Imèn Alpha Defensin 5 Ekspresyon nan ren imen an ak aparèy urin

Pou plis enfòmasyon: ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer et al

Résumé

Background:Mekanis yo ki kenbe esterilite nan aparèy urin yo enkonplètman konprann. Etid resan yo te enplike enpòtans ki genyen nan peptides antimikwòb (AMP) nan pwoteje aparèy la urin kont enfeksyon. Isit la, nou karakterize ekspresyon ak enpòtans AMP imen alfa-defensin 5 (HD5) nan imen an.renak aparèy urin nan matyè nòmal ak enfekte.

Metodoloji/Rezilta prensipal yo:Sèvi ak RNA izole nan mounren, urèt, ak tisi nan blad pipi, nou te fè PCR quantitative an tan reyèl pou montre ke DEFA5, jèn ki kode HD5 la, se konstititivman eksprime nan tout aparèy urin lan. Avèk pyelonefrit, ekspresyon DEFA5 siyifikativman ogmante nanren. Sèvi ak analiz immunoblot, HD5production ogmante tou ak pyelonefrit. Immunostaining lokalize HD5 nan urotelyòm nan blad pipi a ak urèt. Nan ren an, HD5 te pwodui prensipalman nan nefwon distal la ak tubul kolekte. Lè l sèvi avèk immunoblot ak tès ELISA, HD5 pa te regilyèman detekte nan echantiyon pipi imen ki pa enfekte pandan y ap sa vle di pwodiksyon HD5 urin ogmante ak enfeksyon nan aparèy urin E.coli.

Konklizyon/Siyifikasyon:DEFA5 eksprime nan tout aparèy urin nan sijè ki pa enfekte. Espesyalman, HD5 eksprime nan tout urotelyòm nan aparèy urin ki pi ba yo ak nan tib kolekte yo nanren. Ak enfeksyon, HD5 ekspresyon ogmante nanren, ak nivo vin detekte nan pipi a. Dapre konesans nou, rezilta nou yo reprezante premye a ki kantite HD5 ekspresyon ak pwodiksyon nan ren imen an. Anplis, sa a se premye rapò ki detekte prezans HD5 nan echantiyon pipi ki enfekte. Rezilta nou yo sijere ke HD5 ka gen yon wòl enpòtan nan kenbe esterilite aparèy urin.

Cistanche efè segondè ak Cistanche tubulosa pourenmaladi, klike isit la pou jwenn echantiyon an

Entwodiksyon

Aparèy pipi a, apa de meatus uretral la, anjeneral esteril malgre pwoksimite li ak flora fekal. Mekanis egzak kote aparèy urin kenbe esterilite li yo pa byen konprann. Mekanis pwopoze pou kontribiye nan defans aparèy urin yo enkli koule pipi, chanjman nan pH pipi ak osmolarite, vid regilye nan blad pipi, konpozan defans chimik nan uroepithelium a, ak koule epitelyal / aflu nan selil iminitè efèktè ak eksitasyon bakteri [1]. Anplis de sa, peptides antimikwòb yo (AMP) dènyèman te montre yo gen yon wòl enpòtan nan kenbe esterilite aparèy urin [2].AMPs, ki sèvi kòm antibyotik natirèl ki pwodui pa prèske tout òganis, se yon eleman omniprésente nan sistèm iminitè natirèl la. AMP yo se molekil kasyonik ki eksprime pa selil blan fagositik ak selil epitelyal yo. Nan imen ak lòt mamifè, defensin yo se yon gwo fanmi AMP. Defensin yo anjeneral gen aktivite antimikwòb laj kont bakteri gram-pozitif ak gram-negatif, viris, fongis, ak pwotozoa [2,3]. Defensin yo okòmansman sentèz kòm preproprotein epi sibi pwosesis yo vin matirite, peptides biyolojik aktif [4]. Nan imen, defensin yo klase nan youn nan de fanmi depann sou modèl pon disulfide yo - alfa-defensin yo oswa beta-defensin yo [5].

