Idantifikasyon ak analiz fonksyonèl nan yon bifavone kòm yon nouvo inibitè nan reseptè tranzitwa potansyèl vanilloid 4-depandan pwosesis aterojenik

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou konnen plis

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman

Ateroskleroz, yon maladi enflamatwa pwogresif nan gwo atè, konstitye kontribitè prensipal la nan fado k ap grandi nan mòtalite ak morbidite ki gen rapò ak maladi kadyovaskilè globalman1. Evènman inisyativ esansyèl ki mennen nan ateroskleroz enplike retansyon patikil modifye lipoprotein ba-dansite (oxLDL) nan espas entim aortik subendothelial yo sitou nan pwen branch atè yo2. Pandan atherogenesis bonè, apre malfonksyònman andotelyal, monosit san k ap sikile yo transmigre nan zòn entim yo, epi diferansye nan makrofaj tisi yo3. Nan espas entim aortik, makwofaj yo kole ak absorption oxLDL ak èd pa reseptè scavenger tankou SRA ak CD36 kreye yon bouk atero-enflamatwa feedforward ki lakòz devlopman nan selil kim ki chaje lipid, yon pwosesis kritik nan ateroskleroz2-8. Cascades nan evènman yo-enflamatwa pwovoke pa selil kim mennen nan fòmasyon nan yon tras byen bonè gra ak evantyèlman aparans nan blesi ateroskleroz avanse karakterize pa prezans nan bouchon fib, tisi kalsifye, selil iminitè, pwoteyin matris, ak lipid2-10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) nan subfanmi TRPV a, se yon kanal kasyon ki pa selektif, polimodal pèmeyab nan Ca2 plus ki eksprime toupatou nan divès kalite selil ki gen ladan macrophages11–24. Anvan li te ye kòm yon osmosensor, TRPV4 se kounye a li te ye pou reponn a divès kalite stimuli byochimik ak byomekanik ki gen ladan chalè, rèd matris, osmolarite, faktè kwasans, pH, ak 4 estè phorbol11-24. Yo rapòte TRPV4 medyatè plizyè fonksyon fizyolojik tankou sansasyon doulè nan enflamasyon ak neropati18,22,23, diferansyasyon myofibroblast ak migrasyon 17,25,26, ak diferansyasyon osteoclast nan zo a27. Mitasyon TRPV4 yo te asosye ak plizyè channelopathies28-31. Dènye etid pa gwoup nou an ak lòt moun te enplike yon wòl posib chanèl sa a nan myriad kondisyon patolojik tankou blesi nan poumon22,32, fòmasyon selil kim14,16, fbrosis tisi17,33, repons kò etranje13, ak kansè34,35. Précédemment, yo te montre yon wòl ateroprotektif TRPV4, nan ki fonksyon TRPV4 pwodui chimik agonist-induit nan selil andotelyal yo te montre yo asosye ak aktivasyon eNOS ak anpèchman adezyon monosit nan selil andotelyal36. Kontrèman, defisyans nan fonksyon TRPV4 yo te lye ak anpil repons ateroinfamatwa ki gen ladan malfonksyònman andotelyal, redwi jenerasyon selil makrofaj kim, ak maladi vaskilè14,16,37-39. Laboratwa nou an dènyèman te idantifye yon wòl proatherogenic nan TRPV4 kote li kontwole fòmasyon selil kim makrofaj oxLDL-induit. Mekanistikman, nou te montre TRPV4 afekte absòpsyon oxLDL nan makrofaj yo, men li pa lye, nan yon fason endepandan CD36-14. Nan yon lòt etid, nou te rapòte yon vin pi grav depandan TRPV nan fòmasyon selil kim oxLDL-induit nan prezans lipopolysaccharide ak ogmante rèd matris, konsa bay yon lyen ant mechanosensing ak risk pou ateroskleroz16. Konsidere tout ansanm, rezilta sa yo sijere TRPV4 kòm yon sib atire nan ateroskleroz ak lòt maladi, kidonk ankouraje dekouvèt inibitè ti molekil TRPV4 ki ka tradui nan terapetik klinikman efikas. Itilizasyon yo nan konpoze natirèl nan terapetik yo te genyen enpòtans, prensipalman kondwi pa bezwen an pou yon pri-efikas ak byokonpatib konpoze konpare ak dwòg sentetik ki egziste kounye a. Konpoze natirèl tankouflavonoid, alkaloid,polifenol, ak kurkuminoid, afekte maladi kadyovaskilè atravè mekanis divès tankou anpèchman nanproenflamatwasiyal, sansibilizasyon ensilin, ak amelyore pwofil lipid san yo lè w vize chemen AMPK, COX1/2, eNOS, ak Nrf2 40-45. Dènye etid pa plizyè gwoup te idantifye de flavonoid, berberine, ak apigenin, kòm modilateur potansyèl nan aktivite TRPV446,47. Nou te devlope epi itilize yon metòd tès depistaj semi-wo debi pou idantifye potansyèl antagonis TRPV4 nan yon bibliyotèk nan konpoze natirèl lè l sèvi avèk yon Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) ki baze sou Ca2 plis esè foul. Isit la, nou rapòte idantifikasyon ak analiz fonksyonèl nan Linkedin, yon flavon, kòm yon inibitè roman nan TRPV4-depandan pwosesis aterojenik nan makrofaj, kidonk mete yon fondasyon pou plis etid nan konpoze natirèl sa a kòm yon natirèl anti-ateroskleroz ti. molekil konpoze. Linkedin te rapòte montre neuroprotective,anti-kanserojèn, epianti-enflamatwawòl48,49. Nou rapòte mekanis aksyon Linkedin kont TRPV4 nan anviwònman fòmasyon selil makrofaj kim lè l sèvi avèk anpil analiz byochimik ak selilè.

