Ipèglisemi pwovoke iminite ki antrene nan makrofaj ak précurseurs yo epi li ankouraje ateroskleroz.

BIZON:

Risk kadyovaskilè nan dyabèt rete elve malgre terapi bese glikoz. Nou te ipotèz ke ipèglisemi pwovoke iminite ki antrene nan makrofaj, ankouraje karakteristik proatherogenic ki pèsistan.

Anplis de sa, nan divès kalite literati, nou te aprann tou ke yon plant ki rele Cistanche gen yon gwo efè sou amelyore iminite. Cistanche se yon medikaman tradisyonèl Chinwa ak yon pakèt fonksyon regilasyon iminitè. Liberasyon an nan faktè, amelyore fonksyon an nan ògàn iminitè, ak lòt fason yo amelyore iminite a nan kò imen an. Se poutèt sa, nan lavi chak jou, moun ka amelyore iminite yo lè yo manje Cistanche deserticola nan modération, pou anpeche ak trete divès maladi.

Klike sou pwodwi sipleman cistanche deserticola

METÒD:

Makwofaj ki sòti nan mwèl zo ki soti nan sourit kontwòl ak sourit ki gen dyabèt yo te grandi nan glikoz fizyolojik (5 mmol/L) epi yo te sibi sekans RNA (n=6), tès pou transposaz aksesib sekans kromatin (n=6 ), ak sekans iminopresipitasyon chromatin (n=6) pou detèminasyon iminite fòmasyon ipèglisemi-induit. Yo te itilize transplantasyon mwèl zo nan sourit ki gen (n=9) oswa san (n=6) dyabèt nan sourit (normoglisemi) Ldlr -/- pou evalye siyifikasyon fonksyonèl li an vivo. Yo te chèche prèv ki montre iminite fòmasyon ipèglisemi pwovoke nan selil mononukleè san periferik moun ki soti nan pasyan ki gen dyabèt (n=8) ​​konpare ak matyè kontwòl (n{=16) ak nan makrofaj plak ateroskleroz imen ki retire pa mikrodiseksyon lazè. .

REZILTA:

Nan makrofaj, gwo glikoz ekstraselilè ankouraje ekspresyon jèn proenflamatwa ak karakteristik fonksyonèl proatherogenic atravè mekanis ki depann de glikoliz. Makwofaj ki soti nan mwèl zo ki soti nan sourit dyabetik kenbe karakteristik sa yo, menm lè yo kiltive nan glikoz fizyolojik, ki endike iminite fòmasyon ipèglisemi-induit. Transplantasyon mwèl zo soti nan sourit dyabetik nan (normoglisemi) sourit Ldlr -/- ogmante ateroskleroz rasin aortik, ki konfime yon fòm ki gen rapò ak maladi ak pèsistan nan iminite natirèl ki fòme. Egzamen entegre pou chromatin transposaz aksesib, imunoprecipitation chromatin, ak analiz sekans RNA nan selil souch ematopoyetik ak makrofaj ki sòti nan mwèl zo revele yon efè priming proinflammatory nan dyabèt. Modèl la nan chromatin louvri enplike faktè transcription Runt ki gen rapò ak faktè transcription 1 (Runx1). Menm jan an tou, transkriptòm nan makrofaj plak ateroskleroz ak leukosit periferik nan pasyan ki gen dyabèt tip 2 yo te rich pou objektif Runx1, ki konsistan avèk yon wòl potansyèl nan maladi imen. Anpèchman farmakolojik Runx1 nan vitro inibit fenotip ki resevwa fòmasyon an.

KONKLIZYON:

Iminite fòmasyon ipèglisemi-induit ka eksplike poukisa vize glikoz ki wo pa efikas nan diminye risk makwovaskilè nan dyabèt epi sijere nouvo sib pou prevansyon maladi ak terapi.

Mo kle:

dyabèt melitus ◼ epigenetik ◼ glikoz ◼ enflamasyon ◼ makrofaj

Dyabèt asosye ak yon gwo risk pou ateroskleroz ak konplikasyon li yo, tankou enfaktis myokad.1 Ipèglisemi se yon karakteristik kadinal nan tou de dyabèt tip 1 ak tip 2, ak tretman yo te konsantre lajman sou bese glikoz nan san. Terapi entansif bese glikoz efikas nan bese risk vaskilè nan pasyan ki gen dyabèt tip 1, men efè a difere pou plizyè ane2 epi tanporèlman dekonekte nan kontwòl glikoz nan san.3 Nan dyabèt tip 2, rediksyon glikoz pa montre swa pa gen okenn efè oswa yon efè modès sou rezilta vaskilè ki gen rapò ak ateroskleroz tankou enfaktis myokad egi.4-6 Risk ki pèsistan pou konplikasyon kadyovaskilè, menm apre bese glikoz, yo te rele efè eritaj oswa memwa metabolik,4,7 men mekanis ki kache yo rete fènwa.

Ateroskleroz se yon maladi enflamatwa kwonik ki karakterize pa depo ak retansyon nan lipoprotein modifye ak akimilasyon selil iminitè nan mi yo nan gwo atè. Makwofaj yo se kle nan tout etap nan ateroskleroz epi yo lajman konsidere kòm sib terapetik. Macrophages yo te subtype nan fenotip opoze, sètadi proinflammatory (M1), an repons a Toll-like reseptè lipopolysaccharide (LPS) ak interferon- (IFN), oswa tisi reparasyon (M2), pou egzanp, an repons a interleukin (IL). )-4, byenke nan vivo dimansyon fonksyonèl yo se san dout pi konplèks.9

Ipèglisemi agrave pwogresyon ateroskleroz la ak retade regresyon plak la,10 ak ogmante ekspresyon de jèn pro-enflamatwa ak rezistans nan endiksyon nan ekspresyon jèn ki asosye M2-. stimuli intrinsèques ak anviwònman an, ki, an vire, afekte fonksyon iminitè a ak ekspresyon jèn yo.12 An repons a IL-4, makrofaj M2 prensipalman metabolize asid gra epi konte sou fosforilasyon oksidatif.13 Kontrèman, makrofaj M1. mande glikoz ak yon chanjman nan glikoliz aerobic, menm jan ak efè Warburg nan kansè.14,15 Chanjman metabolik sa yo rive kòm yon konsekans eksitasyon cytokine men yo ka detèmine tou fonksyon makrofaj.16 Anplis de sa, dènye rapò yo endike ke chanjman nan metabolis monosit ak macrophage. , ki gen ladan glikoliz aerobic oswa aktivasyon nan chemen mevalonate la,17,18 pwovoke alontèm memwa selil iminitè natirèl (yo rele iminite antrene) atravè modifikasyon epigenetik ak chanjman estrikti chromatin. nan zansèt mwèl zo yo (BM).20

Nou te fè ipotèz ke iminite fòmasyon an repons a glikoz ki wo te reprezante memwa ipèglisemi dyabetik sou ateroskleroz. An konsekans, nou te chache detèmine si ipèglisemi-pwovoke chanjman ki enpòtan nan maladi monosit ak makrofaj ak si chanjman sa yo te pèsiste apre restorasyon nan glikoz nòmal, sa ki vle di repwogram fondamantal. Nou konbine etid fonksyon selilè, metabolomik, transcriptomics, ak epigenomics pou defini kijan ipèglisemi chanje metabolis pou modile deklanchman alontèm atravè modifikasyon epijenetik. Nou te eksplore ki jan chanjman sa yo ka rive nan nivo selil souch ematopoyetik (HSC) ak nan makrofaj diferansye. Siyifikasyon fonksyonèl yo teste atravè transplantasyon BM nan yon modèl sourit nan ateroskleroz, ak konklizyon yo valide pa entèwogasyon nan makrofaj ekstrè soti nan san periferik imen ak plak ateroskleroz pa mikrodiseksyon lazè kaptire (LCM). Konklizyon nou yo ka eksplike rezistans nan konplikasyon macrovasculaire nan dyabèt nan tretman konvansyonèl bese glikoz.

METÒD

Resous Done

Done yo te pwodwi nan etid sa a yo te depoze nan Sant Nasyonal pou Enfòmasyon sou Biotechnologie Gene Expression Omnibus epi yo aksesib nan nimewo aksè GSE176068.

Bèt

Murine BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) in vivo facility by the Institutional Animal Care and Use Committee regulations (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited facility, project reference 70195 IVAT). All other animal protocols were conducted by the UK Home Office under the guidance of the operation of the Animals (Scientific Procedures) Act 1986, complying with all ethical regulations and the institutional review board guidelines (project license 30/3374; January 27, 2016). Wild-type C57BL/6J (12–14 weeks old) were randomly assigned to control or diabetic experimental groups. Diabetes was induced through an intraperitoneal injection of streptozotocin at a low dose range (42–45 mg·kg−1·/d−1) over 5 consecutive days. After 6 weeks after the final streptozotocin injection, diabetic mice with nonfasted blood glucose levels >Yo te elimine 13.9 mmol / L, epi yo te kolekte tisi.

Liy selilè

Tout liy selil yo te grandi nan 37 degre ak 5 pousan CO2. Selil L929 yo te grandi nan mwayen Roswell Park Memorial Institute ki te ajoute ak 10 pousan serom fetal bovine (FBS), 2 pousan penisilin-streptomycin, ak 2 mmol/L glutamin. Selil L929 yo te grandi nan konfluyans konplè pou 7 a 8 jou, epi yo te retire medya kondisyone yo, divize an alikòt, epi estoke nan -20 degre jiskaske yo mande yo. Selil endothelial sourit ki sòti nan po yo te kiltive nan 25 mmol / L glikoz DMEM ak 10 pousan FBS, 2 pousan penisilin-streptomycin, ak 2 mmol / L glutamin.

BM-Derivé Macrophages

Makwofaj ki sòti nan BM yo (BMDMs) yo te itilize nan etid sa a te pwodwi pa flòch BM soti nan femur murine ak tibyas ak plating sou ki pa trete kilti tisi plat Petri nan konplè 5 mmol / L glikoz DMEM (sipleman ak 10 pousan FBS, 2 pousan penisilin. -streptomycin, ak 2 mmol/L glutamin) plis 20 pousan L929 selil-kondisyone medya pou diferansyasyon. Apre diferansyasyon pou 7 jou, BMDM yo te chwazi pozitivman, plake nan yon dansite 2 × 105 selil / mL, ak ankouraje nan konplè 5 mmol / L glikoz DMEM (sòf si di otreman) ak swa 10 ng / mL recombinant murin interferon- (IFN). - ; R&D Systems, UK) plis 100 ng/mL LPS (Sigma-Aldrich, UK), 10 ng/mL recombinant sourit IL-4 (R&D Systems, UK), oswa kontwòl medya sèlman pou 16 èdtan anvan ou itilize . BMDM yo te kiltive tou ansanm nan divès kondisyon glisemi (5 mmol/L glikoz DMEM ak adisyon glikoz pou fè yon konsantrasyon final swa 11 oswa 20 mmol/L glikoz) oswa yon kondisyon kontwòl osmotik (mannitol; 5 mmol/L glikoz DMEM). plis 15 mmol/L mannitol). Etid metabolik yo te fèt nan absans oswa prezans 10 mmol/L dichloroacetates (Sigma-Aldrich, UK) oswa 1 mmol/L 2-deoxy-d-glikoz (Sigma-Aldrich, UK).

Izolasyon HSC

HSC yo te izole ak MagniSort Mouse Hematopoietic Lineage Depletion Kit (ThermoFisher Scientific, UK) lè yo lave BM nan femur murine ak tibyas ak enkubasyon ak makè yo retire selil filiaj komèt (CD3, CD4, B220, Ter119, ak Gr1) epi anrichi pou HSC yo. HSC yo te kiltive nan 5 mL fluoresans-aktive tib klasman selil nan konplè 5 mmol / L DMEM (oswa 20 mmol / L glikoz oswa mannitol pou eksitasyon ki endike nan kalite sovaj) ak adisyon a nan 100 ng / mL LPS plis 10 ng / mL IFN. - oswa 10 ng/mL sourit recombinant IL-1 (R&D Systems, UK) pou 16 èdtan pou analiz Western blot oswa 2 èdtan pou analiz pou analiz sekans kromatin aksesib transposaz (ATAC-seq).

BMDM In Vitro Modèl memwa

Sourit BM te diferansye nan BMDM jan sa dekri pi wo a nan 5 oswa 20 mmol/L glikoz pou 1, 2, 4, oswa 7 jou. BMDM yo te chwazi pozitivman atravè adezyon, replated nan konplè 5 mmol / L DMEM, epi kite yo enkubasyon pou 48 èdtan pou pèmèt yon peryòd nòmal glikoz. Lè sa a, yo te ankouraje BMDM yo pou itilize ak 10 ng/mL IFN- plis 100 ng/mL LPS oswa medya kontwòl pou 16 èdtan nan absans oswa prezans 0.25, 0.5, 1, 5, oswa 10 µmol/L Ro. 5-3335 (Merck Millipore, UK) anvan w itilize pou analiz ekspresyon jèn yo.

Izolasyon monosit sourit

Monosit murin yo te izole nan san periferik ak EasySep Mouse Monocyte Isolation Kit (Stemcell Technologies, Kanada) dapre pwotokòl manifakti a. Selil yo te itilize imedyatman pou tès adezyon estatik.

Seahorse XFe 96 an tan reyèl ATP Rate Assay Twous

Yo te fè analiz de flux ekstraselilè ak twous XFp RealTime ATP Rate Assay sou BMDMs (8 × 104 selil pou chak pi; 5 pwi replike pou chak bèt ak kondisyon), dapre enstriksyon manifakti a. Yo te pran twa pousantaj konsomasyon oksijèn debaz ak mezi pousantaj asidifikasyon ekstraselilè anvan yo te enjekte mwayen analiz diferan konsantrasyon glikoz (5 oswa 20 mmol/L) oswa kontwòl (mannitol; pò piki A). Apre yon lòt 7 mezi, konpoze oligomycin (2 µmol/L; piki pò B) ak konbine antimycin A (0.5 µmol/L) ak rotenone (0.5 µmol/L; piki pò C), ki soti nan XFp Real-Time ATP Rate Assay. twous, yo te enjekte sekans ak 3 mezi ki vin apre yo. Kantite ATP ki te pwodwi pa glycolysis ak endèks pousantaj ATP (mitoATP pwodiksyon pousantaj / glycolytic ATP pwodiksyon pousantaj) te otomatikman kalkile ak Wave (vèsyon 2.6, Agilent).