Nan aparèy urin yo, beta-defensin yo eksprime lajman atravè uroepitelyom la. Selil epitelyal ki kouvri yorenbouk nan Henle, tib distal, ak kanal kolekte constitutively eksprime beta-defensin imen 1 (hBD1). Malgre ke nivo urin nan hBD1 yo ensifizan pou touye bakteri anvayi, hBD1 bay yon kouch antimikwòb rapid nan lumèn tubulèr ak anpeche enfeksyon nan anpeche atachman bakteri nan urothelium la [6]. Etid resan yo endike ke eta redox nan hBD1 siyifikativman afekte pisans antimikwòb, konsa ke peptide redwi a pi pisan pase fòm oksidize disulfide ki lye a [7]. Siyifikasyon sa a nan sifas urothelial la pa te detèmine. Yon lòt defensin, moun beta-defensin 2 (hBD2) pa konstititivman eksprime nan tisi ren ki an sante; sepandan, ekspresyon hBD2 pwovoke pa enfeksyon [8].

Kontrèman ak beta-defensins yo, wòl alfa-defensin epitelyal ki sòti pa byen dekri nan aparèy urin la. Ekspresyon ak fonksyon alfa-defensin HD5 ak HD6 yo te rapòte sitou nan ti trip la kote Panethcells yo sekrete yo nan kript entesten yo epi kontribye nan balans microbiota entesten [9]. HD5 te lokalize tou nan aparèy jenital gason ak fi, ak prèv ki sijere ke li se inducible ak enpòtan nan eradike enfeksyon [10,11,12]. Pipi HD5 yo te detekte nan pasyan ki te sibi rekonstriksyon neobladder ileal ak devyasyon urin kondit ileal kote sous pwodiksyon HD5 te prensipalman kredite nan selil Paneth ileal yo [13,14]. HD5 gen aktivite anti-bakteri kont bakteri gram-pozitif uropathogenic komen ak bakteri gram-negatif [15]. HD5 tou gen aktivite antimikwòb kont viris uropathogenic tankou adenovirus ak viris BK [16,17,18]. Nan etid sa a, nou bay deskripsyon inisyal la ak quantification nan ekspresyon HD5 nan imen anrenak plis defini ekspresyon li nan pi ba aparèy urin pandan esterilite ak enfeksyon.

Rezilta yo

DEFA5 mRNA se konstititivman eksprime nan blad pipi imen an, urèt, ak ren

Quantitative PCR an tan reyèl demontre ke tout teste nan blad pipi, urèt, akrenespesimèn san enfeksyon konstititivman eksprime DEFA5. Ekspresyon DEFA5 te siyifikativman pi gwo nan aparèy urin ki pi ba pase aparèy urin anwo a (p= 0.014). Nan blad pipi a (n=4), ekspresyon DEFA5 vle di te 4,656637 transkripsyon pou chak 10 ng RNA ak nan urèt (n=4) ekspresyon DEFA5 vle di te 4,1126170 transkripsyon pou chak 10 ngRNA (Figi 1A) . Nan ren an (n=6), ekspresyon DEFA5 an mwayèn te 2,9376274 transkripsyon pou chak 10 ng RNA. Ekspresyon DEFA5 yo te analize separeman nan cortical ren, medul, ak basen. Ekspresyon DEFA5 pa t varye anpil pa rejyon ren (p= 0.45).

Ekspresyon DEFA5 ak ekspresyon peptide HD5 ogmante ak pyelonefrit

Kantite analiz PCR an tan reyèl fèt soutisi ren akpyelonefrit demontre yon ogmantasyon siyifikatif nan ekspresyon DEFA5 konpare ak tisi ren ki pa enfekte. Avèk piyelonefrit (n= 6), ekspresyon DEFA5 vle di ogmante a 7,82961,052 transkripsyon pou chak 10 ng RNA (p= 0.019) (Figi 2A).

Pou plis evalye ogmantasyon sa a nan ekspresyon ak pyelone-frit, nou te fè analiz imunoblot sou menm bagay la.rentisi yo itilize pou analiz PCR an tan reyèl pou evalye ogmantasyon konkouran nan pwodiksyon peptide HD5 (Figi 2B, panèl mitan).Analiz imunoblot, lè l sèvi avèk antisera poliklonal HD5, te demontre siyifikativman pi gwo pwodiksyon peptide HD5 nan tisi ren ak pyelonefrit (n {{5} }) konpare ak ki pa enfekterentisi (n=6). Ki pa enfekterentisi eksprime 300625 ng HD5/gram pwa tisi mouye pandan y aprentisi ak pyelonefrit eksprime 600621 ng HD5/gram pwa tisi mouye (p,0.0001). Yo te re-sonde blots ak GAPDH pou sèvi kòm yon kontwòl chaj (Figi 2B, panèl mitan) epi yo te fè yon tach ajan tou pou konfime chaj pwoteyin egal (Figi 2B, panèl tèt).