Tanpri klike la a pou w konnen plis

Materyèl ak metòd kilti bèt ak selil

Nou te achte sourit C57BL/6 sovaj (WT) konjenik nan Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). Yo te swiv direktiv Komite Swen ak Itilizasyon Animal University of Maryland pou tout eksperyans bèt yo epi otè yo te respekte direktiv ARRIVE. Pou izòlman thioglycolate-induced murin rezidan macrophages (MRM), lavaj peritoneal yo te kolekte apre 4 jou nan piki entraperitoneal thioglycolate, ak selil yo te kenbe nan 10 pousan fetal serom bovine (FBS) ki gen DMEM7,14,16. Yon liy selil makwofaj murin (RAW264.7), ak fibroblast po imen (HDF) yo te achte nan men ATCC (Manassas, VA), epi yo te kiltive, respektivman, ak DMEM oswa MEM (Gibco, Waltham, MA). Yo te rekòlte makrofaj ki sòti nan mwèl zo murin (BMDMs) soti nan 6- a 7-sourit ki gen yon semèn, jan sa te dekri deja14,50,51. Yon ti tan, femur ki soti nan sourit WT ak TRPV4 KO yo te kolekte, epi mwèl zo nan femur yo te lanse ak medya konplè DMEM ak 10 pousan FBS. Selil mwèl zo ki sispann yo te filtre nan yon filtre 70 µm (BD biosyans), santrifuje, epi kenbe yo nan mwayen DMEM ki konplete ak M-CSF (25 ng/mL) pou 7-8 jou nan 37 degre pou pèmèt diferansyasyon nan makrofaj.

Reyaktif

Linkedin ak GSK1016790A (GSK101) te achte nan men Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), ak twous tès FLIPR Calcium 6 yo te jwenn nan Molecular Device (Sunnyvale, CA). Moun natif natal LDL (VLDL) te achte nan Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada). Nou enkube LDL ak 5 µM CuSO4 pou 12 èdtan nan 37 degre pou prepare LDL kwiv-oksidize (oxLDL) 7,14,16. Fluoresan lank ki make, DiI-oxLDL, te achte nan men Invitrogen (Carlsbad, CA), ak MCSF nan R & D (Minneapolis, MN). Antikò pou analiz FACS yo te: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4, ak TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). Antikò segondè ki konjige PE yo te soti nan R&D (Minneapolis, MN), ak kontwòl izotip PE-konjige yo te soti nan BD (Franklin Lake, NJ). Pou reyaksyon chèn polymerase quantitative (qRT-PCR), nou itilize twous RNeasy ki soti nan QIAGEN (Redwood City, CA). Tout primè yo te achte nan men Bio-Rad (Hercules, CA). Medya kilti selilè, pwodwi ki gen rapò ak kilti selilè, ak reyaktif Western blot yo te jwenn nan Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche pou anti-fatig

