Nan Silico ki baze sou ekran konbinezon sinèrjetik dwòg soti nan medikaman zèb: yon ka itilize Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Modil neropwoteksyon

Neuroprotection se mekanis ak estrateji yo itilize pou pwoteje kont blesi newòn oswa koripsyon nan CNS apre maladi egi (egzanp konjesyon serebral oswa blesi / chòk nan sistèm nève) oswa kòm konsekans maladi neurodegenerative kwonik (egzanp Parkinson, alzayme, sklewoz miltip). Objektif neropwoteksyon an se limite malfonksyònman newòn / lanmò apre blesi CNS epi eseye kenbe pi wo a.

posib entegrite nan entèraksyon selilè nan sèvo a ki lakòz yon fonksyon neral san pwoblèm. Kòm ou ka wè nan Fig. 4, kèk sib sou wout la sinaps serotonèrgik ki enplike nan fonksyon nan neropwoteksyon. Pou egzanp, pwodiksyon prostaglandin atravè PTGS1 ak PTGS2 (yo rele tou COX-1 ak COX{-2) se yon medyatè esansyèl nan evoke anti-enflamatwa ak nouvo mekanis pou rezoud pwoblèm56. Yon etid resan te montre ke ekspresyon jèn ADCY5, yon anzim ki katalize jenerasyon cAMP57, redwi pa methylation pwomotè nan liy selil HCC imen COX-2-pwovoke58. Dapre analiz ki pi wo a, nou espekile ke akimilasyon COX-2 ka enfliyanse sekresyon sAPP, klivaj APP klivaj pa -sekretase ki module pa cAMP epi li plis egzèse efè neuroprotective59,60. Rezilta nou yo montre ke neuroprotection jwe yon wòl enpòtan nan tretman neuroinflammation.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU PREVENTION MALADI PARKINSON FONCTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Validasyon eksperimantal

Viabilite nan selil BV2 Microglia trete pa konpoze yo

Selil microglia BV2 (8 × 104 selil/ml) yo manje ak konsantrasyon 37.5 a 300 μM pou chak mililit medya kilti ki pa gen serom nan kat konpoze yo pou 24 èdtan. Nou konsidere viabilite selil gwoup kontwòl la kiltive nan absans serom ak mwens pase 0.1% DMSO kòm 100% (Fig. 5 (a–d)). Pa gen okenn sitotoksisite selilè enpòtan yo obsève nan dòz yo preskri nan gwoup yo.

Validasyon nan sinèrji dwòg ak potansyèl efè anti-enflamatwa nan vitro

Pou evalye plis rezilta yo jwenn nan silico, yo chwazi kat konpoze ki kouvri twa pè sinèrjik, sètadi isoacteoside, 2′-acetylatteoside, echinacoside, ak verbascoside, pou egzamine efè sinèrjetik dwòg yo ak potansyèl efè anti-enflamatwa lè l sèvi avèk selil BV2 trete ak LPS. An patikilye, nou fè analiz Western blot pou ekspresyon pwoteyin iNOS ak COX-2 pou konfime sinèji ak efè anti-enflamatwa konbinezon dwòg yo prevwa yo.

Jan yo montre nan Fig. 5(e–g), yo rapòte nivo pwoteyin iNOS ak COX-2 nan panèl liy selil BV2 yo teste yo. Nou obsève ke nan swa tretman izoakteozid oswa 2′-acetylatteoside, ekspresyon pwoteyin iNOS ak COX-2 nan selil BV2 yo tou de te diminye anpil nan diferan nivo dòz. Sepandan, tretman ak konbinezon isoacteoside ak 2′-acetylatteoside pwovoke yon ogmantasyon enpòtan nan faktè enflamatwa iNOS ak COX -2 (Fig. 5 (e)). Figi 5(f) montre satretman echinacoside oswa verbascoside, kòm yon sèl ajan, lakòz yon diminisyon nan ekspresyon iNOS ak COX-2. Anplis, jan yo espere, tretman ak echinacoside an konbinezon ak verbascoside nan konsantrasyon 150 μM te lakòz yon diminisyon pi pwononse nan