HD5 peptide pwodui nan tout ren imen an ak aparèy urin

Immunostaining te fèt pou lokalize pwodiksyon HD5 nan aparèy urin. Immunohistochemistry (IHC) te montre ke HD5immunoreaktivite te prezan nan tout urothelium nan urèt la ak nan blad pipi nan tout espesimèn envestige (n=4, Figi 3).IHC te montre tou ke HD5 te pwodwi nan tubul nan cortical ren ak medul espesimèn (n= 6, Figi 4). Imunofluoresans (IF) te demontre ke ekspresyon HD5 te pi gran nan nephron distal la ak tubul kolekte yo (Figi 5). Entèstisyòm ak glomeruli pa t montre iminoreaktivite HD5. Imunostaining yo montre nan Figi 3, 4, ak 5 yo te fèt lè l sèvi avèk yon antikò monoklonal sourit anti-HD5 (8C8) ki rekonèt propeptide HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Rezilta yo te menm jan an lè w ap itilize antikò poliklonal lapen anti-HD5 ki rekonèt propeptide HD5 ak peptide ki gen matirite (done yo pa montre) - sijere ke HD5 estoke kòm yon propeptide.

Avèk pyelonefrit, imunostaining HD5 ogmante ansibleman. Iminoreaktivite HD5 ogmante nan tout nefwon proximal la, nephron distal la, ak tubul kolekte yo (Figi 4 ak Figi 5). Menm jan ak espesimèn ki pa enfekte, glomeruli ak entèrstisyòm pa te montre okenn ekspresyon HD5 ak enfeksyon. Kontwòl negatif yo pa montre okenn iminoreaktivite HD5.

Pipi moun ki enfekte gen konsantrasyon mezirab nan peptide HD5

Analiz imunoblot, lè l sèvi avèk antiserum poliklonal lapen ki detekte precurseur proHD5 ak fòm trete plis idantifye nivo mezirab HD5 nan 13 nan 15 echantiyon pipi teste ki enfekte ak E.coli uropathogenic (Figi 6A ak B). Lè prezan, nivo HD5, nòmalize nan kreyatinin pipi, te varye ant 299.8-669.7630 ng HD5/mg pipi Cr (110.67 ng/mL-276.67 ng/mL), ki koresponn ak 11.10-27.67 nmol/L. Echantiyon pipi ki pa enfekte (n=15), HD5 te nan oswa anba limit deteksyon (,50 ng). Anzim-lye immunosorbent assay (ELISA) sou menm echantiyon pipi yo, lè l sèvi avèk antikò monoklonal sourit (8C8) ki detekte sèlman precurseur proHD5 la, detekte nivo mezirab proHD5 nan 13 nan 15 echantiyon ki enfekte yo teste. Konsantrasyon proHD5 nan pipi te varye ant 122.78-490.060.03 ng HD5/mg pipi Cr (30.02 ng/mL-200.5 ng/mL) lè prezan (Figi 7).

Diskisyon

Nan etid sa a, nou bay premye karakterizasyon HD5 nan imen anren, urèt, ak nan blad pipi. HD5 yo te montre yo dwe yon AMP enpòtan ki anpeche enfeksyon anvayisan nan trip la epi li se moute-reglemante nan aparèy jenital la pandan enfeksyon [11,18,19,20,21]. AMPs epithelial ki sòti, tankou HD5, yo te montre yo enpòtan nan kenbe esterilite nan aparèy la urin [8,22,23,24]. Defisyans nan defans mukozal natirèl sa yo ka lakòz enfeksyon egi ak / oswa kwonik [25,26].