Depistaj semi-wo debi

Nou te antreprann yon tès depistaj semi-wo debi pou antagonis Trpv4 ki soti nan yon bibliyotèk 2000 konpoze natirèl (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) lè l sèvi avèk yon lektè plak imaj fluorometrik (FLIPR) ki baze sou analiz kalsyòm 14,17. Nou idantifye ginkgetin (GGT), kòm yon antagonis roman TRPV4. Yo te fè tès depistaj prensipal ak segondè ak RAW264.7, HDF, ak BMDM pou evalye kapasite Linkedin ak lòt kandida yo pou anpeche TRPV4-pwodwi Ca2 plis infux14,17. Kòm kontwòl, nou te itilize A23187, yon ionofò kalsyòm, TRPV4 nil BMDMs, ak GSK219, yon antagonist TRPV4 selektif17. Apre tès depistaj segondè a, nou idantifye sis konpoze ki montre plis pase twa fwa anpèchman TRPV4-medyatè Ca2 plis aflu konpare ak kontwòl machin. Linkedin te idantifye kòm inibitè ki pi pisan nan aktivite TRPV4. BMDMs (5 × 104 selil/byen) yo te simen nan kolagen-kouvwi (10 µg/ml) 96-byen klè anba plak nwa ak enkubasyon nan 37 degre, 5 pousan CO2. Jou eksperyans lan, selil yo te chaje ak kalsyòm 6 lank nan HBSS, 20 mM HEPES, 2.5 mM probenecid epi yo te enkube pou 45 min nan 37 degre. Apre enkubasyon, konpoze bibliyotèk yo te ajoute nan chak pi nan yon konsantrasyon final nan 2 µM. Plak yo te enkube pou yon lòt 45 minit nan 37 degre. Ca2 plis foul te pwovoke pa adisyon a nan 10 nM nan TRPV4 agonist GSK1016790A nan selil veyikil oswa konpoze-pretrete epi anrejistre pa mezire ΔF/F (Max-Min), jan sa te dekri deja17. Done yo montre kòm inite fluoresans relatif (RFU).

Immunoblots

Yo te simen makrofaj peritoneal Thioglycolate-pwodwi nan 10 pousan FBS ki gen DMEM epi yo te enkube lannwit lan. Selil ki pa respekte yo te lave, epi yo te ajoute 1 pousan albumin serik bovine (BSA) ki gen DMEM nan plak la epi yo te enkube pou 3 èdtan anvan tretman Linkedin. Pou detèmine ekspresyon CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6, ak GAPDH pwoteyin yo te prepare lisat selil antye nan selil yo trete lannwit lan ak Linkedin (1 ak 5 µM) oswa machin nan prezans oswa absans oxLDL (25 µg/ml). ). Pou detèmine nivo ekspresyon p-JNK ak JNK ki deklanche LPS, selil yo te pretrete ak Linkedin (5 ak 10 µM) pou 3 èdtan epi answit ankouraje ak E. coli LPS pou 30 min. Lysates antye-selil yo te prepare nan selil de fwa lave (PBS glas frèt) lè l sèvi avèk tanpon RIPA ak te ajoute bwason inhibitor proteaz (Thermo Scientific, MA). Blots yo te sonde ak lapen anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jerizalèm, Izrayèl), anti-sourit CD36 (R&D, Minneapolis, MN), lapen anti-TLR4, lapen anti-TLR6, lapen anti-JNK, ak lapen anti-p- Antikò prensipal JNK (siyal selilè, Danvers, MA) ki te swiv pa antikò segondè anti-lapen ak anti-sourit HRP-konjige (R&D, Minneapolis, MN). Blots yo te retire ak re-sonde ak anti-GAPDH IgG (1: 2000; Santa Cruz, Dallas, TX) pou kontwòl chaj.

Fòmasyon selil kim.MRM ki deklanche Thioglycolate yo te simen sou kouvèti vè nan yon plak 12 byen ak DMEM, 10 pousan FBS ak enkubasyon nan 37 degre, 5 pousan CO2 pou 2 èdtan. GGT (1 oswa 10 µM) te ajoute nan selil yo, epi apre 3 èdtan nan enkubasyon, oxLDL (50 µg/ml) te ajoute, ak kilti yo te enkube lannwit lan nan 37 degre. LDL natif natal (50 ug/ml) te ajoute nan pwi gwoup kontwòl ak enkubasyon lannwit lan. Selil yo te fikse nan 4 pousan paraformaldehyde ki te swiv pa lwil oliv wouj O tach pou quantifier jenerasyon selil kim.