Estatik Adhesion Assay

Selil endothelial sourit ki sòti nan po yo te grandi nan konfluyans sou kouvèti vè nan plak 12-byen epi aktive pa 10 ng/mL recombinant sourit necrosis faktè- (R&D Systems, UK) pou 16 èdtan. Unstimulated oswa IFN-plis LPS-stimulated monosit san periferik (oswa BMDMs soti nan streptozotocin sourit dyabetik kiltive nan 5 mmol / L glikoz) te fluorescent make vèt ak twous la PKH67 fluorescent Linker selil (Sigma-Aldrich, UK) dapre enstriksyon manifakti a. Selil ki make yo te ajoute nan selil endothelial nan yon dansite 5 × 104 selil pou chak kouvèti pou 1 èdtan anvan medya ak selil ki pa atache yo te retire, lave ak saline fosfat-tampon (PBS), epi fiks nan 4 pousan paraformaldehyde. Kat imaj pou chak kouvèti yo te akeri; yo te konte kantite selil ki te respekte yo epi ki make; ak imaj yo pou chak kouvèti yo te fè mwayèn. Imaj ki parèt yo te egalman ajiste klète sou ImageJ.

Esè selil kim

Yo te grandi BMDM ki pa ankouraje oswa ankouraje (LPS plis IFN- ) sou kouvèti vè nan plak 12-byen epi yo te enkube ak 25 µg/mL lipoprotein ba-dansite (LDL; Bioquote, US) ak 25 µg/mL DiI-acetylated (LDL; Bioquote, US) pou 48 èdtan. Medya ak rès DiI-acetylated LDL yo te retire, ak selil yo te lave 3 fwa ak PBS ak fiks nan 4 pousan paraformaldehyde. Lipid la te tache ak Oil Wouj O, ak kouvèti yo te DAPI monte. Faz-kontras imaj nan tach lwil oliv wouj O ak imaj fliyoresan nan nwayo yo te pran (4 imaj pou chak kouvèti) epi yo te itilize pou quantifier kantite lipid oswa kantite selil, respektivman, ak lojisyèl ImageJ. Lè sa a, zòn lipid pou chak imaj te nòmalize nan kantite selil pou chak imaj, ak rezilta yo eksprime kòm chanjman pliye sou 5 mmol / L echantiyon kontwòl glikoz (pou eksperyans glikoz BMDM) ak echantiyon kontwòl (pou eksperyans BMDM dyabetik). Imaj ki parèt yo te ajiste klète inifòm.

Eksperyans transplantasyon BM dyabetik

BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory. Diabetes was induced in CD68–green fluorescent protein (GFP) transgenic mice as previously described for 4 weeks. Diabetic CD68-GFP mice with nonfasted blood glucose levels >13.9 mmol/L ak CD kontwòl 68-GFP sourit ki gen menm laj yo te itilize kòm donatè BM. Yo te kolekte BM nan sourit donatè yo, epi yo te enjekte 5 × 106 selil solid nan venn nan sourit B6.129S7- LdLr-/− ki te iradize letalman (2 × 500 rad) Ldlr-tm1Her/J (JAX stock No 002207). ). Apre grefon, tout bèt moun k ap resevwa yo te mete sou yon rejim Lwès (Open Source Diets D12079B; 1 pousan grès, 40 pousan kcal) pou 12 semèn. Yo te kolekte san antye nan 4, 8, ak 12 semèn apre grefon pou analiz sitometrik koule nan selil mononikleyè san periferik (PBMCs) ak pou kontwole nivo engraftment ak evalye kantite popilasyon lekosit yo. Engraftment, evalye chak 4 semèn apre grefon, te kontwole pa tach selil ak antiCD45 ak evalye pwopòsyon relatif la nan CD45 plis GFP plis selil nan mitan popilasyon an total CD45 plis. Nan 12 semèn, sourit yo te elimine, yo te kolekte san antye, epi yo te trete sera pou trigliserid, asid gra ki pa esterifye, LDL, ak mezi kolestewòl lipoprotein ki wo dansite. Sourit yo te perfused ak PBS, ki te swiv pa perfusion ak fixation ak 4 pousan paraformaldehyde lannwit lan. Yo te diseke kè a ak aorta epi yo te mete yo nan etanòl 70 pousan jiskaske pwosesis la.

Aortic Rasin Plak analiz ak imunofluoresans

Pou mezire fado plak, yo te mete rasin aortik paraformaldehyde ki fikse nan yon mwayen koupe optimal epi yo te seksyone sou yon plan paralèl ak atria yo. Pou mezire volim plak, kontni lipid plak,21 ak kontni kolagen an, 5 seksyon, respire distribye nan rasin aòtik la, yo te Masson-Goldner trichrome tache (Merck, UK). Yon ti tan, yo te refixe seksyon yo nan solisyon Bouin nan tanperati chanm pou 1 èdtan, yo te lave yo nan dlo k ap koule pou 5 minit, epi answit yo te mete yo nan pwotokòl twous tach Masson-Goldner nan dezyèm enkubasyon etanòl 70 pousan selon manifakti a. pwotokòl tan. Lè sa a, glisad ksilèn-mouye yo te monte ak Neo-Mount epi sele ak kouvèti vè. Karakteristik plak yo te quantifye nan vèsyon lojisyèl Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silverspring, MD), epi done yo te parèt kòm yon mwayèn nan tout seksyon yo.

Lè sa a, imunofluoresans te fèt sou 6 seksyon adjasan. Seksyon yo te tache pou kontni macrophage ak GFP (lapen anti-GFP, A6455, Invitrogen) oswa makrofaj galectin -3 (kabrit anti-galectin 3, AF1197, R&D Systems), pou kontni selil misk lis ak -aktin ( lapen anti-lis aktin nan misk, ab32575, Abcam PLC), ak pou mak epigenetik H3K4me3 (lapen poliklonal nan histon H3 [trimethyl K4], Ab8580, Abcam PLC) ak H3K27ac (lapen poliklonal ak histon H3 [acetyl K27], Ab4729), Abcam PLC). Pou tach imunofluoresan, seksyon yo te reyidrate ak PBS pou 5 minit nan tanperati chanm ak bloke pou 1 èdtan ak DAKO bloke tanpon (Agilent, UK). Antikò prensipal la te dilye a 1 µg/mL nan DAKO epi ajoute nan seksyon lannwit lan nan 4 degre. Antikò segondè yo te dilye 1:200 nan DAKO epi yo te ajoute pou 1 èdtan nan tanperati chanm (bourik anti-lapen [A488], A21206, Life Technologies; bourik antikabrit [A594], A11058, ThermoFisher Scientific). Seksyon yo te finalman DAPI monte (glycerol monte mwayen ak DAPI ak DABCO, Abcam, UK). Imaj fliyoresan yo te analize ak lojisyèl Image J.

Ekspresyon jèn

Yo te izole RNA total ak yon twous RNeasy Plus Mini (Qiagen, UK) epi yo te mezire ak yon espektrofotomèt UV-vizib Nanodrop 2000. Sentèz cDNA te fèt ak 0.2 a 2 µg RNA nan yon reyaksyon chèn polymerase (PCR) ak twous transkripsyon ranvèse QuantiTect (Qiagen, UK), dapre enstriksyon manifakti a. Yo te fè PCR quantitative an tan reyèl sou 5 ng/µL cDNA ak sond Taqman espesifik pou B2m (Mm00437762), Il-6 (Mm00446190), Il-1 (Mm00462531_ m1), iNos. (Mm00440502), Ym1 (Mm00657009), ak Fizz1 (Mm00556208). Quantitative PCR te fèt ak TaqMan universal master mix II ak UNG sou QuantStudioTM 7 Flex Real-Time PCR System (ThermoFisher). Tout done PCR yo te nòmalize nan ekspresyon jèn menaj entèn (B2m) epi analize pa metòd 2-ΔCT pou kalkile ekspresyon relatif mRNA.

Analiz Western Blot

Selil yo te lave nan PBS glas frèt epi yo te lysed nan tanpon liz tès radyo-imunoprecipitation (150 mmol/L NaCl, 1.0 pousan IGEPAL CA-630, 0.5 pousan deoxycholate sodyòm, 0.1 pousan SDS, 50 mmol/L Tris, pH 8.0) konplete ak inibitè pwoteaz ak fosfataz. Konsantrasyon pwoteyin te detèmine pa tès asid bicinchoninic (Pierce BCA Pwoteyin Assay Twous, ThermoFisher Scientific, UK) dapre enstriksyon tès yo. Konsantrasyon egal nan pwoteyin yo te chaje ak kouri sou yon jèl SDS-PAGE (4 pousan a 12 pousan Bis-Tris Gel, Life Technologies, UK) pou separe. Pwoteyin yo te transfere sou yon manbràn nitrocellulose (Bio-Rad, UK) ak sonde ak antikò espesifik jan sa endike ak -actin (sourit anti- -aktin [15G5A11/E2], Invitrogen) kòm yon mennaj ak kontwòl chaj. Manbràn yo te devlope (SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate, Thermo Scientific, UK) epi yo te detekte pa chemiluminescence sou yon Estasyon Imaj Biorad.

Echantiyon Imèn ak Izolasyon LCM nan Plak Macrophages

Tout envestigasyon klinik yo te fèt pa Deklarasyon èlenki, ak echantiyon yo te estoke anba Lwa sou tisi imen UK (2004). Komite revizyon etik ki enpòtan te apwouve etid la, epi tout matyè yo te bay konsantman enfòme alekri. Yo te rekrite pasyan ki t ap tann endarterectomy karotid, epi yo te ranmase plak karotid yo fèk nan moman operasyon an (karakteristik pasyan yo rezime nan Excel File I nan Sipleman Done). Plak karotid eksplante yo te lave nan PBS esteril frèt, menen-jele nan mwayen koupe optimal, epi estoke nan -80 degre jiskaske yo trete.

LCM te pote soti ak yon sistèm PALM Microbeam LCM (Carl Zeiss GmbH, Almay) lè l sèvi avèk yon apwòch adapte "glise gid". Glisad gid yo te genyen 3 seksyon youn apre lòt: Premye seksyon an te tache ak pwotokòl twous tach Masson-Goldner pou ede nan detèminasyon kote mikwo-anatomik yo, epi 2 pwochen yo te immunostained pou swa macrophages (sourit antimoun CD68 [klonaj KP{{7} }], Dako, Cambridge UK) oswa selil misk lis (sourit antihuman -actin [klonaj 1A4], Dako, Cambridge UK). Seksyon ki vin apre yo (jiska 15) yo te koupe sou glisad manbràn LCM (ThermoFisher Scientific, UK) ak kresyl vyolèt tache pare pou pwosesis imedya. Gwoup selil makrofaj yo te idantifye manyèlman baze sou tach gid-glisad la lè l sèvi avèk PALM RoboSoftware (vèsyon 4.5, Carl Zeiss GmbH, Almay). Yon zòn total konbine nan enterè ant 3 ak 5 × 106 µm2 te kaptire lazè sou yon Zeiss PALM AdhesiveCap (Carl Zeiss GmbH, Almay). Selil yo te imedyatman lysed, snap-jele sou glas sèk, epi estoke nan -80 degre jiskaske RNA a te ekstrè ak twous mikwo RNEasy la (Qiagen, UK), dapre pwotokòl manifakti a.

Plak Imèn Macrophage Microarray

Isolated plaque macrophage RNA concentration was determined with the Agilent RNA 6000 Pico LabChip on the Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, US). Samples with an RNA integrity number >5 yo te pran pou pi devan pou anplifikasyon RNA, biotinilation, ak analiz microarray ekspresyon jèn. Yo te soumèt echantiyon sa yo bay Cambridge Genomic Services (Depatman Patoloji, University of Cambridge, UK) pou plis pwosesis. Yo te fè anplifikasyon ak biotinilation ak twous Ovation Pico WTA V2 (Nugen Technologies Inc, US), epi apre sa yo te varye ibridasyon an nan lòd o aza sou 2 Illumina Human HT12 v4.0 BeadChips (Illumina, US) pou minimize pakèt. /chip varyasyon. Illumina BeadArrays te trete ak pakè etalaj Bioconductor (vèsyon 2.24.0)24,25 lè l sèvi avèk nòmal nòmal eksponansyèl. Ansanm sond yo te tonbe pou chak jèn ki baze sou seri maksimòm entèkartil la pou evite valè ekstrèm men pran varyasyon atravè tout echantiyon yo. Ansanm sond san annote ak kontwòl yo te eskli nan plis analiz. Ekspresyon diferans (DE) nan lis final 21036 jèn yo te evalye ak pakè Bioconductor limma (vèsyon 3.30.13)26 pou konpare dyabetik ak kontwòl, ajiste pou estati sentòm / asymptomatic. Bay disponiblite a nan seri done ortogonal ak 8 echantiyon pou chak gwoup, nou te itilize yon valè ajiste relativman induljan nan P.<0.2 with no fold change cutoff to select genes to pursue.

Izolasyon monosit imen

San venn periferik (15–20 mL) te jwenn nan men donatè ki an sante nan tib K2-kouvwi EDTA (BD Vacutainer, New Jersey) epi yo te trete nan 1 èdtan. Yo te jwenn plasma ak yon fraksyon mononikleyè ki anrichi nan santrifij san antye sou kolòn Accuspin Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, US) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te pran fraksyon mononukleè ki anrichi nan selil monosit la pou izole monosit ak yon twous izolasyon pèl seleksyon negatif (EasySep moun monocyte anrichment kit san CD16 appauvrissement, StemCell Technologies, Kanada), swiv pwotokòl ki dekri manifakti a.

Izolasyon selil mononukleè san periferik imen ak eksitasyon

Pasyan ki gen dyabèt ak pasyan kontwòl yo te rekrite pou etid klinik apre apwobasyon etik lokal ak rejyonal nan Karolinska Institute, Stockholm (2011/1002-31/1 ak 2009/1881-31/1). Yo te izole PBMC yo nan echantiyon san periferik yo te kolekte apre yo te fè jèn lannwit lan ak SepMate (StemCell Technologies) ak Lymphoprep (StemCell Technologies) dapre enstriksyon manifakti a. PBMC izole yo te jele epi estoke nan 90 pousan FBS ak 10 pousan dimethyl sulfoxide.