Rezilta PCR quantitative an tan reyèl nou yo demontre ke DEFA5 se yon fason konstititif eksprime nan imen anren, urèt, ak blad pipi. Ekspresyon DEFA5 ogmante soti nan aparèy urin anwo a nan aparèy urin ki pi ba a - apre koule nan kouran pipi a ak pwoksimite ogmante nan pwen envazyon mikrobiota a. Dapre nou konnen, sa a se premye etid ki kantite ekspresyon DEFA5 nan ren ak nan blad pipi imen an. Dènyèman, Townes et al te demontre ke nòmal urèt distal ka eksprime DEFA5 [14]. Rezilta nou yo tou sijere ke DEFA5 se konstititivman eksprime pa urete a distal. Malgre ke ekspresyon DEFA5 nan aparèy urin nan prèske 100-pliye pi ba pase sa yo jwenn nan tisi gastwoentestinal, ekspresyon debaz uroepitelial DEFA5 konparab ak ekspresyon de amps urin ki dekri deja tankou cathelicidin, hBD-1, hBD. -2, ak ribonukleaz 7 [6,8,22,24,27].

Kontrèman ak aparèy gastwoentestinal ki gen matirite kote DEFA5 eksprime nan nivo segondè nan tou de eta sante ak enfeksyon/enflamasyon, done PCR quantitative an tan reyèl nou an demontre ke ekspresyon DEFA5 nanrense siyifikativman moute-reglemante ak enfeksyon [27,28,29]. Modèl ekspresyon inductible sa a se analogue ak ekspresyon DEFA5 nan aparèy repwodiktif fi kote ekspresyon DEFA5 ogmante ak salpingit [30]. Nan aparèy urin, Townes et al te montre yon tandans nan direksyon pi gwo ekspresyon ureteral nan DEFA5 nan pasyan ki gen UTIs ki te sibi kondit ileal divèsyon urin [14]

Analiz imunoblot nou an konplete done PCR an tan reyèl lè li montre ke pwodiksyon peptide HD5 ogmante ak pyelonefrit. Modèl inductible nan pwodiksyon HD5 sa a sanble ak sa yo wè nan kèk manm nan fanmi an beta-defensin.hBD2 montre yon modèl inducible nan pwodiksyon ak enfeksyon nan aparèy la urin ak / oswa pyelonefrit kwonik [8,31,32]. Yo montre pwodiksyon HD5peptide ogmante nan aparèy jenital siperyè fi ak urèt gason ak enflamasyon [11,30].

Sèvi ak imunostaining, nou demontre ke HD5 se pwodwi inifòm nan tout urothelium nan urèt la ak nan blad pipi. Paske vas majorite nan UTI yo soti nan flora fekal ki monte nan blad pipi a, rezilta sa yo sijere ke ekspresyon HD5 prezan nan kote kote ekspoze mikwòb rive pi souvan [33]. Se poutèt sa, HD5 se depreferans pozisyone yo anpeche yon monte enfeksyon mikwòb. Nanren, HD5 se sitou pwodui nan nefwon distal la ak tubul kolekte. Konklizyon sa yo sijere ke HD5 pwodui nan kote li pral pozisyone pou gen pi bon aktivite antimikwòb. Etid anvan yo te montre ke pwopriyete antimikwòb defensin yo depann sou konsantrasyon sèl - ak pi wo konsantrasyon sèl diminye aktivite antimikwòb [23,34,35]. Nou espekile ke konsantrasyon sèl ki ba nan nefwon distal la ak tubul kolekte bay yon milye favorab pou aktivite antimikwòb HD5.

Immunoblot ak ELISA analiz tou demontre ke HD5 sekrete nan pipi a nan nivo ki ba. Etandone gwosè a (8.1 kDa ak 3.7 kDa) ak chaj pozitif nan proHD5 ak konplètman trete HD5, li posib ke kèk peptide HD5 urin soti, omwen an pati, nan filtrate plasma. Men, gen ti prèv ki sijere ke HD5 pèsiste nan plasma a [27]. Anplis de sa, pou parèt nan pipi a, HD5 ta bezwen chape efikas mekanis absòpsyon peptide nan tubul proximal la [6,36]. Finalman, echantiyon pipi yo te itilize yo te sibi santrifijasyon anvan tès yo te fèt, retire sous selilè HD5.