Transdiksyon vektè adenoviris.Nou kolekte konstriksyon Adenovirus pou eksprime Ad(RGD)-sourit TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml), ak vektè vid adenovirus, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), soti nan Vector Biolabs, Malvern, PA. Nou itilize 1 × 108 pfu/ml pou tout eksperyans. Pou etid jenerasyon selil kim, macrophages peritoneal sourit yo te enkube ak Ade-TRPV4 oswa Ade-Vec nan medya DMEM pou 72 èdtan anvan adisyon oxLDL pou jenere selil kim makrofaj yo.

Liaison ak absorption de ox-LDL.Pou evalye lyezon, makrofaj peritoneal yo te trete ak de dòz (1 oswa 10 µM) nan Linkedin oswa machin pou 3 èdtan ak enkubasyon ak DiI-oxLDL nan 4 degre pou yon èdtan. Apre pre-tretman ak Linkedin oswa machin, selil yo te enkube ak DiI-oxLDL nan 37 degre pou 30 minit pou evalye absorption. Imaj yo te kaptire pa mikwoskospi fluoresans (63x), epi yo te itilize Imaj J pou quantifier rezilta yo.

Analiz sikometri koule.Thioglycolate-elicite macrophages peritoneal yo te kiltive nan DMEM, 10 pousan FBS pou 24 èdtan. Selil ki pa respekte yo te lave yo, yo te ajoute mwayen san serom, epi selil yo te enkube pou 2 èdtan ki te swiv pa adisyon nan 5 µM GGT oswa machin, epi yo te kontinye enkubasyon pou 3 èdtan. Selil trete yo te grate sou plak la epi yo te resispann nan PBS, 2 pousan BSA. Selil yo te enkubasyon ak antikò prensipal pou 45 min ki te swiv pa 30 min enkubasyon ak PE-konjige antikò segondè. Yo te itilize yon sitomèt koule FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Kanada) pou jwenn done. Tout done yo te trete lè l sèvi avèk lojisyèl FlowJo.

qRT-PCR.Yo te trete macrophages Thioglycolate-induit ak 5 µM Linkedin oswa machin pou 3 h; Yo te ajoute 25 µg/ml oxLDL nan veyikil la oswa nan selil ki trete Linkedin yo, epi yo te kontinye enkubasyon lannwit lan. Yo te itilize RNeasy Micro Kit (#74,004) ki soti nan QIAGEN pou ekstrè RNA total, epi yo te itilize yon Twous Universal SYBR Green One-Step ki soti nan Bio-Rad pou ranvèse transkripsyon RNA a. Yo te itilize yon C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) pou jwenn done. Ekspresyon jèn yo te detèmine kòm kantite mRNA espesifik ki gen rapò ak mRNA GAPDH lè l sèvi avèk metòd konparatif CT ki dekri nan bilten itilizatè sistèm Bio-Rad qRT-PCR la.

Analiz estatistik.Done yo prezante kòm mwayen ± SEM nan triple byolojik. GraphPad Prism 7. Yo te itilize lojisyèl 0, epi yo te fè kalkil lè l sèvi avèk Tès Elèv la pou de gwoup oswa ANOVA yon sèl pou plizyè gwoup.

Apwobasyon etik.Tout eksperyans sou sourit yo te fèt an akò ak direktiv Komite Swen Enstitisyonèl Animal ak Itilizasyon (IACUC) epi yo te apwouve pa Komite Revizyon University of Maryland-College Park.

Rezilta yo in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>twa fwa; p<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Figi 1. Semi-wo debi idantifikasyon ki baze sou tès depistaj Linkedin kòm yon inibitè TRPV4 roman ki soti nan yon bibliyotèk nan konpoze natirèl. (A) Tablo koule ki montre workflow ki lakòz idantifikasyon ginkgetin kòm yon potansyèl inhibitor TRPV4 ki soti nan yon bibliyotèk 2000 konpoze natirèl. (B) Reprezantan FlexStation 3 anrejistreman ki montre efè inhibition 6 konpoze natirèl sou TRPV4 agonist (GSK1016790A)-induit Ca2 plis foul nan kalsyòm 6 BMDMs dye-chaje pandan tès depistaj segondè. Pretretman ak tout 6 konpoze te montre efè inhibition sou TRPV4-depandan Ca2 plis foul konpare ak selil pretrete ak veyikil (kontwòl negatif; veyikil plis GSK1016790A (10 nM)) oswa ionofò kalsyòm (A23187, 2 μM). Nou itilize selektif TRPV4 antagonist, GSK2193874 (10 nM), kòm yon kontwòl negatif. Tout eksperyans yo te repete twa fwa an kat fwa. RFU: Inite fluoresans relatif.