PBMCs ki estoke yo te dekonjle epi lave nan PBS pa santrifijasyon (500g pou 10 minit), yo te konte selil solid epi yo te plake nan pwi endividyèl nan yon 12-plak kilti tisi byen nan DMEM glikoz fizyolojik (ki ba), 10 pousan FBS, 2. mmol/L l-glutamin, ak 1 pousan penisilin ak streptomycin. PBMC yo te repoze lannwit lan epi yo te trete ak PBS-veyikil oswa 100 ng/mL LPS ak 10 ng/mL IFN- (R&D Systems) pou 6 èdtan. Apre eksitasyon, PBMC yo te lysed nan RLT (QIAGEN), menen-jele, epi estoke nan -80 degre. RNA te izole ak sijè a RNA-sekans (RNAseq) jan sa dekri.

Metabolomik ak Mezi metabolit

Yo te kiltive monosit imen izole nan yon dansite 3.5 × 105 selil pou chak echantiyon nan DMEM glikoz konplè 5 mmol/L, medya yo te konplete ak glikoz pou fè yon konsantrasyon final 20 mmol/L glikoz. , oswa medya ki gen 15 mmol / L mannitol nan 5 mL fluoresans-aktive tib klasman selil pou 12 èdtan. Lysates selil yo te prepare pa ekstraksyon ak metanol glas frèt pou 20 minit sou glas sèk ak menen-jele nan nitwojèn likid. Nan jou analiz la, echantiyon yo te toubiyon epi answit santrifuje nan 10,000g pou 10 minit nan 4 degre. Yo te prepare yon echantiyon kontwòl kalite pisin nan melanje 60 µL chak ekstrè echantiyon epi analize detanzantan pandan tout kouri analyse jeneral la pou konfime pèfòmans metòd la. Echantiyon yo te filtre ak yon filtè santrifujeur Ultrafree-MC 0.1-µm (5000g, 3 minit) epi yo te transfere yo nan flakon kwomatografi likid–spèktrometri mas. Analiz metabolomik ki pa sible yo te fèt jan sa te dekri anvan an.27 Yon ti tan, echantiyon yo te analize sou yon chromatografi likid Thermo Ultimate 3000 ultrawo pèfòmans makonnen ak yon Q-Exactive Orbitrap lè l sèvi avèk akizisyon switch polarite (pozitif-negatif) opere nan yon pouvwa rezolisyon mas 70000. lajè plen nan mwatye maksimòm. Konpoze idrofil yo te separe kwomatografikman sou yon kolòn Merck Sequant ZIC-HILIC (150×4.6 mm, 5-µm gwosè patikil) ak konpoze idrofob lè l sèvi avèk yon kolòn Thermo Accucore aQ RP C18 (150×2.1 mm, 2.{{38). }} µm gwosè patikil). Yo te idantifye metabolit yo lè l sèvi avèk yon baz done anndan kay la.27 Yo te fè anrichisman metabolit ansanm ak analiz chemen metabolik sou tout mezi metabolit lè l sèvi avèk MetaboAnalyst (vèsyon 4.0).

Pou mezi metabolit BMDM ak HSC, selil yo te kiltive jan sa dekri anvan nan yon dansite 5 × 105 pou chak pi, ak supernatant kilti yo te kouri sou ABX Pentra 400 (Horiba) pou mezire glikoz (ABX Pentra Glucose PAP CP, Horiba, UK) ak nivo laktat (ABX Pentra Lactic Acid). Mezi yo te nòmalize nan glikoz ak laktat konsantrasyon ki prezan nan kontwòl medya kilti selil konplè ki te enkube nan menm kondisyon yo men pa nan prezans selil yo. Lisat selil BMDM yo te itilize pou mezire nivo succinate (Succinate Assay Twous, Abcam, UK) dapre enstriksyon manifakti a.

Analiz ATAC-seq

Control or diabetic isolated HSCs or BMDMs, unstimulated or stimulated with IL-1β or LPS+IFN-γ for 2 hours, respectively, in 5 mmol/L glucose DMEM were used for ATAC-seq analysis according to a previously described protocol.28 Briefly, nuclei from 50000 HSCs or 75000 BMDMs per replicate were isolated, lysed on ice, and immediately put through transposition reaction using Tn5 transposase and TD buffer (Illumina, US) for 30 minutes at 37°C. Library amplification (NEBNext High Fidelity 2× PCR master mix, New England Biolabs, US) was followed by SPRI size selection to exclude fragments >1200 bp. Konsantrasyon ADN yo te mezire ak yon fliyomèt Qubit (Life Technologies), epi yo te evalye distribisyon gwosè bibliyotèk ak Bioanalyser DNA HighSensitivity Chip (Agilent, UK). Yo te fè anplifikasyon bibliyotèk ak primè Nextera koutim.28 Bibliyotèk yo te sekans pa Etablisman Sekans Biomedikal nan CeMM lè l sèvi avèk platfòm Illumina HiSeq 3000/4000 ak konfigirasyon 50-bp single-read.

Lekti yo te kontwole pou bon jan kalite ak pran pare nan nenpòt adaptè ki rete yo. Lè sa a, lekti yo te aliyen ak genomic sourit la (Mm10) ak Bowtie (vèsyon 2.2.6) nan mòd "sansib lokal". Yo te filtre lekti ki aliye yo pou retire alimèt ki pa gen anpil kalite (bon jan kalite kat pi piti pase oswa egal a 10) oswa kat lekti nan sekans mitokondriyo. Pozisyon kòmanse aliyman yo te deplase nan yon fason ki konsyan sou strand (4 bp, -5bp, 28) anvan apèl pik ak MACS2 (vèsyon 2.1.129). Rejyon ki gen limit diferans yo te idantifye ak DiffBind (vèsyon 2.4.830) ak santre pik (sòm=100) ak edgeR.31

Apre sa, yo te fè analiz chemen an sou pik ki anrichi nan echantiyon dyabetik (pousantaj dekouvèt fo [FDR] mwens pase oswa egal a {{0}}.1) lè yo te antre kote kwomozòm pik la nan Zouti Anrichisman Anotasyon Rejyon Jenomik yo ( vèsyon 3.0).32 Lè sa a, rejyon pik diferans yo te analize ak MEME-chromatin immunoprecipitation (ChIP; vèsyon 4.12.0),33 ki fè analiz konplè motif pou idantifye nenpòt ki motif obligatwa li te ye oswa enkoni ki anrichi (anrichi. motif E<0.05; minimum width, 6; minimum number of sites, 3).

Faktè 1 Transcription ki gen rapò ak Runt Idantifikasyon sib

MEME-ChIP nan rejyon ATAC-seq yo te idantifye faktè 1 transkripsyon ki gen rapò ak Runt (RUNX1) kòm yon regilatè potansyèl nan tou de IL-1 ak HSCs dyabetik san stimulation. MEME GOMo (vèsyon 4.12.0)33 te itilize pou eskane sourit ak pwomotè imen (-1000, plis 200) pou konsansis RUNX1 motif (MA002.2). Anplis analiz anrichisman Gene Ontology, GOMo retounen yon lis jèn idantifye kòm sib. Frape sa yo te limite nan pwomotè konsève ki mare nan tou de sourit ak imen ak valè anpirik P<0.05 or 0.01. Mouse Genome Informatics identifiers were converted to Mouse Ensembl identifications on the Mouse Genome Informatics website and then to Human Ensembl identification and gene symbol using the Ensembl BioMart interface. For values of P<0.05, 1300 target genes were converted, of which 1251 were represented on the arrays; for values of P<0.01, there were 355 converted and 347 on the arrays. The overrepresentation of RUNX1 target genes among the DE genes was assessed by the Fisher exact test as implemented in R. The heatmap package (version 1.0.8) was used to generate the heat maps, with row-normalized log2 values shown for DE genes. Both genes and samples were clustered by Pearson correlation.

Analiz RNA-seq

Kontwòl oswa dyabetik BMDMs (n=6), kiltive nan 5 mmol / L ak ankouraje ak LPS plis IFN- pou 6 èdtan oswa selil kontwòl san stimulation, yo te itilize pou analiz RNA-seq. Yon ti tan, yo te izole RNA ak twous izolasyon mirVana mRNA/miRNA (ThermoFisher Scientific, UK), dapre enstriksyon manifakti a. Kantite total RNA te quantifye ak sistèm Quantitation Fluorometric Qubit (Life Technologies), epi nimewo entegrite RNA te detèmine ak Sistèm Electrophoresis Automated Experion (Bio-Rad). Bibliyotèk RNA-seq yo te prepare ak twous preparasyon echantiyon TruSeq Stranded mRNA LT (Illumina, UK) lè l sèvi avèk tou de Sciclone ak Zephyr likid manyen robotics (PerkinElmer, UK). Konsantrasyon bibliyotèk yo te quantifye ak sistèm Quantitation Fluorometric Qubit (Life Technologies, UK), epi yo te evalye distribisyon gwosè a ak Sistèm Electrophoresis Automated Experion (Bio-Rad, US).

Pou sekans, echantiyon yo te dilye ak pisin nan kantite ekivomolar ak sekans sou enstriman Illumina HiSeq 3000/4000 nan 50-bp konfigirasyon yon sèl lekti pa Etablisman Sekans Biomedikal nan CeMM. Apèl baz yo te founi pa lojisyèl an analiz an tan reyèl Illumina yo te imedyatman konvèti nan fòma kat jeyografik aliyman binè (Illumina2bam) anvan demultiplexing (BamIndexDecoder) nan dosye endividyèl, echantiyon espesifik aliyman binè kat jeyografik atravè zouti Illumina2bam (1.17.3). Bibliyotèk yo te prepare ak sekans pa Etablisman Sekans Biomedikal nan CeMM.

Lekti yo te aliyen ak genomic sourit la (GRCm38/ mm10) lè l sèvi avèk STAR (vèsyon 2.5.3a34) nan mòd konte jèn (quantMode GeneCounts) ak anotasyon Gencode (vèsyon M16) (ki soti nan ki mega transkripsyon Gm20388 te retire pou evite sipèpoze jèn entèvni). Konte yo te chaje nan R (vèsyon 3.3.3) epi analize ak edgeR (vèsyon 3.16.535) apre yo fin retire transkripsyon yo ak<0.5 mapped reads per million sequenced in all samples (13568 transcripts retained). Genes with adjusted values of P<0.05 and fold change >1.5 yo te konsidere kòm DE. Tablo DE ak lis jèn yo enkli kòm Fichye Excel II nan Sipleman Done (san stimulation) ak Fichye Excel III nan Sipleman Done a (LPS plis IFN-stimile). Fonksyon edgeR cpm te itilize pou journal-normalize konte (Fichiye Excel IV nan Sipleman Done) pou kat chalè ak lòt trase. Kat chalè yo te pwodwi ak R package heatmap (vèsyon 1.0.836). Surreprezantasyon nan analiz jèn sib RUNX1 nan mitan jèn DE nan dyabetik konpare ak LPS kontwòl plis IFN- echantiyon yo te fèt jan sa dekri deja pou done yo etalaj imen.

ChIP Sekans

Yo te fikse yon total de 1 × 106 selil/mL ak 1 pousan fòmaldeyid nan tanperati chanm pou 10 minit, lave ak PBS, epi estoke nan -80 degre. Selil yo te taye ak Chromatin EasyShear Twous–Low SDS (Diagenode, Bèljik) epi sonike ak yon aparèy sonication Bioruptor Pico (katalòg No B01080010, Diagenode, Bèljik) dapre rekòmandasyon manifakti a. MAGnify Chromatin Immunoprecipitation System (Thermo Scientific) te itilize pou chwazi fragman chromatin lè l sèvi avèk anti-histone H3 (trimethyl K4; ab8580) oswa anti-histone H3 (asetil K27; ab4729). Bibliyotèk sekans yo te prepare avèk Twous Preparasyon Bibliyotèk ADN NEBNext Ultra II dapre enstriksyon manifakti a. An brèf, pirifye ChIP oswa ADN antre te fen-repare ak A-tailed ki te swiv pa ligasyon adaptè. ADN adaptè-ligated yo te chwazi gwosè ak pèl SPRI Ampure XP (Agencourt) epi yo te rich ak primè sekans ki konpatib Illumina. Bibliyotèk final yo te pirifye ak pèl SPRI Ampure XP pou retire dimè adaptè yo epi yo te sekans pa Etablisman Sekans Biomedikal nan CeMM lè l sèvi avèk platfòm Illumina HiSeq 3000/4000 ak konfigirasyon 50-bp single-read.

Bioenfòmatik

Pou egzamine relasyon ki genyen ant chromatin ouvèti ak ekspresyon jèn nan BMDMs unstimulated, dyabèt kont kontwòl ATAC-seq pik (chanjman log2 pliye) ak nivo mRNA nan jèn ki pwòch yo (chanjman log2 pliye) yo te konpare pa Pearson lineyè korelasyon.

Lekti ki soti nan ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-sekans (ChIPseq), ak H3K27ac ChIP-seq eksperyans yo te vizyalize nan echantiyon reprezantan lè l sèvi avèk Navigatè a Genome Integrative, ak wotè tras yo echèl pou chak eksperyans ak kalite selil pou konte pou diferans sistematik nan pwofondè lekti.

Analiz estatistik

Tout analiz estatistik done nonsequencing yo te fèt nan lojisyèl GraphPad Prism. Done yo te analize pou distribisyon nòmal pa tès nòmal Shapiro-Wilk. Konparezon ant 2 gwoup yo te kalkile pa 2-tès Student t oswa tès Mann-Whitney U pou done distribiye nòmalman oswa non nòmalman, respektivman. Konparezon ant plizyè gwoup yo te kalkile pa 1-fason oswa 2-fason analiz ANOVA ak koreksyon post hoc Bonferroni. Done yo rapòte kòm mwayen ± SD pou done nòmalman distribye oswa medyàn ± ranje entèkwatil pou done ki pa nòmal distribye. Plizyè replike ak lòt detay estatistik ka jwenn nan lejand figi yo. Pou tou de eksperyans nan vivo ak nan vitro, n se kantite bèt endividyèl oswa volontè endividyèl oswa pasyan an sante. Chanjman pliye yo kalkile kòm valè kondisyon tès mwayèn divize pa valè kontwòl mwayèn.