Nan konsantrasyon yo detekte, pipi HD5 pa gen anpil chans yo dwe dirèkteman antimikwòb kont mikwo-òganis uropathogenic kòm konplètman trete HD5 gen yon konsantrasyon minim inhibitory (MIC) ant 6-10 mg / mL kont komen bakteri gram-negatif uropatho jenik [15]. Sepandan, konsantrasyon sifas mikoz yo gen anpil chans pou yo pi wo. Anplis de sa, analiz immunoblot demontre ke konsantrasyon HD5 yo siyifikativman pi gwo nan laren. Rezilta sa yo sijere ke HD5 patisipe nan defans mukozal nan aparèy urin. Gen yon modèl analogue wè ak hBD1, kote konsantrasyon urin nan hBD1 yo ensifizan pou montre aktivite antimikwòb men pi wo konsantrasyon peptide yo detekte tou pre tubul ren yo [6,31].

Paske IHC demontre ke proHD5 se yon gwo fòm HD5 nanrenepi paske tou de matirite ak proHD5 yo detekte nan pipi a, nou espekile ke HD5 se prensipalman sekrete yon molekil précurseur ak Lè sa a, sibi pwosesis pwoteolitik jenere fòm matirite - menm jan ak aparèy gastwoentestinal ak jenitourinè [11,30,37]. Nan ti trip la, selil Paneth yo pwodui tripsin, ki fende pwopeptid HD5 pou ke peptide konplètman trete a se fòm prensipal nan lumèn nan entesten [37]. Nan urèt gason an, kle pwosesis ak aktive anzim pou HD5 se netrofil proteaz kontribye pa netrofil rekrite nan sit la nan enfeksyon [11]. Kontribisyon trypsinogen epitelyal, tripsin urin, ak / oswa proteaz netrofil sou pwosesis HD5 nan aparèy urin pandan enfeksyon an rete pou detèmine. Anplis, efè chanjman nan anviwònman urin sou fonksyon HD5 (chanjman nan osmolarite, pH, ak konsantrasyon kasyonik) tou rete yo dwe detèmine.

An konklizyon, sa a se premye etid pou idantifye ak kantite ekspresyon ak pwodiksyon HD5 nan aparèy urin. Rezilta nou yo sijere ke HD5 se yon AMP epithelial ki sòti ki ka jwe yon wòl enpòtan nan iminite natirèl uroepithe lium imen an anpeche translokasyon anvayi patojèn nan sikilasyon an. Eksplikasyon sou faktè ki kontwole pwodiksyon HD5 ka bay nouvo insight sou patojenèz UTIs nan pasyan ki gen risk pou UTI ak pasyan ki gen enfeksyon kwonik.

Metòd

Apwobasyon etid

Yo te jwenn konsantman ekri nan men tout pasyan k ap patisipe nan etid sa a. Pou matyè ki gen mwens pase 18 an, yo te jwenn konsantman paran/gadyen alekri. Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl NationwideChildren's Hospital (NCH) te apwouve etid sa a ansanm ak pwosesis konsantman ak dokiman yo (IRB07-00383).

Tisi imen ak echantiyon pipi

Ureteral distal ki pa enfekte ak tisi nan blad pipi (n= 4) yo te jwenn nan men timoun ki sibi re-enplantasyon ureteral pou rezon lòt pase enfeksyon renouvlab. Ki pa enfekterenechantiyon (n=6) yo te jwenn nan pasyan ki sibi nefrektomi pou timè ren yo. Echantiyon tisi yo te gratis nan siy makwoskopik maladi oswa enflamasyon.rentisi ki soti nan pasyan ki gen pyelonefrit kwonik te bay pa Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. De patolojis endepandan konfime dyagnostik istopatolojik pyelonefrit la. Echantiyon tisi yo te jele oswa konsève kòm seksyon net nan fòmalin ki fikse nan parafine. Seksyon tisi ren ki pa enfekte yo te diseke nan cortical, medul, oswa basen ren anvan yo estoke (n=4).