Anpèchman TRPV4 pa GGT anile fòmasyon selil kim makwofaj oxLDL-induit.Etid anvan nou yo te montre ke TRPV4-pwovoke Ca2 plis aflu ki enplike nan fòmasyon selil kim oxLDL-medyatè 14,16. Se poutèt sa, nou evalye posiblite pou fòmasyon selil kim te anpeche pa GGT-medyatè antagonizasyon nan aktivite TRPV4. Yo te enkube makwofaj peritoneal murin sovaj ak oxLDL pou pwovoke fòmasyon selil kim nan prezans oswa absans GGT, epi yo te analize pa tach lwil oliv wouj O. Kòm espere, nou te jwenn ke jenerasyon an nan selil kim ogmante pa senk fwa nan makrofaj oxLDL trete an konparezon ak LDL natif natal (Fig. 2A, B). Sepandan, tretman makwofaj yo ak GGT (1 oswa 10 µM) anvan eksitasyon ak oxLDL siyifikativman diminye pousantaj nan selil kim (Fig. 2A, B). Ansanm, rezilta sa yo sijere yon efè inhibition GGT sou fòmasyon selil kim makwofaj yo posib pou vize TRPV 4-pwodwi Ca2 plis foul. Anplis de sa, nou overexpressed TRPV4 nan TRPV4 makwofaj nil lè nou itilize konstriksyon adenovirus ak Lè sa a, pwovoke fòmasyon selil kim lè nou itilize oxLDL nan prezans GGT. Nou te jwenn ke twòp ekspresyon nan TRPV4 ogmante fòmasyon nan selil kim ki te bloke lè nou pretreated selil la ak GGT, sijere ke anpèchman nan fòmasyon an selil kim proatherogenic pa GGT se TRPV4 depandan (Fig. 2C, D).

GGT pa bloke nivo fondamantal ekspresyon TRPV4 ak reseptè enflamatwa yo.Scavenger reseptè CD36 jwe yon gwo wòl nan absorption ak obligatwa oxLDL, ak fòmasyon selil kim, pwosesis kritik nan ateroskleroz4-7,54,55. Dènyèman, yon kantite prèv k ap grandi sijere patisipasyon nan reseptè toll-like nan ateroskleroz2,4,56. Pou mennen ankèt sou si GGT bloke fòmasyon selil kim atravè ekspresyon CD36, TLR4, TLR6, ak TRPV4, nou te fè analiz imunoblot nan de konsantrasyon GGT (1 oswa 5 µM). Nou te jwenn nivo ekspresyon ki sanble CD36, TRPV4, TLR6, ak TLR4 an konparezon ak kontwòl ki pa trete (figi 3A-D). Flow cytometric analiz tou revele pa gen okenn diferans enpòtan nan ekspresyon sifas selil pwoteyin yo avèk oswa san tretman GGT (figi 3E-H, I-L). Lè nou konsidere tout ansanm, rezilta sa yo sijere ke GGT bloke fòmasyon selil makrofaj kim san yo pa anpeche nivo fondamantal ekspresyon sifas TRPV4, CD36, TLR4, ak TLR6.

Figi 2. Anpèchman nan TRPV4 pa Linkedin abroge fòmasyon selil kim makrofaj oxLDL-induit. (A) Yo te trete makwofaj peritoneal murin Thioglycolate ki te pwovoke lannwit lan ak 50 µg/ml oxLDL, ki te swiv pa yon preinkubasyon 3 èdtan ak machin oswa 1 oswa 10 µM Linkedin. Selil yo te trete ak 50 µg/mL natif natal LDL (VLDL) kòm kontwòl. Agrandisman orijinal: 40x. (B) Kantifikasyon rezilta yo montre nan (A). n=500 selil/kondisyon. T-tès elèv la; ***p<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Absorption oxLDL, men pa obligatwa pa macrophages siprime pa GGT. Paske TRPV4 te deja montre yo gen yon wòl nan absorption nan oxLDL ak fòmasyon selil kim14,16, nou evalye si tretman ak GGT te lakòz andikap nan obligatwa nan oxLDL sou sifas la macrophage. WT macrophages peritoneal yo te trete ak GGT anvan enkubasyon ak DiI-oxLDL nan 4 degre, epi yo te evalye obligatwa. Rezilta yo endike ke lyezon oxLDL sou sifas makrofaj la pa t siyifikativman anpeche tretman GGT (1 oswa 10 µM) konpare ak kontwòl machin (Fig. 5A-C). Lè nou te etabli ke GGT pa anpeche obligatwa oxLDL, nou te vize pou detèmine si tretman GGT te afekte absòpsyon oxLDL nan makrofaj yo. Enteresan, rezilta nou yo te endike ke te gen siyifikatif anpèchman nan absorption nan oxLDL nan makrofaj nan selil GGT pretrete kòm konpare ak gwoup la veyikil-trete (Fig. 6A, B). Lè nou konsidere tout ansanm, rezilta sa yo sijere ke GGT bloke absorption nan oxLDL, men li pa obligatwa, nan makrofaj.