REZILTA

Ipèglisemi dyabetik chanje metabolis selilè, kondwi ekspresyon ak fonksyon jenetik proenflamatwa

Glikoliz aerobic ogmante ekspresyon jèn pro-enflamatwa (M1),37 ak ipèglisemi tou ankouraje ekspresyon jèn ki asosye ak M1-. .

Analiz metabolom nan monosit imen prensipal yo te endike ke gwo glikoz ekstraselilè (20 mmol/L) te chanje pwofil metabolik la konpare ak kondisyon osmotik fizyolojik glikoz (5 mmol/L). Analiz chemen (Figi 1A) te revele ke gwo glikoz te kondwi chanjman enpòtan nan sik asid trikarboksilik (FDR, 0.002) ak metabolis piruvat (FDR, 0.005), ki endike pa ogmante siksin, malat ( Figi 1B), nivo laktat, ak piruvat (Figi 1C), respektivman, ak analiz anrichisman metabolit (Figi 1D) mete aksan sou efè Warburg (FDR, 0.04).

Figi 1. Gwo glikoz chanje metabolis selilè. Yon analiz chemen metabolik. Mezi endividyèl pou (B) succinate, malat, (C) laktat ak piruvat ak (D) metabolit mete analiz anrichisman (Metaboanalyst) pou echantiyon metabolomik lisat selil monosit imen (n=5). Analiz flux ekstraselilè sou makwofaj ki sòti nan mwèl zo sourit (bioanalyzer Seahorse; n=6 bèt endividyèl) mezire (E) to asidifikasyon ekstraselilè (ECAR) ak (F) to konsomasyon oksijèn (OCR) an repons a divès kalite glikoz ekstraselilè, kontwòl osmotik (mannitol), ak piki metabolik inhibitor. Segondè glikoz (G) ogmante pwodiksyon glycolytic ATP (glycoATP) ak (H) diminye endèks pousantaj ATP (mitokondrial ATP pousantaj pwodiksyon / pousantaj pwodiksyon glycoATP), ki endike yon chanjman nan yon fenotip plis glycolytic. Done yo te analize pa (B ak C) 2-fason ANOVA oswa (E–H) 1-fason ANOVA plis tès post hoc Bonferroni. Tout done yo montre yo vle di ± SD. AU endike inite abitrè; FDR, to dekouvèt fo; ak TCA, asid trikarboksilik. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Yon fenotip plis glikolitik (ak mwens oksidatif) an repons a gwo glikoz (20 mmol / L) te konfime nan BMDM sourit, ki te montre yon ogmantasyon nan pousantaj asidifikasyon ekstraselilè, ogmante pwodiksyon ATP glikolitik (2-pliye; P<0.01), decreased ATP rate index (by 56%; P<0.05; Figure 1E–1H), and increased glucose consumption and lactate production (P<0.001; Figure Ia and Ib in the Data Supplement). Cultured BMDMs also increased succinate levels in response to high extracellular glucose in both unstimulated (2.5-fold, P<0.05) and M1-stimulated states (1.9-fold; P<0.001; Figure Ic in the Data Supplement).

Ogmantasyon sa a nan pousantaj glycolytic te anpeche pa inibitè a nan glycolysis dichloroacetate (Figi Ia ak Ib nan Sipleman an Done).

Nan BMDMs, gwo glikoz tou de ankouraje proenflamatwa M1-asosye ekspresyon Il-6 (2.7-pliye; P<0.001; Figure 2A) and suppressed M2-associated Ym1 (70%; P<0.001) and Fizz1 (42%; P<0.001) expression (Figures 2C and 2D). These bidirectional changes in gene expression were restored in the presence of dichloro-acetate (Figure 2A–2D) and 2-deoxy-d-glucose (Figure IIa–IId in the Data Supplement), together indicating that the proinflammatory effects of high extracellular glucose were mediated through changes in glycolysis and were not merely the result of nonspecific changes to overall metabolic activity.

Figi 2. Gwo glikoz chanje ekspresyon jèn makwofaj ak fonksyon. M1 (lipopolysaccharide [LPS] plis entèferon-[IFN-] stimulé) makwofaj mwèl zo ki sòti (BMDM) (A) Il-6 ak (B) se ekspresyon jèn nan prezans oswa absans dichloroacetate (DCA). M2 (interleukin-4 ankouraje) BMDM (C) Ym1 ak (D) ekspresyon jèn Fizz1. A jiska D, Done reyaksyon chèn polymerase Quantitative yo nòmalize nan ekspresyon B2m; n=7 rive 10. E, Kantifikasyon imaj adezyon monosit sourit ak selil andotelyo (n=5). F, Kantifikasyon imaj nan absorption lipoprotein ba-dansite acetylated pa BMDMs, nòmalize pa nimewo selil pou chak imaj. Reprezantan (G) imaj adezyon estatik nan monosit sourit ki gen lejann PKH67-nan selil andotelyal yo ak (H) Lwil Wouj O (ORO) - ak imaj selil kim ki tache DAPI. Tout done (A–H) yo montre kòm mwayen ± SD; (A–D) 1-fason ANOVA oswa (E ak F) 2-fason ANOVA ak analiz post hoc Bonferroni. Chak pwen reprezante yon bèt endividyèl (mwayèn 4 imaj pou adezyon estatik ak fòmasyon selil kim). AU endike inite abitrè; NS pa enpòtan. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Etandone efè li sou pwomosyon enflamasyon, nou te teste si wo nan glikoz ekstraselilè chanje fonksyon monosit ak makrofaj ki gen rapò ak atherogenesis.<0.001; Figure 2E and 2G) and promoted BMDM uptake of modified LDL to form foam cells (4.1-fold [and 2.7-fold when M1 stimulated]; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H). The effects on monocyte adhesion were negated entirely by inhibition of glycolysis with dichloroacetate (P<0.001; Figure 2E and 2G) and 2-deoxy-glucose (P<0.001; Figure IIe in the Data Supplement), whereas foam cell formation, was decreased by 30% (and by 42% when M1-stimulated; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H).

Selil ki sòti nan BM ki soti nan sourit dyabetik yo montre iminite ki fòme ak ipèglisemi.

Apre sa, nou te itilize yon modèl sourit nan dyabèt pou teste si ipèglisemi-induit chanjman pro-enflamatwa ki pèsistan nan makrofaj, menm apre nòmalizasyon glikoz. Nou te jwenn BM nan sourit kontwòl ki pa dyabetik, ki matche ak laj ak sourit dyabetik syngeneic kote strèptozotosin te pwovoke ipèglisemi epi kenbe pou 6 semèn nan vivo (Figi IIIa-IIId nan Sipleman Done). Selil yo te diferansye nan BMDMs anba glikoz fizyolojik (5 mmol / L; Figi 3A). Apre eksitasyon, BMDM ki gen orijin sourit dyabetik te montre ekspresyon jèn M1-asosye Il-6 (4.1-pliye; P<0.0001; Figure 3B) and, with IL-4 treatment, decreased M2-associated Ym1 expression (by 75%; P=0.0003) and Fizz1 (by 70%; P=0.0326; Figure 3D and 3E). RNA-seq analysis of control and diabetic BMDMs revealed clear delineation based on gene expression profiles, which was further accentuated by LPS and IFN-γ stimulation (Figure 3F). Indeed, when expression levels of a panel of 39 previously identified M1- and M2-associated genes were examined,9 BMDMs from control and diabetic origin showed clear segregation after LPS+IFN-γ stimulation (Figure 3G).

Figi 3. mwèl zo (BM)-deriv macrophages (BMDMs) soti nan sourit dyabetik manifeste memwa ipèglisemi nan ekspresyon jèn. A, Chema pwotokòl BMDM pou dyabetik ak kontwòl (n=10-12). M1 analiz ekspresyon jèn nan (B) Il-6 (P<0.0001) and (C) is. M2 (D) Ym1 (P=0.0003) and (E) Fizz1 (P=0.0326) gene expression. B through E, All quantitative polymerase chain reaction data are normalized to B2m expression and analyzed by the unpaired t-test. F, Principal component (PC) analysis of all control and diabetic BMDM RNA sequencing (RNA-seq) transcript reads (n=6); percent indicates sample variability. G, Unsupervised hierarchical clustering shows marked segregation of 39 previously identified M1 and M2 macrophage marker genes in lipopolysaccharide (LPS)+interferon-γ (IFN-γ)–stimulated BMDMs from diabetic or control origin (RNA-seq analysis). IL indicates interleukin.

Anplis de sa, te gen plis adezyon ak andotelyòm aktive (pa 6.3-pliye; P<0.05; and by 9.4-fold when LPS-stimulated; P<0.001; Figure 4A and 4C) and enhanced modified LDL uptake and foam cell formation (LPS stimulated, 1.6-fold; P<0.01; Figure 4B and 4D). This array of persistently heightened responses was indicative of hyperglycemia-induced trained immunity.

Figi 4. Makwofaj ki sòti nan mwèl zo (BMDM) ki soti nan sourit dyabetik montre fonksyon ki chanje malgre nòmalizasyon glikoz. BMDM ki soti nan sourit dyabetik yo te diferansye nan 5 mmol / L (n=5-8). A, Kantifikasyon imaj nan adezyon BMDM nan selil andotelyo (n=8). B, Imaj quantification de absorption lipoprotein acetylated ba-dansite pa BMDMs, nòmalize pa nimewo selilè pa imaj. Reprezantan (C) imaj adezyon estatik nan fluorescently (PKH67) make BMDMs nan selil andothelial ak (D) Lwil Wouj O (ORO)- ak DAPI-tache imaj selil kim. Tout done yo montre kòm mwayen ± SD, epi chak pwen reprezante yon bèt endividyèl (mwayèn 4 imaj pou adezyon estatik ak fòmasyon selil kim). Done yo te analize pa 2-fason ANOVA ak tès post hoc Bonferroni. IFN- la vle di entèferon-; ak LPS, lipopolisakarid. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Iminite antrene ki pwovoke ipèglisemi mennen ateroskleroz

Se poutèt sa, pou teste siyifikasyon fonksyonèl nan iminite fòmasyon ipèglisemi-induit nan ateroskleroz, nou transplante'tèt BM soti nan kontwòl normoglycemic oswa sourit donatè dyabetik strèptozotocin-induit (glikoz nan san, 33.9±6.9 mmol / L) nan ateroskleroz ki gen tandans (normoglisemi /) Ldl. - sourit moun k ap resevwa (Figi 5A). Nan chak ka, sourit donatè yo te transjenik pou GFP anba kontwòl pwomotè CD68 imen an.40 Yo te montre engraftment efikas ak ekivalan pa analiz sitometrik koule nan PBMCs, ki konfime prezans CD45 plis GFP plis selil pozitif pou swa CD11b oswa Ly6C ( Figi IVa ak IVb nan Sipleman Done a). Apre 12 semèn sou yon rejim oksidantal, pa te gen okenn diferans nan mezi lipid san (Figi IVc ak IVd nan Sipleman Done) oswa sou-ansanm lekosit jan yo evalye pa sikometri koule (Figi IVe nan Sipleman Done).

Sourit ki te resevwa BM dyabetik te montre ateroskleroz ki te ogmante anpil, ak yon majorite ki te gen plis pase pi gwo fado ateroskleroz la nan moun ki pa gen dyabèt yo (zòn plak medyàn, 44461 µm2 [ranje entèkartil, 18368–59597 µm2] kont 79809 [47474745 µm2] ; Mann-Whitney, P=0.036). Sourit sa yo te montre tou yon ogmantasyon nan kontni makrofaj nan plak yo (P=0.052; Figi V nan Sipleman Done a), zòn nwayo lipid ki rich ak nekrotik (2.8-pliye, P{{18). }}.0076; Figi VIa nan Sipleman Done a), ak pwopòsyon nwayo nekrotik ki rich nan lipid (2.4-pliye, P{=0.046; Figi VIb nan Sipleman Done a), men ki pa gen okenn diferans ki genyen nan kontni kolagen an (pousan plak; Figi VIc ak VId nan Sipleman Done) oswa selil misk lis (pousan plak; Figi VIe ak VIf nan Sipleman Done).

Chanjman nan metabolis ki mennen nan repwogram epijenetik ki lakòz ipèglisemi yo antrene iminite nan HSC yo.

Bay demonstrasyon ke BM ki soti nan sourit ipèglisemi ankouraje ateroskleroz, ansanm ak ekspresyon jèn ki pèsistan proinflammatory ak repons fonksyonèl yo te jwenn nan BMDM in vitro, nou te rezone ke memwa sa a se te yon manifestasyon iminite ki antrene nan selil ki sòti nan BM. Iminite ki antrene yo te asosye ak chanjman nan metabolis selilè ki pwovoke mak epigenetik ki dire lontan, kwomatin-chanje tankou H3K4me3 ak H3K27ac.17,18,41 Nan liy ak sa a, nou te jwenn ke HSC (liniaj negatif: retire selil T ki gen matirite. , Selil B, selil asasen natirèl, selil dendritik, monosit, granulosit, selil eritroyid: CD3−, CD4−, B220−, Ter119, Gr1− kiltive nan kondisyon ki gen gwo glikoz ekstraselilè tou montre ogmante absorption glikoz ak pwodiksyon laktat, ki endike glikoliz disregulated. (P<0.001; Figure VIIa–VIId in the Data Supplement), and both H3K4me3 and H3K27ac modifications were increased (Figure VIIIa–VIIIf in the Data Supplement). In the case of H3K4me3 (but not H3K27Ac), this effect was negated with dichloroacetate inhibition (Figure VIIIa, VIIIc, and VIIId in the Data Supplement). These chromatin marks were also consistently increased in HSCs from diabetic mice compared with control HSCs and remained heightened after differentiation into BMDMs using physiological glucose levels (5 mmol/L; Figure VIIIb, VIIIe, and VIIIf in the Data Supplement).