Yo te jwenn echantiyon pipi ki pa enfekte ak ki pa enfekte nan men timoun k ap prezante nan depatman ijans NCH oswa nan klinik thenephrology. Te fè dyagnostik la nan yon UTI pa yon kilti pipi pozitif dapre Akademi Ameriken pou Pedyatri Gid [39]. Tout echantiyon pipi ki enfekte te gen .106 CFU/mL ofE.coli. Valè pH pipi varye ant 5.5 ak 8.5 (pipi vle di 6.9). Konpozisyon iyonik urin pa te mezire. Echantiyon pipi yo te santrifuje pou retire sediman pipi, epi yo te ajoute bwason inhibitor proteaz (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Izolasyon asid ribonukleik ak ranvèse transcription

Total RNA te izole nan tisi jele lè l sèvi avèk PromegaTotal RNA Isolation System (Promega, Madison, WI, USA). Sentèz ForcDNA, 4-8 mg total de RNA yo te ranvèse transkripsyon akSuperscript III ranvèse transkriptaz lè l sèvi avèk yon oligo-(dT)12-18primer dapre pwotokòl founisè a (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Klonaj nan Plasmid Espesifik Gene pou Koub Creole

Yo te klonaj cDNA ki kode DEFA5 ak GAPDH nan yon vektè plasmid 4-Topo (Invitrogen) dapre enstriksyon manifakti yo. Plasmid yo te sekans konfime ke kòrèk la

konstriksyon yo te jwenn. Dilusyon seri nan plasmid jèn espesifik yo te quantitated (pa absorpsyon espektrofotometrik nan 260 ak etidium bromur-tache agarose jèl elektwoforèz) epi yo te itilize nan PCR an tan reyèl jenere koub estanda pou chak reyaksyon.

Quantitative PCR an tan reyèl

Yo te fè PCR an tan reyèl lè l sèvi avèk cDNA yon sèl-cheche soti nan imenren, urèt, ak tisi nan blad pipi ak pè jadendanfan oligonukleotid espesifik lè l sèvi avèk 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) .PCR exon junction spanning primes yo te fèt ak sekans yo te konfime lè l sèvi avèk DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (DEFA5 forward primer primè). : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 ak DEFA5 reverse primary 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).

Yon ti tan, cDNA ki koresponn ak 10 ng RNA te sèvi kòm modèl nan yon reyaksyon 25 ml ki genyen 2.0 mM nan chak primè ak 16 melanj Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green. Kondisyon PCR yo te: inisyal denaturasyon nan 95uC pou 10 minit, ki te swiv pa 40 sik ak chak sik ki gen ladann denaturasyon nan 94uC pou 30 segonn, annealing nan 64uC pou 30 segonn, ak ekstansyon nan 72uC pou 30 segonn. Emisyon fluoresans sik-a-sik te kontwole nan 530 nm ak analize lè l sèvi avèk 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Estanda plasmid espesifik yo te enkli ak chak seri reyaksyon. Kòm yon kontwòl pozitif, tèminal ileum RNA te enkli ak chak seri reyaksyon, ak rezilta yo te konpare ak estanda deja pibliye [27].

Pou konfime anplifikasyon PCR nan pwodwi a gen entansyon, yo te analize echantiyon reprezantatif pa elektwoforèz sou yon jèl agarose 1.5 pousan. Pwodwi yo te vizyalize pa bromidestaining etidyòm ak konpare ak estanda gwosè ADN ak gwosè pwodwi konfime (pa montre). Anplis de sa, yo te detèmine yon koub pwofil tanperati k ap fonn nan chak reyaksyon PCR nan fen chak reyaksyon.

Antikò HD5

Propeptide HD5 (AA20-94) ak fòm ki pasyèlman trete (AA36-94 ak 56–94) yo te idantifye lè l sèvi avèk yon antikò monoklonal sourit (8C8) anti-HD5 (Abcam). peptide ki gen matirite (AA63-94) yo te idantifye lè l sèvi avèk antiserum poliklonal lapen ki te dekri deja [13,40].

Imunoblot

Seksyon nan menm bagay larenespesimèn yo itilize pou analiz PCR quantitative an tan reyèl (3-6 mg pwa mouye) yo te pulverize lè l sèvi avèk yon mòtye ak pilon nan nitwojèn likid epi yo fonn nan tanpon RIPA ak inibitè pwoteaz. Pwoteyin urin yo te ekstrè soti nan echantiyon pipi lè l sèvi avèk ProteospinTM Pwoteyin Pwoteyin Mikwo Twous (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Kanada). Konsantrasyon pwoteyin ren ak pipi yo te mezire lè l sèvi avèk yon esè Bradford modifye epi yo te konfime lè l sèvi avèk yon lekti anOD280 nm. Konsantrasyon egal nan tisi ren oswa pwoteyin urin yo te chaje sou 18 pousan jèl gradyan sodyòm dodecyl sulfat epi yo te sibi elektwoforèz. Pou asire chaje egal pwoteyin, yo te fè yon tach ajan.