GGT bloke ekspresyon TRPV4 pwovoke oxLDL nan makrofaj yo.

Kòm etid nou yo te pibliye deja te montre ke TRPV4-pwovoke Ca2 plis jwe yon wòl nan fòmasyon selil kim makwofaj oxLDL-medyatè 14,16, nou t ap chèche detèmine si GGT bloke fòmasyon selil kim atravè repwesyon ekspresyon oxLDL-induit nan CD36, TLR2, TLR4, TLR6, oswa TRPV4. Nou te jwenn ke eksitasyon lannwit lan nan makrofaj ak oxLDL te lakòz yon regilasyon siyifikatif nan ekspresyon nan TRPV4 pwoteyin konpare ak LDL, pandan y ap ekspresyon nan lòt reseptè (CD36, TLR2, TLR4, ak TLR6) rete san okenn chanjman (figi 4A-F). Pretretman nan selil ak GGT anvan eksitasyon ak oxLDL oaza diminye nivo ekspresyon TRPV4 pwoteyin konpare ak tretman machin (Fig. 4A-F). Kolektivman, rezilta sa yo sijere yon efè inhibition nan GGT sou ekspresyon pwoteyin TRPV4, ki ka an pati patisipe nan repwesyon nan fòmasyon selil kim pa GGT.

Figi 3. Tretman Linkedin pa chanje pwoteyin total oswa ekspresyon sifas TRPV4, CD36, ak TLR nan macrophages. (A–D) Immunoblots nan lisat selil antye macrophage apre tretman lannwit lan ak 1 oswa 5 µM Linkedin oswa machin. Reprezantan imunoblots montre ekspresyon total de pwoteyin CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C), ak TLR4 (D) nan selil Linkedin-trete ak trete. Yo te fè twa repitasyon byolojik endepandan ak 3 repete eksperimantal pou chak seri eksperyans. (E-H) Flow cytometric analiz de makwofaj trete lannwit lan ak 5 µM Linkedin oswa ki pa trete ki montre ekspresyon sifas TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G), ak TLR6 (G) nan selil ki pa trete ak Linkedin-trete. Twa replike byolojik endepandan ak 30,000 selil pou chak kondisyon yo te analize. (I–L) Analiz kantitatif rezilta ki soti nan (E–H). Analize pa De-tailed t-tès ak 99 pousan entèval konfyans. Selil konte pou chak eksperyans, 30,000; de repete eksperimantal.