Nan plak rasin aortik, pwopòsyon nwayo makwofaj ki asosye ak tache pozitif pou H3K4me3 te pi wo nan sourit ki te resevwa BM nan men donatè dyabetik (1.8-pliye, P<0.05) compared with control donors (Figure 5E and 5F), which is in line with the corresponding analysis of BMDM in vitro experiments (Figure VIIIb and VIIIe in the Data Supplement). These data point to a direct causal link between increased glycolytic rate and the development of hyperglycemia-induced trained immunity. In addition to metabolic mediators,17,18 recent work has implicated the inflammatory cytokine IL-1β in the development of trained immunity.42 This is particularly relevant because IL-1β has been identified in diabetes43 as an important driver of atherosclerosis and in obesity in which adipose tissue macrophage-produced IL-1β induces the proliferation of BM progenitors.44,45 Therefore, we hypothesized that IL-1β and hyperglycemia may work synergistically to induce atherosclerosis-relevant epigenetic changes that alter chromatin structure. To interrogate chromatin accessibility, we performed an assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) on HSCs from diabetic or control mice, both with and without IL-1β stimulation28 (sample processing summarized in Excel File V in the Data Supplement). HSCs from a diabetic origin showed differential chromatin profiles (summarized in Excel File VI in the Data Supplement) in response to IL-1β exposure, with 530 differential peaks (FDR ≤0.1) of which 50% exhibited increased accessibility in diabetic cells. 

Figi 5. mwèl zo dyabetik (BM) kondwi ateroskleroz malgre nòmalizasyon glikoz pwolonje. A, Chema eksperyans transplantasyon BM. B, Flow cytometric analiz de popilasyon leukocyte periferik nan sourit apre 12 semèn transplantasyon mwèl zo. C, Imaj rasin aortik reprezantan ki soti nan sourit Ldlr-/- ki te resevwa swa donatè dyabetik oswa CD donatè kontwòl 68- GFP BM. Tache Masson Trichrome (agòch) ak tach imunofluoresan pou makrofaj ki sòti nan transplantasyon BM (vèt endike pwoteyin vèt fliyoresan [GFP]) oswa tout makrofaj (wouj endike galèktin -3 [GAL3]). Kantifikasyon imaj nan (D) volim plak (P=0.036). Done yo montre kòm mwayen±SD, analize pa 1-fason ANOVA ak tès Bonferroni post hoc (B), oswa medyàn±interquartile ranje, analize pa tès Mann-Whitney U (D); kontwole n=6, dyabetik n=9. E, Imaj rasin aortik reprezantan ki soti nan sourit Ldlr-/- ki te resevwa swa transplantasyon dyabetik oswa kontwole BM. F, Quantification nan pousantaj nwayo tache pozitif pou H3K4me3 oswa H3K27ac nan rejyon GAL3 makwofaj pozitif. Chak pwen done reprezante yon bèt endividyèl (mwayèn, 6 seksyon; n= 7 rive 10). Montre kòm vle di± SD. Analiz ANOVA yon sèl-fason. BMDM endike makrofaj ki sòti nan BM; HSC, selil souch ematopoyetik; IFN-, entèferon-; ak LPS, lipopolisakarid. *P<0.05.

Pou eksplore enpòtans byolojik seri rejyon jenomik ki pa kode sa yo (ak anfaz sou fonksyon regilasyon cis), rejyon kwomatin ki gen plis aksè nan selil dyabetik yo te asiyen nan 2 jèn ki pi pre yo (nan 10{{ 11}}0 kb) epi analize avèk Zouti Anrichisman Anotasyon Rejyon Genomik yo.33 Analiz chemen sa a te revele ogmantasyon plizyè chemen ki gen rapò ak enflamasyon, ki gen ladan aktivasyon lekosit (3.3-pliye; FDR, 0.0005). ), ak jèn ki asosye ak tolerizasyon LPS nan makrofaj (2.7-pliye; FDR, 0.0009). Pou konprann si wo glikoz nan izolasyon kapab tou pwovoke modifikasyon kwomatin, nou te itilize ATAC-seq pou gade HSC ki soti nan kontwòl ak sourit dyabetik nan absans IL-1 eksitasyon. HSC ki pa stimule yo te montre 357 pik diferans (FDR mwens pase oswa egal a 0.2), nan ki 51 pousan te ogmante aksè nan selil ki soti nan yon orijin dyabetik konpare ak kontwòl, ak majorite nan rejyon entwonik (48 pousan) oswa entèjenik (21 pousan).

Bay konklizyon sa yo nan HSCs, nou pwochen egzamine aksè chromatin ak ekspresyon jèn nan BMDM derive yo. Nou te fè ATAC-seq ak RNA-seq sou BMDMs soti nan kontwòl ak sourit dyabetik anba kondisyon unstimulated oswa proinflammatory stimulé (LPS plis IFN-). BMDM ki soti nan sourit dyabetik te montre diferans ki genyen aksesiblite kwomatin nan kondisyon san stimulation, ak 1047 rejyon diferans (FDR).<0.05; Figure 6A) but only 40 differentially open regions (FDR <0.05) after stimulation (Figure 6B). In contrast, unstimulated BMDMs from diabetic mice differentially express 632 genes (324 upregulated expression and 308 downregulated expression; Excel File II in the Data Supplement) compared with unstimulated control BMDMs, but this increases to 1348 genes (802 increased and 546 decreased; Excel File III in the Data Supplement) on stimulation (FDR <0.05; fold change >1.5). Ansanm, done ATAC-seq ak RNAseq sijere ke dyabèt prime macrophages pou yon repons ekzajere nan estimilis proenflamatwa a.

Figi 6. Dyabèt chanje nivo H3K4me3 ak H3K27ac ak aksè chromatin. Trase MA nan tout tès pou transposaz aksesib a sekans chromatin chromatin li nan (A) san stimul oswa (B) estimile makrofaj ki sòti nan mwèl zo (BMDMs), kote pik ak aksè diferans (pousantaj dekouvèt fo).<0.05, fold change >1.5) yo make nan woz (1047 unstimulated, 40 stimulated, n=6). C, Rejyon varyab H3K4me3 ak H3K27ac quantifier pa sekans imunoprecipitation chromatin nan selil souch ematopoyetik (HSCs) ak BMDMs soti nan kontwòl kont sourit dyabetik (n=6 pou chak gwoup). D, Istogram pwoteksyon an mwayèn nan H3K27ac ak K3K4me3 nan HSCs, BMDMs unstimulated, ak proinflammatory stimulé BMDMs (lipopolysaccharide [LPS] plis entèferon- [IFN]) nan sit kòmanse transcription ± 1 kb nan pwoteyin-kode jèn ki toupre rejyon ki ogmante. aksesiblite nan BMDM ki pa ankouraje (vs kontwòl; n=405) ak konpare ak nivo background nan rejyon ki pa seleksyone yo.

We further undertook an unbiased examination of the relationship between differential gene expression and altered chromatin accessibility in the diabetic BMDMs. We annotated the nearest or overlapping gene for each region of differentially accessible chromatin in BMDMs (M0 state) from diabetic mice versus controls. For genes within this set that were also DE (cutoff FDR, 0.1; log fold change >0.5 pou chak), nou konpare chanjman pliye pou diferans ATAC-seq pik kont chanjman pli pou DE. Egzamine kòm varyab kontinyèl, te gen yon korelasyon fò ant chanjman nan chromatin ak ekspresyon jèn ki pwòch (R=0.65; P<1×10−6).

Furthermore, to ascertain the nature of diabetes-induced chromatin modifications, we undertook ChIPseq in HSCs and BMDMs from control versus diabetic mice (n=6 per group). Diabetic HSCs and BMDMs were distinguishable from control samples based on the quantification of both H3K27ac and H3K4me3 histone modifications (Figure 6C), and we confirmed these results by Western blot analysis (Figure VIII in the Data Supplement). To integrate the ChIP-seq and ATACseq data, we examined the distribution of H3K4me3 and H3K27ac histone modifications in the regions of open chromatin that were identified by ATACseq in unstimulated diabetic BMDMs. A majority of these regions were identified as enhancers, located >1 kb soti nan sit yo kòmanse transcription anote yo. Nou konsantre sou jèn ki toupre améliorant sa yo paske rejyon pwomotè jèn yo (sit kòmanse transcription ± 1 kb) reprezante objektif regilasyon ki gen plis chans. ATAC-seq te idantifye 405 rejyon nan chromatin diferan ouvè (P<0.05) in BMDMs derived from diabetic mice versus control mice under basal conditions. In the HSCs from diabetic mice, there was a marked increase in promoter-associated H3K27ac compared with control HSCs (Figure 6D). 

Figi 6. Dyabèt chanje nivo H3K4me3 ak H3K27ac ak aksè chromatin. Trase MA nan tout tès pou transposaz aksesib a sekans chromatin chromatin li nan (A) san stimul oswa (B) estimile makrofaj ki sòti nan mwèl zo (BMDMs), kote pik ak aksè diferans (pousantaj dekouvèt fo).<0.05, fold change >1.5) yo make nan woz (1047 unstimulated, 40 stimulated, n=6). C, Rejyon varyab H3K4me3 ak H3K27ac quantifier pa sekans imunoprecipitation chromatin nan selil souch ematopoyetik (HSCs) ak BMDMs soti nan kontwòl kont sourit dyabetik (n=6 pou chak gwoup). D, Istogram pwoteksyon an mwayèn nan H3K27ac ak K3K4me3 nan HSCs, BMDMs unstimulated, ak proinflammatory stimulé BMDMs (lipopolysaccharide [LPS] plis entèferon- [IFN]) nan sit kòmanse transcription ± 1 kb nan pwoteyin-kode jèn ki toupre rejyon ki ogmante. aksesiblite nan BMDM ki pa ankouraje (vs kontwòl; n=405) ak konpare ak nivo background nan rejyon ki pa seleksyone yo.

Diferans sa yo diminye nan BMDMs (Figi 6D), an pati akòz ogmantasyon H3K27ac nan selil orijin ki pa dyabetik apre diferansyasyon. Sepandan, mak H3K4me3 la te ogmante nan pwomotè sa yo nan HSC, ak diferans ki ka idantifye ki pèsiste nan makrofaj diferansye, ki gen ladan apre eksitasyon cytokine (Figi 6D). Modèl sa a nan mak H3K27ac pasajè ak H3K4me3 ki pèsistan an konsistan avèk rezilta nou yo nan tou de kilti tisi (Figi VIII nan Sipleman Done) ak imunohistochimi nan makrofaj plak sourit (Figi 5E ak 5F).

Zòn nan chromatin diferan ouvè idantifye pa ATAC-seq yo te trè siyifikativman asosye ak chanjman nan transkripsyon nan jèn yo pwòch. Anplis de sa, kantite diferans ki genyen nan aksè chromatin (dyabèt kont kontwòl) ak konparezon dirèk ak chanjman nan nivo ekspresyon mRNA nan jèn ki pwòch yo te trè korelasyon (R=0.5; P=6.2e). -15; Figi 7A). Pou egzamine efè sa yo nan kote genomik ki enpòtan yo, nou konbine done ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-seq, ak H3K27ac ChIP-seq nan pwomotè 2 jèn ki te deja enplike nan iminite antrene ki pwovoke glikoliz ak pwodwi ki enplike nan kondwi enflamasyon. -6) ak metabolis glikoz (Hk1). Jèn sa yo te montre rejyon kwomatin aksesib nan sit kòmanse transkripsyon yo, ak pik H3K4me3 ak H3K27ac ki asosye nan loci jenomik sa yo (Figi 7B).

Pou jwenn yon konesans sou ki faktè transkripsyon ta ka enplike kòm medyatè nan modèl sa a nan iminite fòmasyon ipèglisemi-induit, Motif Enrichment Analysis33 te fèt sou rejyon nan chromatin ak aksè ogmante nan kondisyon dyabetik. Motif faktè transkripsyon anrichi siyifikativman enkli RUNX1 (FDR, 0.0001), ki te deja asosye ak memwa iminolojik,46 osi byen ke PU.1 (FDR, 0.04) ak CCCTC-obligatwa. faktè (FDR, 1.8 × 10−7; Figi 8A). Lè nou te enplike faktè transkripsyon RUNX147 la ki baze sou aksè nan motif obligatwa, nou te envestige si RUNX1 sib jèn yo te siyifikativman surreprezante nan mitan jèn DE nan LPS plis IFN--stimulé BMDMs. Analiz sa a te idantifye 95 nan 1348 jèn DE kòm sib RUNX1 (P<0.05; odds ratio, 1.3; RUNX1 binding site P<0.05; Figure 8B and full differential gene list with RUNX1 target genes marked in Excel File VII in the Data Supplement), confirming its relevance in these disease-modifying cells. To test for RUNX1 involvement in human disease, we interrogated the gene expression of macrophages obtained from carotid atherosclerotic plaques of patients with or without diabetes (Excel File I in the Data Supplement). LCM was used to isolate macrophages from human carotid atherosclerosis plaques in patients undergoing clinically driven endarterectomy. Figure 8C shows the DE genes between diabetic and nondiabetic plaque macrophages (FDR <0.2) and highlights in red the RUNX1-associated genes (further detailed in Figure IX in the Data Supplement). RUNX1 target genes were significantly overrepresented among the DE genes, even more so when target binding sites were more stringently restricted: At a binding site P<0.05, 12 of 106 DE genes were among the 1251 RUNX1 targets (P=0.03; odds ratio, 2.0). These target genes include diabetes-induced DE of atherosclerosis-relevant genes such as Traf3ip3 (log fold change, 0.56; FDR, 0.02),48 Crnkl1 (log fold change, 0.63; FDR, 0.04),49 and Pla2g5 (log fold change, 0.16; FDR, 0.1).50

Pou etabli si wi ou non pwofil fonksyonèl makwofaj plak imen an matche ak makwofaj sourit yo, nou konpare li ak seri 39 jèn M1 ak M2 ak yon ekspresyon ki te mezire nan BMDM ankouraje soti nan sourit dyabetik kont sourit kontwòl (Figi 3G). Sa yo te rezime pa pozitif oswa negatif chanjman pliye (dyabetik kont kontwòl) ak konpare ak chanjman ki ekivalan nan makrofaj yo plak imen nan pasyan ki gen dyabèt tip 2 (kont kontwòl). Yon tès egzak Fisher te montre yon relasyon enpòtan ant BMDM sourit la ak seri done makrofaj plak moun pou jèn yo regilasyon oswa downregulated nan sijè dyabetik kont kontwòl (P=0.0155; rapò chans, 6.83).