Apre separasyon elektwoforetik, pwoteyin yo te transfere sou yon manbràn nitrocellulose. Apre yo fin fikse ak 0.05 pousan glutaraldehyde nan TBS, manbràn yo te bloke nan 5 pousan lèt san grès pou 30 a 60 minit epi yo te enkube nan yon dilution 1:1,000 nan antiserom poliklonal HD5 lapen lannwit lan. . Apre lave, antikò segondè a, yon anti-lapen refor peroksidaz-konjige anti-lapen IgG dilye 1:10, 000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), te aplike pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Immunoblots soti nanrentisi yo te tou sonde ak anti-GAPDH antikò (Sigma Aldrich) pou de zè de tan nan tanperati chanm ak Lè sa a, enkube ak antikò segondè ki dekri pi wo a. Pwoteyin yo te vizyalize lè l sèvi avèk yon sistèm deteksyon ECL ak fim chemiluminescence dapre enstriksyon manifakti a (BioExpress, Kaysville, UT, USA).

HD5 te quantitated pa konpare entansite gwoup ki kapab lakòz ak yon seri dilution nan recombinant estanda pwoteyin proHD5 (Peptides International, Louisville, KY, USA).renHD5concentrations yo te estandadize nan pwa tisi mouye. Konsantrasyon UrinaryHD 5 yo te divize pa kreyatinin pipi pou etabli rapò estanda pipi HD5-a-kreyatinin (mg/mg) pou rann kont dilution pipi. Konsantrasyon kreyatinin pipi yo te detèmine lè l sèvi avèk Oxford Biomedical Research kreatinin mikroplak tès (Rochester Hills, Michigan, USA).

Imunohistochimi

Apre deparafinizasyon, reyidratasyon, ak rekipere antijèn, yo te fè yon blòk biotin ak yon blòk pwoteyin san serom (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Glisad yo te enkube lannwit lan nan 4uC ak monoklonal sourit HD5 (8C8) antikò (1:2{{10}}0; Abcam) oswa lapen poliklonal antiserum (1:500) ki te swiv pa anti-polyvalan antikò biotinylated adiltè. Streptavidin/HRP (laboratwa ScyTek). Seksyon yo te devlope lè l sèvi avèk 0.1 pousan diaminobenzidine tetrachloride ak 0.02 pousan oksijene idwojèn ak counterstained ak ematoksilin. Seksyon kontwòl negatif yo te enkube ak serom ki pa iminitè nan plas antikò HD5.

Iminofluoresans

Yo te fè imunofluorescence ki make doub pou ede lokalize ekspresyon HD5 nanren. Yo te make kanal koleksyon an doub pou selil prensipal yo ak antikò kabrit poliklonal anti-aquaporin-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41]. Bouk Henle te make doub ak antikò sourit poliklonal anti-uromodulin imen (Sigma-Aldrich) epi tibil proximal la te make doub ak akwaporin polyclonalantihuman kabrit -1 (Santa Cruz) [41,42]. Rhodamine bourik poliklonal anti-kabrit (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA), rodamin kabrit anti-sourit (JacksonImmunoResearch Laboratories), ak FITC bourik poliklonal anti-lapen (Santa Cruz) te sèvi kòm antikò segondè yo.

Tout seksyon yo te prepare jan sa endike anwo a. Yo te enkube ak yon melanj de antisera sourit kont HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulin (1:500), AQP-1 (1:400) chanm. tanperati pou 90 minit. Antikò segondè a te aplike pou 90 minit nan tanperati chanm ak seksyon yo te monte lè l sèvi avèk medya aliye ak DAPI. Serom ki pa iminitè yo te itilize kòm yon kontwòl negatif. Yo te egzamine glisad yo ak mikwoskòp aLeica DM4000B epi yo te fè foto dijital lè l sèvi avèk kamera/lojisyèl Spot RT (Enstriman dyagnostik, SterlingHeights, MI, USA).