GGT bloke deklanchman JNK2 proatherogenic ak enflamasyon nan macrophages. Rapò ki te pibliye nan laboratwa nou an ak lòt moun yo te montre ke aktivasyon JNK2 jwe yon wòl enpòtan nan fòmasyon selil kim ak ateroskleroz7,57. Pou detèmine si GGT ta ka anpeche aktivasyon JNK1/2, yo te trete macrophages ak GGT ki te swiv pa eksitasyon ak LPS oswa oxLDL. Rezilta nan analiz immunoblot te montre ke tretman ak GGT siyifikativman siprime fosforilasyon oxLDL- oswa LPS-induit nan JNK1 / 2 kòm konpare ak kontwòl la ki pa trete oswa natif natal LDL-trete (figi 7A-D). Li te montre ke aktivasyon JNK nan makrofaj pwovoke transkripsyon medyatè proenflamatwa ki asosye ak ateroskleroz58-60. Pou detèmine si GGT te kapab bloke ekspresyon regilatè pro-enflamatwa sa yo nan makrofaj, selil GGT-pretrete yo te ankouraje ak oxLDL, ak nivo ekspresyon mRNA nan TNF, IL 6, IL12, IL1, ak MCP1 te quantifier pa analiz qRT-PCR. Nou detekte siyifikatif downregulation nan nivo ekspresyon oxLDL-induit nan TNF, IL12, IL1, ak MCP1 mRNA nan selil GGT-trete konpare ak kontwòl machin-trete (figi 7E-I). Ansanm, rezilta sa yo sijere ke GGT bloke deklanchman JNK2 proatherogenic ak ekspresyon jèn enflamatwa an repons a eksitasyon oxLDL nan makrofaj. Diskisyon Konpoze natirèl tankou flavonoid ak polifenol yo konnen modil repons kadyovaskilè atravè divès mekanis, tankou anpèchman siyal pro-enflamatwa, sansibilizasyon ensilin, estati oksidatif, ak amelyore pwoflè lipid nan san40-45. Isit la, nou rapòte idantifikasyon ki baze sou tès depistaj semi-wo debi ak karakterizasyon fonksyonèl Linkedin, yon flavon, kòm yon inibitè roman nan TRPV4-pwosesis jeni/enflamatwa depandan Prothero nan makrofaj yo. Nou espesyalman te montre ke i) blòk ginkgetin TRPV4-medyatè Ca2 plis aflu nan makrofaj, ii) blokaj ginkgetin nan fonksyon TRPV4 ansibleman diminye fòmasyon selil kim oxLDL-induit pa siprime absorption nan oxLDL nan makrofaj, ak iii) blòk ginkgetin. LPS- ak oxLDL-induit fosforilasyon nan JNK1/2, ekspresyon nan TRPV4 pwoteyin, ak ekspresyon jèn enflamatwa. An jeneral, rezilta etid nou an te montre ke ginkgetin inibit fonksyon macrophage proatherogenic/enflamatwa nan yon fason ki depann de TRPV4-. Ateroskleroz, yon maladi aortik, se okòmansman alimenté pa enflamasyon ak engorgement nan macrophages ak oxLDL, pwovoke fòmasyon nan selil kim makrofaj, ki imedyatman pwogrese nan fòme atheroma2-10. Depi fòmasyon selil kim se yon pwosesis kritik nan atherogenesis, konpreyansyon ak manipile fòmasyon selil kim ka gen potansyèl terapetik. Yo konnen makrofaj yo eksprime yon seri chanèl iyon ak ponp manbràn penetrasyon, ki gen ladan TRPV4, yon Ca2 polimodal mechanosensitive plis chanèl ion pèmeyab, ki aktive pa stimuli fizik ak byochimik11–24. Etid ki pibliye pa laboratwa nou an ak lòt moun yo te idantifye wòl TRPV4 nan enflamasyon makrofaj ak fòmasyon selil kim oxLDL-induit14-16,26. TRPV4 ka konsa sèvi kòm yon sib solid pou diminisyon nan pwosesis proatherogenic.