Having shown a hyperglycemia-induced trained immunity phenotype in mouse HSCs and BMDMs and confirmed shared transcriptional features with macrophages from human plaques, we hypothesized that circulating human blood cells from patients with diabetes might also show evidence of priming. We obtained PBMCs from patients with type 2 diabetes and control subjects without diabetes matched for age and body mass index (Figure X in the Data Supplement). After isolation, PBMCs were restored to normal glucose conditions (5 mmol/L) in tissue culture for 24 hours. Comparing transcriptomes in basal conditions and after stimulation with LPS+IFN-γ, we found that the cells derived from patients with diabetes showed DE of >3000 jèn konpare ak kontwòl ki pa dyabetik matche. Analiz anrichisman seri jèn yo te montre yon anrichisman pozitif nan PBMC dyabetik ankouraje (kont kontwòl) pou chemen Hallmark, ki gen ladan repons enflamatwa (P=1.70 × 10−5) ak IL-6 JAK STAT3 siyal ( P=0.0221), ak chemen Reactome, ki gen ladan espès oksijèn reyaktif ak pwodiksyon espès nitwojèn reyaktif (P=0.0049), IL-/IL- siyal (P=0.0110) , ak Toll-like reseptè 1/2 kaskad (P=0.0033). Chemen sa yo demontre ke selil periferik sa yo te montre tou karakteristik priming menm jan ak sa nou rapòte nan BMDM nan sourit dyabetik (Figi 3G).

Anfen, pou plis eksplore yon posib wòl kozatif pou RUNX1 nan repons iminite fòmasyon ipèglisemi-induit, BMDM ki te deja diferansye nan glikoz fizyolojik oswa segondè yo te retabli nan 5 mmol / L glikoz ak Lè sa a, ankouraje nan absans la oswa prezans nan famasi RUNX la. 1-inibitè espesifik Ro5-333551 (Figi 8D). Selil diferansye nan gwo glikoz parèt ogmante ekspresyon Il-6 (2-pliye, P<0.001) and Il-1β (2.1-fold, P<0.001), despite normalization of glucose levels (Figure 8E and 8F and Figure XIb and XIc n the Data Supplement). Ro5-3335 normalized heightened Il-6 and Il-1β expression in a dose-dependent manner (Figure 8E and 8F), with the starting effective dose (0.5 µmol/L) being equal to the Ro5-3335 IC50 value.52

Figi 8. Yon wòl pou iminite fòmasyon RUNX1 pwovoke ipèglisemi. Top 3 faktè transkripsyon yo idantifye nan yon tès pou sekans chromatin aksesib transposaz (ATAC-seq) pik diferanman anrichi (A) HSC dyabetik ki pa stimule (n=3) konpare ak selil souch ematopoyetik kontwòl san stimulation (HSCs; n{{6) }}). Gwoupman yerarchik san sipèvizyon jèn ki eksprime diferan nan analiz sekans RNA (RNA-seq) analiz (B) dyabetik (n=6) ​​oswa kontwòl (n=6) makwofaj ki sòti mwèl zo (BM) (BMDMs) ankouraje ak lipopolisakarid (LPS) plis entèferon- (IFN-). Gwoupman yerarchik san sipèvizyon jèn ki eksprime diferan ki soti nan (C) dyabetik (n=8) oswa kontwòl (n=16) lazè kaptire echantiyon makwofaj plak karotid moun mikwodisseke. B ak C, Faktè transkripsyon ki gen rapò ak Runt 1 (Runx1) sib jèn (RUNX1) (P<0.05 stringency) are highlighted in red to the left of the heat map. Wild-type (WT) BM was differentiated into BMDMs in physiological (5 mmol/L) or high (20 mmol/L) glucose, rested for 2 days in 5 mmol/L glucose, and then stimulated in 5 mmol/L glucose±varying concentrations of Ro5-3335, (D) as illustrated. M1 gene expression of (E) Il-6 and (F) Il-1β assessed by quantitative polymerase chain reaction; data normalized to B2m expression. Data displayed as mean±SD, 2-way ANOVA with Bonferroni post hoc. Sample n=5 individual animals. FC indicates fold change. *P<0.05; ***P<0.001.

DISKISYON

Gwo pousantaj konplikasyon kadyovaskilè pèsiste nan pasyan ki gen dyabèt malgre kontwòl glikoz entansif.52 Isit la, nou bay prèv ki montre ipèglisemi pwovoke iminite antrene nan HSCs ak makrofaj e ke sa a ansibleman agrave ateroskleroz. Nou montre ke ipèglisemi pwovoke modifikasyon ki pèsistan nan BM HSCs nan kondwi glikoliz aerobic, ki mennen nan modèl patikilye nan aksè chromatin, ak prèv pou yon eta priming proinflammatory ki pèsiste nan makrofaj diferansye. Konklizyon nou yo enplike faktè transkripsyon, sitou RUNX1, kòm medyatè iminite ki resevwa fòmasyon. Anpèchman famasi nan RUNX1 retire manifestasyon sa yo nan iminite antrene ipèglisemi-induit nan vitro.

Chanjman nan metabolis selilè ka pwovoke iminite antrene, yon tèm ki vle di memwa iminitè natirèl la ki ka devlope apre eksitasyon brèf ak pwodwi mikwòb oswa sibstans aterojenik andojèn, ki gen ladan LDL oksidize ak lipoprotein(a).53 Pou egzanp, iminite antrene pwovoke pa glukan , yon eleman selil-miray Candida albicans, se medyatè nan aktivasyon nan dektin-1–Akt–mTOR–HIF-1, ki lakòz yon chanjman soti nan fosforilasyon oksidatif nan glikoliz aerobic (efè Warburg). 18 Vreman vre, plizyè metabolit ki soti nan glikoliz ak sik asid trikarboksilik aji kòm kofaktè pou anzim ki modifye histon, ki an vire detèmine aksè nan chromatin; pou egzanp, histon acetyltransferase ak deacetylases mande pou acetyl-CoA ak NAD plis, tandiske demethylases tankou Tet ak JmjC itilize -ketoglutarate kòm yon kofaktè.19,54 Dènyèman, règleman an metabolik nan ekspresyon jèn enflamatwa makrofaj yo te lye dirèkteman ak modifikasyon an histon. asetilasyon ki sòti nan ogmante nivo laktat.55

Lyen dirèk ant metabolis glikoz ak modifikasyon epigenetik, makonnen ak obsèvasyon ki sijere memwa ipèglisemi nan pasyan ki gen dyabèt, te mennen nou nan ipotèz ke ipèglisemi tèt li ka mennen chanjman nan metabolis selilè, ki mennen nan memwa iminitè natirèl nan dyabèt. Nan ka a nan -glucan, ogmante glikoliz aerobic nan makrofaj te lakòz ogmante trimethylation histon 3 Lys4 (H3K4me3) ak histon 3 Lys27 asetilasyon (H3K27ac). Tou de makè modifikasyon kwomatin sa yo te ogmante nan yon kontèks glikoliz ki gen anpil glikoz. Jan yo te demontre isit la ak nan etid anvan yo, te gen anrichisman nan H3K4me3 sou pwomotè jèn ki gen rapò ak enflamasyon (egzanp, Il-6) ak metabolis glikoz (egzanp, Hk1). fumarate yo rapòte yo aji kòm antagonis nan histon ak ADN demethylases,54 ak konsistan avèk sa a, nou menm tou nou te jwenn ke metabolit sik asid trikarboxilik siksin ak malat yo ogmante nan selil hyperglycemic.

Metropolis et al20 te montre ke, nan yon kontèks iminite natirèl -glucan-induit nan zansèt selil myeloid, cytokines ka medyatè iminite ki antrene. Espesyalman, anpèchman IL-1 ak antagonis reseptè anakinra an anpeche iminite antrene -glucan-induit. Yo montre tou ke rejim oksidantal yo pwovoke repwogram epijenetik nan selil ansanèt BM yo, ki mennen ale nan yon iminite ki antrene ki soti nan enflamasome, ki enplike chemen siyal IL-1 nan iminite ki antrene.56 Etandone IL-1 medyatè plizyè pwosesis patolojik. nan dyabèt,44 nou te egzamine si IL-1 ta ogmante efè glikoz wo nan devlopman iminite ki antrene. Malgre ke dyabèt pou kont li te montre efè sou aksè chromatin (ak analiz motif ki enplike PU.1, RUNX1, ak CCCTCbinding faktè), efè IL-1, nan kontèks selil ki te prime pa dyabèt, te menm plis pwononse ( ak enplike ERG, ZNF263 [zenk dwèt pwoteyin 263], ak RUNX1). Sa a sijere yon relasyon yerarchize nan ki macrophages yo te prime pa ipèglisemi men manifeste chanjman plis florid an repons a yon dezyèm estimilis. Pou egzanp, byenke IFN- pa kapab aktive anpil jèn LPS-induzibl, li ka pwovoke asetilasyon histon ak renovasyon chromatin nan pwomotè yo, kidonk priming selil la pou deklanchman nan lavni an repons a LPS.57.

Analiz motif nan sit chromatin louvri detekte yon anrichisman nan sit obligatwa RUNX1. Soti nan yon pèspektiv fonksyonèl, RUNX1 obligatwa pou jenerasyon ak antretyen nan HSC yo ak diferansyasyon an nan plizyè linyon. -1) reseptè, ki esansyèl pou siviv, diferansyasyon, ak ekspansyon makrofaj yo.59 Ki gen rapò ak efè memwa fonksyonèl ke nou obsève nan adezyon monosit, RUNX1 se tou yon kontwolè enpòtan nan entèraksyon monosit-endothelium atravè la. regilasyon lenfosit fonksyon ki asosye antijèn 1/CD11a.31 Finalman, Toll-like reseptè 4-medyatè enflamasyon ak surespresyon RUNX1 ogmante pwodiksyon Toll-like reseptè 4-induit IL-6 ak IL-1 jiska RUNX1 obligatwa nan faktè nikleyè-κB subunit p50 a, synergizing kòm yon coactivator transcriptional.60 Ansanm, gen prèv pou dirèk dirèksyon fò nan fonksyon RUNX1 nan macrophages nan direksyon reglemante pwosesis ki enpòtan nan atherogenesis.

Se poutèt sa, nou fè kwa-referans jèn anba kontwòl RUNX1 ak pwofil transkripsyon selil ki sòti nan BMDM sourit ak nan makrofaj ki soti nan yon anviwònman imen ki enpòtan nan vivo. Makrofaj plak ateroskleroz imen ak BMDM yo, nan prezans dyabèt, te montre DE nan RUNX1-jèn reglemante, ki gen ladan plizyè ki te deja lye ak enflamasyon ak ateroskleroz. ke makrofaj imen ki sòti nan dyabèt kiltive pou 6 jou nan vitro kenbe priming proinflammatory ak hyperpolarize nan yon fenotip proinflammatory lè ankouraje ak LPS ak IFN- oswa faktè nekwoz timè-.

Enteresan, kèk nan jèn sib RUNX1 sa yo montre ogmante ekspresyon nan makrofaj plak soti nan pasyan ki gen dyabèt, sètadi CRNKL1, ak PLA2G5, tandiske lòt moun, tankou ZNF32 (zenk dwèt pwoteyin 32) ak NUP214 (nukleoporin 214), parèt pi ba ekspresyon nan dyabetik kont moun ki pa dyabetik. makrofaj plak. Malgre ke sa a ka parèt enkonsistan, RUNX1 yo te demontre tou de ankouraje ekspresyon jèn ak aji kòm yon represor transcriptional. ak chromatin ka kontribye nan idantite pitit pitit selil yo. Pou egzanp, dezòd nan entèraksyon RUNX1 pandan mitoz mennen nan tranzisyon epithelial-a-mesenchymal.64 Anpèchman famakolojik nan RUNX1 ak Ro5-3335 nòmalize ekspresyon jèn enflamatwa ki chanje ki asosye ak iminite antrene in vitro ipèglisemi-induit. Entèvansyon vize kont RUNX1 bay plis prèv ki montre patisipasyon RUNX1 nan efè en nan iminite antrene ipèglisemi nan makrofaj yo.

Endiksyon iminite antrene ki pwovoke ipèglisemi nan makrofaj periferik yo pou kont yo te kapab lakòz pwogresyon maladi a, men yo te bay efè alontèm iminite antrene yo ak lavi relativman kout nan selil myeloid periferik yo, nou te rezone ke iminite ki antrene te tou gen anpil chans pou yo te pwovoke. nan nivo HSC yo, jan yo te demontre dènyèman pou -glucan ak rejim oksidantal yo.20 Malgre ke etid anvan yo te tipikman ki gen rapò ak chanjman epigenetik nan iminite antrene nan yon fenotip in vitro (egzanp, pwodiksyon sitokin), nou montre kijan iminite antrene dirèkteman. kondwi pwogresyon nan ateroskleroz, yon patoloji enpòtan ak yon eleman enflamatwa entegral. Transplantasyon BM soti nan sourit dyabetik nan sourit normoglisemi ki gen tandans ateroskleroz te gen yon efè enpòtan sou pwogresyon blesi yo e li te asosye ak ogmante nwayo nekrotik lipid rich, ki konsistan avèk fòm agresif ateroskleroz yo wè nan dyabèt nan imen.65

Etid sa a bati sou yon egzamen sou efè glikoz wo/ipèglisemi. Pou pèmèt nou karakterize efè alontèm ipèglisemi, karakteristik kadinal dyabèt, nou te itilize modèl sourit streptozotocin nan dyabèt olye ke yon modèl sourit dyabèt tip 2, ki ta ka enkòpore karakteristik plis nuans nan sendwòm sa a men ki ta efektivman konfonn. etid sou efè glikoz. Gen diferans materyèl enpòtan ant dyabèt tip 1 ak tip 2. Sepandan, ipèglisemi komen nan dyagnostik yo, kondwi risk kadyovaskilè nan chak, e li te sib prensipal nan tretman ak siveyans pou tou de kalite dyabèt pandan plizyè ane. Nou espere ke iminite antrene ki fèk idantifye ipèglisemi a rapòte isit la pral elabore alavni pou pran an kont modilasyon plis espesifik sou anpil lòt enfliyans potansyèl (egzanp, sik dyetetik, 66 modèl elevasyon glikoz, 67 ipèlipidemi koncomitan57).