ELISA

Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) antikò monoklonal sourit pou 2 èdtan nan tanperati chanm, streptavidin-cheval radi peroksidaz (Biolegend, San Diego CA, USA) te ajoute pou 30 minit. Apre enkubasyon ak solisyon substrate TMB pou 15 minit (Kem-En-Tec Diagnostics), reyaksyon an te sispann ak solisyon STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) epi li nan yon longèdonn 450 nm. Konsantrasyon HD5 ki soti nan tès ELISA yo te divize pa pipi kreyatinin pou etabli rapò estanda HD5-pou kreatinin (mg/mg) pou kont dilusyon pipi jan sa dekri pi wo a.

Referans

1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Konsèp aktyèl nan mekanis defans molekilè ki opere pandan enfeksyon nan aparèy urin. Jounal Ewopeyen an nan ankèt klinik 38 Suppl 2: 29-38.

2. Zasloff M (2007) Peptid antimikwòb, iminite natirèl, ak aparèy urin nòmalman esteril. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.

3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensin: peptides antimikwòb ak sitotoksik nan selil mamifè yo. Annu Rev Immunol 11: 105–128.

4. Valore EV, Ganz T (1992) Pwosesis post-tradiksyon defensin nan selil myeloid imen frelikè. San 79: 1538–1544.

5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Beta-defensin imen -1 ak alfa-defensin yo kode pa jèn adjasan: de fanmi peptide ki gen diferan topoloji disulfid pataje yon zansèt komen. Genomics 43: 316–320.

6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., et al. (1998) Beta-defensin imen -1: yon peptide antimikwòb nan tisi urojenital. J Clin Invest 101: 1633–1642.

7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M, et al. (2011) Rediksyon lyezon disulfid demaske aktivite antimikwòb ki pisan nan beta-defensin imen 1. Nature 469: 419-423.

8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, et al. (2002) Ekspresyon beta-defensin imen 1 ak 2 nan ren ki gen yon enfeksyon bakteri kwonik. BMC Infect Dis 2: 20.

9. Bevins CL (2006) Paneth selil defensins: kle molekil efèktè nan iminite natirèl. Tranzaksyon Sosyete byochimik 34: 263–266.

10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C, et al. (1998) Ekspresyon jèn, imunokalizasyon, ak sekresyon defensin imen -5 nan aparèy repwodiktif fi imen an. Am J Pathol 152: 1247–1258.

11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, et al. (2005) Des defensin diferan nan Neisseria gonorrhoeae ak Chlamydia trachomatis urethritis revele nouvo entèraksyon selil epitelyal-netrofil. Infect Immun 73: 4823–4833.

12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D, et al. (2003) Ekspresyon defensin antimikwòb nan aparèy repwodiktif gason rat, sourit, ak moun. Biyoloji repwodiksyon 68: 95-104.

13. Porter EM, Poles MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et al. (1998) Izolasyon defensin entesten imen soti nan pipi neobladder ileal. Lèt FEBS 434: 272–276.

14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Tolerans nan bakteriuria apre divètisman urin lye ak aktivite peptide antimikwòb. Uroloji 77: 509 e501–508.

15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Aktivite anto-bakteri ak mekanis alfa defensin 5 moun recombinant kont tansyon ki reziste nan klinik antibyotik. Afr J Microbiol Res 4: 626–633.

16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Epithelial defensins afekte enfeksyon adenoviral: enplikasyon pou terapi jèn adenovirus medyatè. Terapi jèn imen 10: 957–964.

17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Mekanis netralizasyon adenovirus pa Imèn alfa-defensin. Lame selilè ak mikwòb 3: 11–19.

18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K, et al. (2008) alpha-defensin imen an anpeche enfeksyon viris BK lè yo rasanble viriyon epi bloke lyezon nan selil lame yo. Jounal la nan chimi byolojik 283: 31125-31132.

19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF, et al. (2009) Etid sou iminite lokal nan enfeksyon nan aparèy jenital ki pi ba yo. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.

20. Quayle AJ (2002) Repons iminitè natirèl ak bonè nan defi patojèn nan aparèy jenital fi ak wòl esansyèl selil epitelyal yo. Journal of repwodiktif iminoloji 57: 61-79.