Figi 5. Linkedin pa siprime DiI-oxLDL obligatwa nan makrofaj. Makwofaj yo te pretrete ak veyikil oswa Linkedin (1 oswa 10 µM) pou 3 èdtan ki te swiv pa enkubasyon ak oxLDL ki make DiI (2.5 µg/mL) pou 1 èdtan nan 4 degre. (A) Reprezantan imaj mikwoskopik fliyoresan (orijinal agrandisman, 63 ×) nan DiI-oxLDL obligatwa sou sifas la manbràn macrophage (n =20 selil / kondisyon). (B) Rezilta ki soti nan eksperyans A yo montre kòm pwofil trase lè l sèvi avèk lojisyèl NIH ImageJ. (C) Analiz kantitatif rezilta ki soti nan A. n=20 selil/kondisyon. nan amelyore ateroskleroz pa diminye MMP-2 ak MMP{-9 ak ogmante nivo NO ak NOS nan aorta torasik rat52. Nan etid prezan an, nou te montre ke ginkgetin bloke TRPV4-pwovoke Ca2 plis foul nan makrofaj yo. Mekanistikman, nou te montre ke ginkgetin bloke absorption nan oxLDL, men se pa obligatwa, nan macrophages. Etid ki fèt an vivo ak in vitro sijere yon wòl kritik CD36 kòm reseptè prensipal scavenger nan absorption oxLDL ak fòmasyon selil kim makrofaj2-7. Li te montre ke sourit nil CD36 ki manke ApoE oswa LDLR yo gen mwens tandans devlope blesi ateroskleroz5,6. Syans anvan gwoup nou yo te idantifye yon wòl esansyèl nan kaskad siyal CD36-JNK nan fòmasyon selil kim makwofaj yo7. Toll-tankou reseptè TLR2, TLR4, ak TLR6 aji kòm koreseptè lè yo kominike avèk CD36 epi yo montre yo patisipe nan atherogenesis2,56,63. Nou te egzamine posibilite ke mank de fòmasyon selil kim yo te wè nan makrofaj Linkedin-trete te akòz ekspresyon diminye nan CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, oswa TLR6 pwoteyin. Enteresan, tretman Linkedin pa t 'siyifikativman diminye ekspresyon nan CD36, TLR2, TLR4, oswa TLR6 pwoteyin nan nivo fondamantal oswa anba kondisyon oxLDL ankouraje. Sepandan, Linkedin espesyalman bloke oxLDL-induit upregulation nan ekspresyon nan TRPV4 pwoteyin, pandan y ap ekspresyon li nan nivo fondamantal rete san okenn chanjman. Lè nou konsidere tout ansanm, rezilta sa yo sijere ke ginkgetin bloke fòmasyon selil kim oxLDL-induit atravè yon mekanis endepandan de ekspresyon CD36 ak TLR, men depann sou TRPV4. Etid anvan yo nan gwoup nou an ak lòt moun te montre ke deklanchman JNK2 patisipe nan fòmasyon selil kim ak devlopman blesi ateroskleroz 7,57. Yo te rapòte tou ke JNK patisipe nan modulation MMP-9 ak MMP{-13, ki twò eksprime nan blesi ateroskleroz64-68. Bay lyen ki rekonèt JNK nan pwosesis aterojenik, nou te vle detèmine si ginkgetin te kapab anpeche aktivasyon JNK. An akò ak rapò anvan yo, rezilta nou yo te montre tou ke ginkgetin bloke fosforilasyon enflamatwa estimilis-induit nan JNK2 nan macrophages. Rezilta sa a sijere yon mekanis posib pa ki Linkedin bloke fòmasyon selil kim. Anplis de sa, nou te jwenn yon downregulation siyifikatif nan ekspresyon oxLDL pwovoke nan TNF, IL12, IL1, ak MCP1 mRNA nan selil ginkgetin-trete konpare ak kontwòl machin, mete aksan sou wòl potansyèl anti-enflamatwa nan ginkgetin an repons a oxLDL. An rezime, rezilta nou yo te montre ke ginkgetin inibit fonksyon macrophage proatherogenic ak enflamatwa nan yon fason TRPV4-depandan. Konklizyon sa yo ranfòse rezon pou itilize konpoze natirèl yo nan devlopman potansyèl terapetik ak/oswa reyaktif chemopreventive.

Referans
1. Barquera, S. et al. Apèsi global sou epidemyoloji maladi kadyovaskilè ateroskleroz la. Arch. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te selilè byoloji nan macrophages nan ateroskleroz. Selil 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Enflamasyon nan ateroskleroz. Nati 407, 233-241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokines, metabolis lipid macrophage, ak selil kim: enplikasyon pou terapi maladi kadyovaskilè. Pwog. Res lipid. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. Vize dezòd nan klas B scavenger reseptè CD36 la pwoteje kont devlopman blesi ateroskleroz nan sourit. J. Clin. Envesti. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. Reseptè Scavenger klas AI/II ak CD36 yo se reseptè prensipal ki responsab pou absorption lipoprotein ki ba-dansite modifye ki mennen nan chaje lipid nan makrofaj yo. J. Biol. Chem. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. Yon kaskad siyal ki depann de CD36-nesesè pou fòmasyon selil kim makwofaj yo. Selil Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Ateroskleroz-yon maladi enflamatwa. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Te mekanis molekilè nan konplikasyon tronbotik nan ateroskleroz. J. Entèn. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Ateroskleroz. Nati 407, 233-241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Aktivasyon ultra-rapid nan chanèl ion TRPV4 pa fòs mekanik aplike nan sifas selil beta1 entegrin. Nonb antye relatif. Biol. (Camb). 2 (9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ mechanotransduction siyal aks nan matris rèd- ak TGF 1-pwovoke epithelial-mesenchymal tranzisyon. Selil Mol. Bioeng.12, 139-152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Transient reseptè potansyèl vanilloid 4 obligatwa pou repons kò etranje ak fòmasyon selil jeyan. Am. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. TRPV4 kalsyòm-pèmeyab chanèl se yon regilatè roman nan fòmasyon selil kim makwofaj oksidize LDL-induit. Radik gratis. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).