Konklizyon nou yo gen enplikasyon enpòtan pou jesyon konplikasyon ateroskleroz dyabèt. Sa ki pi enpòtan, karakteristik proatherogenic nan selil myeloid ak précurseurs BM pèsiste apre nòmalizasyon nan glikoz nan san. Sa a ka ede eksplike mank de efikasite nan tretman konvansyonèl ak fondamantalman defi apwòch la nan jesyon an nan risk vaskilè ak konplikasyon nan dyabèt. Idantifikasyon chofè metabolik yo ak modifikasyon epijenetik patikilye rekòmande tou potansyèl nouvo objektif ki ka geri ou.

ENFÒMASYON ATIK

Resevwa 27 fevriye 2020; aksepte 23 jen 2021.

Afilyasyon

Divizyon Medsin kadyovaskilè, Depatman Medsin Radcliffe, University of Oxford, UK (LE, NA, ATB, JB, JTC, MA, KZ, RA, TJC, MJC, KMC, RC, RPC). Sant Rechèch CeMM pou Medsin Molekilè nan Akademi Ostralyen Syans yo, Vyèn, Otrich (TK, AFR, CB). Divizyon Fizyolojik Chimi II, Depatman Medikal byochimik ak byofizik, Karolinska Institutet, Stockholm, Syèd (HG-A., CEW). Depatman Medsin Respiratwa ak Alèji (HG-A., CEW) ak Depatman Medsin (H7) (JL, MR), Karolinska University Hospital, Stockholm, Syèd. Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK (ALC, TEK, IAU). Enstiti entèlijans atifisyèl ak sipò pou desizyon, Sant pou estatistik medikal, enfòmatik, ak sistèm entèlijan, Inivèsite medikal nan Vyèn, Otrich (CB). Bioinfo, Plantagenet, ON, Kanada (MEL). Depatman Medsin Entèn, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Netherlands (NPR., MGN). Depatman jenomik ak imunoregulasyon, Enstiti Syans Lavi ak Medikal (LIMES), University of Bonn, Almay (MGN).

Rekonesans

Otè yo remèsye Lisa Heather, Maria da Luz Sousa Fiahlo, ak Thomas Milne pou asistans yo. RPC, NA, ak LE te vin ansent etid la. LE te fè tout eksperyans nan vitro, analiz ekspresyon jèn, ak imunoblot ki dekri. MA kontribye nan etid yo nan echantiyon imen. CEW ak HG-A. fè metabolomik ki baze sou espektometri mas. JTC te fè travay makwofaj makwofaj imen LCM ak preparasyon etalaj. LE te fè eksperyans Seahorse Bioanalyser anba gidans JB ak sipèvizyon MJCALC epi li te fè analiz klasman selilè. LE te prepare echantiyon RNA-seq. LE te prepare echantiyon ATAC-seq anba gidans TEK ak sipèvizyon IAU. NA te fè tout preparasyon selil ChIP-sekans. TK ak AFR te fè sekans anba sipèvizyon CB. MEL ak ATB te kouri aliyman done sekans, nòmalizasyon, ak kontwòl kalite, ak LE fè analiz en. MEL ak ATB te fè analiz done etalaj ak sekans. KZ, RA, ak RC te dirije envestigasyon bèt yo. LE, NA, TJC, NPR, ak MGN te patisipe nan konsepsyon eksperimantal ak ekzekisyon. RPC, LE, NA, ak MEL te prepare maniskri a. Tout otè li epi apwouve soumèt final maniskri a.

Sous Finansman

Travay sa a te sipòte pa Britanik Heart Foundation Center of Research Excellence Oxford (RE/13/1/30181), British Heart Foundation Project Grant (Dr Akbar and Choudhury: PG/18/53/33895), Enstiti Nasyonal pou Rechèch Sante. Oxford Biomedical Research Center, Tripartite Immunometabolism Consortium–Novo Nordisk Foundation (sibvansyon NNF15CC0018486; Dr Choudhury, Udalova, Rydén, Channon, and Wheelock), Enflamasyon ki gen rapò ak metabolit nan Maladi Dyabèt-Espèk: Nouvo Sib BeyondMekRIADlucoo Foundation , sibvansyon 0064142; Doktè Choudhury, Udalova, Rydén, ak Channon), ak yon Ph.D. etidyan ak Doris Field Trust (Dr. Edgar). Gwoup Genomics High-Throughput nan Wellcome Trust Center for Human Genetics te finanse pa referans sibvansyon Wellcome Trust 090532/Z/09/Z ak sibvansyon MRC Hub G0900747 91070. Etablisman Sekans Biomedikal nan Sant Rechèch CeMM pou Medsin Molekilè nan Akademi Ostralyen Syans nan Vyèn Otrich. Doktè Riksen ak Netea te resevwa finansman nan men pwogram rechèch ak inovasyon Horizon 2020 Inyon Ewopeyen an anba akò sibvansyon 667837. Doktè Netea te sipòte pa yon ERC Consolidator Grant (No 310372) ak Òganizasyon Netherlands pou rechèch syantifik.

Divilgasyon

Okenn.

Materyèl siplemantè

Done Sipleman Figi I–XI

Done Sipleman Fichye Excel I–VII

REFERANS

1. Asosyasyon Ameriken Dyabèt. Maladi kadyovaskilè ak jesyon risk. Swen Dyabèt. 2015;38:S49–S57. doi: 10.2337/dc15-S011

2. Nathan DM, Cleary PA, Backlund JY, Genuth SM, Lachin JM, Orchard TJ, Raskin P, Zinman B; Esè pou Kontwòl ak Konplikasyon Dyabèt/Epidemyoloji Entèvansyon ak Konplikasyon Dyabèt (DCCT/EDIC) Etid Gwoup Rechèch. Tretman entansif dyabèt ak maladi kadyovaskilè nan pasyan ki gen dyabèt tip 1. N Engl J Med. 2005;353:2643–2653. doi: 10.1056/NEJMoa052187

3. Nathan DM, Genuth S, Lachin J, Cleary P, Crofford O, Davis M, Rand L, Siebert C, Kontwòl Dyabèt ak Konplikasyon Trial Research Group. Efè a nan tretman entansif nan dyabèt sou devlopman ak pwogresyon nan konplikasyon alontèm nan ensilin-depandan dyabèt melitus. N Engl J Med. 1993;329:977–986. Doi: 10.1056/NEJM199309303291401

4. ACCORD, Gerstein HC, Miller ME, Genuth S, Ismail-Beigi F, Buse JB, Goff DC Jr, Probstfield JL, Cushman WC, Ginsberg HN, Bigger JT, et al. Efè alontèm nan bese glikoz entansif sou rezilta kadyovaskilè. N Engl J Med. 2011;364:818–828. doi: 10.1056/NEJMoa1006524

5. Zinman B, Wanner C, Lachin JM, Fitchett D, Bluhmki E, Hantel S, Mattheus M, Devins T, Johansen OE, Woerle HJ, et al; Envestigatè EMPA-REG OUTOME. Empagliflozin, rezilta kadyovaskilè, ak mòtalite nan dyabèt tip 2. N Engl J Med. 2015;373:2117–2128. doi: 10.1056/NEJMoa1504720

6. Newman JD, Vani AK, Aleman JO, Weintraub HS, Berger JS, Schwartzbard AZ. Peyizaj la chanje nan terapi dyabèt pou rediksyon risk kadyovaskilè: JACC eta-of-atizay revizyon. J Am Coll Cardiol. 2018;72:1856– 1869. doi: 10.1016/j.jacc.2018.07.071

7. Chalmers J, Cooper ME. UKPDS ak efè eritaj la. N Engl J Med. 2008;359:1618–1620. doi: 10.1056/NEJMe0807625

8. Moore KJ, Sheedy FJ, Fisher EA. Macrophages nan ateroskleroz: yon balans dinamik. Nat Rev Immunol. 2013;13:709–721. doi: 10.1038/nri3520

9. Martinez FO, Gordon S. M1 ak M2 paradigm nan aktivasyon macrophage: tan pou reevalyasyon. F1000Prime Rep 2014;6:13. doi: 10.12703/P6-13

10. Parathath S, Grauer L, Huang LS, Sanson M, Distel E, Goldberg IJ, Fisher EA. Dyabèt afekte macrophages yo pandan regresyon plak ateroskleroz nan sourit yo. Dyabèt. 2011;60:1759–1769. doi: 10.2337/db10-0778

11. Shanmugam N, Reddy MA, Guha M, Natarajan R. Ekspresyon segondè glikoz pwovoke nan proinflammatory cytokine ak chemokine jèn nan selil monositik. Dyabèt. 2003;52:1256–1264. doi: 10.2337/diabetes.52.5.1256

12. O'Neill LA, Pearce EJ. Immunometabolism gouvène selil dendritik ak fonksyon makrofaj yo. J Exp Med. 2016;213:15–23. doi: 10.1084/jem.20151570

13. Vats D, Mukundan L, Odegaard JI, Zhang L, Smith KL, Morel CR, Wagner RA, Greaves DR, Murray PJ, Chawla A. Metabolis oksidatif ak PGC-1beta atenye enflamasyon macrophage-medyatè. Selil Metab. 2006;4:13– 24. doi: 10.1016/j.cmet.2006.05.011

14. Tannahill GM, Curtis AM, Adamik J, Palsson-McDermott EM, McGettrick AF, Goel G, Frezza C, Bernard NJ, Kelly B, Foley NH, et al. Succinate se yon siyal enflamatwa ki pwovoke IL-1 atravè HIF-1. Lanati. 2013;496:238–242. doi: 10.1038/nature11986

15. Renner K, Singer K, Koehl GE, Geissler EK, Peter K, Siska PJ, Kreutz M. Karakteristik metabolik timè ak selil iminitè nan mikroanvironman timè a. Avant Immunol. 2017;8:248. doi: 10.3389/fimmu.2017.00248

16. Stienstra R, Netea-Maier RT, Riksen NP, Joosten LAB, Netea MG. Repwogram espesifik ak konplèks nan metabolis selilè nan selil myeloid pandan repons iminitè natirèl yo. Selil Metab. 2017;26:142–156. doi: 10.1016/j.cmet.2017.06.001

17. Bekkering S, Arts RJW, Novakovic B, Kourtzelis I, van der Heijden CDCC, Li Y, Popa CD, Ter Horst R, van Tuijl J, Netea-Maier RT, et al. Endiksyon metabolik nan iminite antrene atravè chemen mevalonate la. Selil. 2018;172:135–146.e9. doi: 10.1016/j.cell.2017.11.025

18. Cheng SC, Quintin J, Cramer RA, Shepardson KM, Saeed S, Kumar V, Giamarellos-Bourboulis EJ, Martens JH, Rao NA, Aghajanirefah A, et al. mTOR- ak HIF-1 -medyatè glikoliz aerobic kòm baz metabolik pou iminite antrene. Syans. 2014;345:1250684. doi: 10.1126/ science.1250684

19. Donohoe DR, Bultman SJ. Metaboloepigenetics: entèrelasyon ant metabolis enèji ak kontwòl epigenetik ekspresyon jèn. J Cell Physiol. 2012;227:3169–3177. doi: 10.1002/jcp.24054

20. Mitroulis I, Ruppova K, Wang B, Chen LS, Grzybek M, Grinenko T, Eugster A, Troullinaki M, Palladini A, Kourtzelis I, et al. Modulation myelopoiesis progenitors se yon eleman entegral nan iminite ki resevwa fòmasyon. Selil. 2018;172:147– 161.e12. doi: 10.1016/j.cell.2017.11.03421. Choudhury RP, Rong JX, Trogan E, Elmalem VI, Dansky HM, Breslow JL, Witztum JL, Fallon JT, Fisher EA. Lipoprotein ki gen gwo dansite yo retade pwogresyon ateroskleroz la ak blesi yo byen remodel san yo pa elimine endis enflamasyon oswa oksidasyon. Arterioscler Tromb Vasc Biol. 2004;24:1904–1909. doi: 10.1161/01.ATV.0000142808.34602.25

22. Feig JE, Vengrenyuk Y, Reiser V, Wu C, Statnikov A, Aliferis CF, Garabedian MJ, Fisher EA, Puig O. Regression ateroskleroz karakterize pa gwo chanjman nan plak makrofaj transcriptome a. PLoS Youn. 2012;7:e39790. doi: 10.1371/journal.pone.0039790

23. Trogan E, Choudhury RP, Dansky HM, Rong JX, Breslow JL, Fisher EA. Lazè kaptire analiz mikrodiseksyon nan ekspresyon jèn nan makrofaj soti nan blesi ateroskleroz nan apolipoprotein E-defisi sourit. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99:2234–2239. doi: 10.1073/pnas.042683999

24. Huber W, Carey VJ, Gentleman R, Anders S, Carlson M, Carvalho BS, Bravo HC, Davis S, Gatto L, Girke T, et al. Orchestration analiz jenomik wo-debi ak Bioconductor. Metòd Nat. 2015;12:115–121. doi: 10.1038/nmeth.3252

25. Dunning MJ, Smith ML, Ritchie ME, Tavaré S. Beadarray: R klas ak metòd pou done Illumina ki baze sou chaplèt. Bioenfòmatik. 2007;23:2183– 2184. doi: 10.1093/bioinformatics/btm311

26. Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, Smyth GK. Limma pouvwa analiz ekspresyon diferans pou etid RNA-sekans ak mikroarray. Asid nikleik Res. 2015;43:e47. doi: 10.1093/nar/gkv007

27. Kamleh MA, Snowden SG, Grapov D, Blackburn GJ, Watson DG, Xu N, Ståhle M, Wheelock CE. Metabolomik LC-MS nan pasyan psoriasis revele ogmantasyon maladi severite-depandan nan sikile asid amine ki amelyore pa tretman anti-TNF. J Proteome Res. 2015;14:557–566. doi: 10.1021/pr500782g

