanp Disponibilite: Egzanp konpoze yo disponib nan men otè ki koresponn lan.