28. Buenrostro JD, Wu B, Chang HY, Greenleaf WJ. ATAC-seq: yon metòd pou analize aksesiblite chromatin nan tout genòm. Curr Protoc Mol Biol. 2015;109:21.29.1–21.29.9. doi: 10.1002/0471142727.mb2129s109

29. Zhang Y, Liu T, Meyer CA, Eeckhoute J, Johnson DS, Bernstein BE, Nusbaum C, Myers RM, Brown M, Li W, et al. Modèl ki baze sou analiz de ChIPSeq (MACS). Genomic Biol. 2008;9:R137. doi: 10.1186/gb-2008-9-9-r137

30. Ross-Innes CS, Stark R, Teschendorff AE, Holmes KA, Ali HR, Dunning MJ, Brown GD, Gojis O, Ellis IO, Green AR, et al. Diferans reseptè estwojèn obligatwa ki asosye ak rezilta klinik nan kansè nan tete. Lanati. 2012;481:389–393. doi: 10.1038/nature10730

31. Puig-Kröger A, Sanchez-Elsner T, Ruiz N, Andreu EJ, Prosper F, Jensen UB, Gil J, Erickson P, Drabkin H, Groner Y, et al. RUNX/AML ak C/EBP faktè kontwole ekspresyon entegrin CD11a nan selil myeloid atravè eleman regilasyon sipèpoze. San. 2003;102:3252–3261. doi: 10.1182/ san-2003-02-0618

32. McLean CY, Bristor D, Hiller M, Clarke SL, Schaar BT, Lowe CB, Wenger AM, Bejerano G. GREAT amelyore entèpretasyon fonksyonèl nan rejyon cis-regilasyon. Nat Biotechnol. 2010;28:495–501. doi: 10.1038/not.1630

33. Machanick P, Bailey TL. MEME-ChIP: analiz motif gwo done ADN. Bioenfòmatik. 2011;27:1696–1697. doi: 10.1093/bioinformatics/btr189

34. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, ​​Chaisson M, Gingeras TR. STAR: ultrarapid inivèsèl RNA-seq aligner. Bioenfòmatik. 2013;29:15–21. doi: 10.1093/bioinformatics/bts635

35. McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Analiz ekspresyon diferan nan eksperyans RNA-Seq miltifaktè konsènan varyasyon byolojik. Asid nikleik Res. 2012;40:4288–4297. doi: 10.1093/nar/gks042

36. Kolde R. Joli Heatmap. 2015. Aksè 24 jen 2021. https://rdrr.io/ can/heatmap/

37. Freemerman AJ, Johnson AR, Sacks GN, Milner JJ, Kirk EL, Troester MA, Macintyre AN, Goraksha-Hicks P, Rathmell JC, Makowski L. Reprogrammation metabolik nan macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1) -medyatè metabolis glikoz kondui yon fenotip pro-enflamatwa. J Biol Chem. 2014;289:7884–7896. doi: 10.1074/jbc.M113.522037

38. Herbin O, Regelmann AG, Ramkhelawon B, Weinstein EG, Moore KJ, Alexandropoulos K. Adhesion monosit ak rekritman plak pandan devlopman ateroskleroz reglemante pa pwoteyin adaptè ChatH/SHEP1. Arterioscler Tromb Vasc Biol. 2016;36:1791–1801. doi: 10.1161/ATVBAHA.116.308014

39. Luo Y, Duan H, Qian Y, Feng L, Wu Z, Wang F, Feng J, Yang D, Qin Z, Yan X. Macrophagic CD146 ankouraje fòmasyon selil kim ak retansyon pandan ateroskleroz. Selil Res. 2017;27:352–372. doi: 10.1038/cr.2017.8

40. Iqbal AJ, McNeill E, Kapellos TS, Regan-Komito D, Norman S, Burd S, Smart N, Machemer DE, Stylianou E, McShane H, et al. Moun CD68 pwomotè GFP transgenic sourit pèmèt yon analiz de diferansyasyon monosit-a-macrophage nan vivo. San. 2014;124:e33–e44. doi: 10.1182/san-2014-04-568691

41. Arts RJW, Carvalho A, La Rocca C, Palma C, Rodrigues F, Silvestre R, Kleinnijenhuis J, Lachmandas E, Gonçalves LG, Belinha A, et al. Chemen imunometabolik nan iminite fòmasyon BCG-induit. Rep. selil 2016;17:2562–2571. doi: 10.1016/j.celrep.2016.11.011

42. Moorlag SJCFM, Röring RJ, Joosten LAB, Netea MG. Wòl fanmi interleukin-1 nan iminite antrene. Immunol Rev. 2018;281:28–39. doi: 10.1111/or.12617

43. Herder C, Dalmas E, Böni-Schnetzler M, Donath MY. Chemen IL-1 nan dyabèt tip 2 ak konplikasyon kadyovaskilè. Tandans Endocrinol Metab. 2015;26:551–563. doi: 10.1016/j.tem.2015.08.001

44. Engelbertsen D, Rattik S, Wigren M, Vallejo J, Marinkovic G, Schiopu A, Björkbacka H, ​​Nilsson J, Bengtsson E. IL-1R, ak MyD88 siyal nan CD4 plis selil T ankouraje Th17 iminite ak ateroskleroz. . Cardiovasc Res. 2018;114:180–187. doi: 10.1093/cvr/cvx196

45. Nagareddy PR, Kraakman M, Masters SL, Stirzaker RA, Gorman DJ, Grant RW, Dragoljevic D, Hong ES, Abdel-Latif A, Smyth SS, et al. Makrofaj tisi adipoz ankouraje myelopoiesis ak monocytosis nan obezite. Selil Metab. 2014;19:821–835. doi: 10.1016/j.cmet.2014.03.029

46. ​​Bevington SL, Cauchy P, Piper J, Bertrand E, Lalli N, Jarvis RC, Gilding LN, Ott S, Bonifer C, Cockerill PN. Priming chromatin enduzib ki asosye ak etablisman memwa iminolojik nan selil T yo. EMBO J. 2016;35:515–535. doi: 10.15252/bj.201592534

47. Buske FA, Bodén M, Bauer DC, Bailey TL. Bay wòl motif regilasyon ADN lè l sèvi avèk jenomik konparatif. Bioenfòmatik. 2010;26:860–866. doi: 10.1093/bioinformatics/btq049

48. Puig O, Yuan J, Stepaniants S, Zieba R, Zycband E, Morris M, Coulter S, Yu X, Menke J, Woods J, et al. Yon siyati ekspresyon jèn ki klase plak ateroskleroz imen pa sitiyasyon enflamasyon relatif. Circ Cardiovasc Genet. 2011;4:595–604. doi: 10.1161/CIRCGENETICS.111.960773

49. Turner RJ, Bushnell CD, Register TC, Sharp FR. Korelasyon ki depann de sèks nan epesè entima-medya karotid ak ekspresyon jèn nan san. Transl Stroke Res. 2011;2:171–178. fè: 10.1007/s12975-011-0066-4

50. Webb NR, Bostrom MA, Szilvassy SJ, van der Westhuyzen DR, Daugherty A, de Beer FC. Gwoup macrophage-eksprime IIA sekretè fosfolipaz A2 ogmante fòmasyon blesi ateroskleroz nan sourit ki pa gen anpil reseptè LDL. Arterioscler Tromb Vasc Biol. 2003;23:263–268. doi: 10.1161/01.atv.0000051701.90972.e5

51. Cunningham L, Finckbeiner S, Hyde RK, Southall N, Marugan J, Yedavalli VR, Dehdashti SJ, Reinhold WC, Alemu L, Zhao L, et al. Idantifikasyon benzodyazepine Ro5-3335 kòm yon inibitè nan lesemi CBF atravè ekran kantite gwo debi kont entèraksyon RUNX1-CBF. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:14592–14597. doi: 10.1073/pnas.1200037109

52. Reaven PD, Emanuele NV, Wiitala WL, Bahn GD, Reda DJ, McCarren M, Duckworth WC, Hayward RA; Envestigatè VADT yo. Kontwòl glikoz entansif nan pasyan ki gen dyabèt tip 2: 15-swiv ane. N Engl J Med. 2019;380:2215–2224. doi: 10.1056/NEJMoa1806802

53. Arts RJ, Joosten LA, Netea MG. Sikui imunometabolik nan iminite ki antrene. Semin Immunol. 2016;28:425–430. doi: 10.1016/j.smim.2016.09.00254. Quintin J, Saeed S, Martens JHA, Giamarellos-Bourboulis EJ, Ifrim DC, Logie C, Jacobs L, Jansen T, Kullberg BJ, Wijmenga C, et al. Enfeksyon Candida albicans bay pwoteksyon kont re-enfeksyon atravè repwogram fonksyonèl nan monosit. Mikwòb lame selilè. 2012;12:223–232. fè: 10.1016/j. com.2012.06.006

55. Zhang D, Tang Z, Huang H, Zhou G, Cui C, Weng Y, Liu W, Kim S, Lee S, Perez-Neut M, et al. Règleman metabolik ekspresyon jèn pa asetilasyon histon. Lanati. 2019;574:575–580. fè: 10.1038/s41586-019-1678-1

56. Christ A, Günther P, Lauterbach MAR, Duewell P, Biswas D, Pelka K, Scholz CJ, Oosting M, Haendler K, Baßler K, et al. Rejim lwès la deklannche NLRP3-repwogramasyon iminitè natirèl. Selil. 2018;172:162–175.e14. doi: 10.1016/j.cell.2017.12.013

57. Glass CK, Natoli G. Molekilè kontwòl deklanchman ak priming nan macrophages. Nat Immunol. 2016;17:26–33. doi: 10.1038/ni.3306

58. Voon DC, Hor YT, Ito Y. Konplèks RUNX la: rive pi lwen pase hematopoiesis nan iminite. Iminoloji. 2015;146:523–536. doi: 10.1111/imm.12535

59. Himes SR, Cronau S, Mulford C, Hume DA. Faktè transkripsyon Runx1 kontwole CSF-1-depandan ak endepandan kwasans ak siviv makwofaj yo. Onkogene. 2005;24:5278–5286. fè: 10.1038/SJ. onc.1208657

60. Zhang S, Yu M, Guo Q, Li R, Li G, Tan S, Li X, Wei Y, Wu M. Annexin A2 mare nan endosomes ak kontwole negatif TLR4-repons enflamatwa deklanche atravè TRAM- chemen TRIF. Sci Rep 2015;5:15859. doi: 10.1038/srep15859

61. Alrdahe S, Al Sadoun H, Torbica T, McKenzie EA, Bowling FL, Boulton AJM, Mace KA. Disregulation nan devlopman makrofaj ak fenotip nan makrofaj dyabetik imen ka sove pa transduction pwoteyin Hoxa3. PLoS Youn. 2019;14:e0223980. doi: 10.1371/journal.pone.0223980

62. Durst KL, Hiebert SW. Wòl manm fanmi RUNX nan represyon transkripsyon ak silans jèn. Onkogene. 2004;23:4220–4224. doi: 10.1038/sj.onc.1207122

63. Amann JM, Nip J, Strom DK, Lutterbach B, Harada H, Lenny N, Downing JR, Meyers S, Hiebert SW. ETO, yon sib t (8; 21) nan lesemi egi, fè kontak diferan ak deacetylases histon miltip ak mare mSin3A atravè domèn oligomerization li yo. Mol selil Biol. 2001;21:6470–6483. doi: 10.1128/MCB.21.19.6470-6483.2001

64. Rose JT, Moskovitz E, Boyd JR, Gordon JA, Bouffard NA, Fritz AJ, Illendula A, Bushweller JH, Lian JB, Stein JL, et al. Anpèchman konplèks faktè transkripsyon RUNX1-CBF a konpwomèt idantite selil epitelyal mamè: yon fenotip ki kapab estabilize pa makèt jèn mitotik. Oncotarget. 2020;11:2512–2530. doi: 10.18632/oncotarget.27637

65. Moreno PR, Murcia AM, Palacios IF, Leon MN, Bernardi VH, Fuster V, Fallon JT. Konpozisyon kowonè ak enfiltrasyon macrophage nan espesimèn atherectomy nan pasyan ki gen dyabèt melitus. Sikilasyon. 2000;102:2180– 2184. doi: 10.1161/01.cir.102.18.2180

66. Perazza LR, Mitchell PL, Jensen BAH, Daniel N, Boyer M, Varin TV, Bouchareb R, Nachbar RT, Bouchard M, Blais M, et al. Sucrose dyetetik pwovoke enflamasyon metabolik ak maladi ateroskleroz kadyovaskilè plis pase grès dyetetik nan sourit LDLr-/-ApoB100/100. Ateroskleroz. 2020;304:9–21. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2020.05.002

67. Flynn MC, Kraakman MJ, Tikellis C, Lee MKS, Hanssen NMJ, Kammoun HL, Pickering RJ, Dragoljevic D, Al-Sharea A, Barrett TJ, et al. Tanporè ipèglisemi tanzantan akselere ateroskleroz pa ankouraje myelopoiesis. Circ Res. 2020;127:877–892. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.120. 316653

Laurence Edgar, DPhil*; Naveed Akbar, Ph.D.*; Adam T. Braithwaite, Ph.D.; Thomas Krausgruber, Ph.D.; Héctor Gallart-Ayala, Ph.D.; Jade Bailey, DPhil; Alastair L. Corbin, DPhil; Tariq E. Khoyratty, DPhil; Joshua T. Chai, DPhil; Mohammad Alkhalil, DPhil; André F. Rendeiro, Ph.D.; Klemen Ziberna, DPhil; Ritu Arya, MRes; Thomas J. Cahill, DPhil; Christoph Bock, Ph.D.; Jurga Laurencikiene, Ph.D.; Mark J. Crabtree, Ph.D.; Madeleine E. Lemieux, Ph.D.; Niels P. Riksen, MD, Ph.D.; Mihai G. Netea, MD, Ph.D.; Craig E. Wheelock, Ph.D.; Keith M. Channon, MD; Mikael Rydén, MD, Ph.D.; Irina A. Udalova, Ph.D.; Ricardo Carnicer, Ph.D.; Robin P. Choudhury, DM.

For more information:1950477648nn@gmail.com