nivo ekspresyon pwoteyin (iNOS ak COX-2), ki endike efè sinèrjetik anti-enflamatwa konbinezon dwòg sa a. Menm jan an tou, jan sa endike nan Fig. 5 (g), konbinezon an nan echinacoside ak 2′-acetylatteoside montre yon efè sinerjetik enpòtan sou anpèchman nan COX -2 nan konsantrasyon nan 75 μM oswa 300 μM. Sepandan, pou iNOS, nan dòz la nan 300 μM, konbinezon an reprezante repwesyon make nan pwoteyin nan. Kontrèman, nou jwenn ke pa gen okenn efè anpèchman evidan sou tou de iNOS ak COX -2 sou konbinezon an nan isoacteoside ak 2′-acetylatteoside oswa echinacoside ak verbascoside nan konsantrasyon nan 75μM (Siplemantè Figi 2), san konte, tretman. ak lòt pè montre yon efè pi fèb konpare ak ajan yo sèl nan dòz la nan 150 oswa 300μM ki ka wè nan Figi 5 (e-g).

An rezime, etid in vitro a bay plis enfòmasyon pou tès depistaj konbinezon dwòg ak efè potansyèlman anti-enflamatwa epi montre fyab estrateji ekran an silico a.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU TRETMAN NEUROINFLAMMASYON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskisyon

Neuroinflammation enplike nan majorite maladi newolojik, sikyatrik, ak maladi neurodevlopman yo se pa sèlman yon konsekans men li ta ka yon deklanche patoloji a. Sepandan, tretman aktyèl pou neroenflamatwa yo se monoterapi sitou, limite pa efè segondè byen li te ye jan nou konnen, inhibiteurs COX-2 ka mennen nan domaj kadyovaskilè an repons a tretman alontèm, ak tretman ki vize TNF ka lakòz enfeksyon nan imunosuppresyon. Apwòch terapetik konbinatoryal yo ka enperatif pou amelyore tretman maladi konplèks ak avantaj sa yo: solidite rezo kontrekare ak konpansasyon kontoune, efikasite klinik ogmante pandan w ap kenbe yon toksisite minim imen, ak dòz redwi chak konpoze63. Sepandan, eksplorasyon nan konbinezon dwòg sinèrjik nan mitan konpoze ki sòti nan medikaman zèb ki baze sou sistèm famasi se restriksyon nan rezon prensipal posib pou gwo kantite konpoze.

Nan travay la, nou premye jwenn 63 potansyèl konpoze bioaktif soti nanzèb Cistanche tubulosa, ranpli kritè yo (DL Pi gwo pase oswa egal a 0.18) pou plis analiz ak èd nan prediksyon an ki endispansab pou depistaj molekil ki pi pwomèt ak pwopriyete dezirab. Apre kat 133 sib yo nan 63 potansyèl konpoze bioaktif nan baz done a, nou jwenn 43 sib ki gen rapò ak neroenflamasyon, ak Lè sa a, analiz GOBP gwoupman nan objektif yo prevwa ka pwobableman kontribye nan tretman an nan neroenflamasyon. Rezilta analyse rezo CT montre yon mwayèn degre pou chak konpoze de 11.209 ak 7.651 pou chak sib, respektivman, ak 38 nan yo ajiste plis pase 7 sib (pi gwo pase degre mwayèn). Pou egzanp, echinacoside (mol41) prevwa ak 7 sib, verbascoside (mol33), ak 9 sib, oswa tabside B (mol57), ak 8 sib ta ka jwe wòl kle nan neropwoteksyon an liy ak literati a ogmante.

Nou reyalize objektif terapetik dirèk tankou APP, MAPT (ke yo rele tou Tau), PPARG70, MMP9, MMP2, ak HTR2A (ke yo rele tou 5-HT2A), GRIN2B (reseptè ionotropik glutamate NMDA tip subunit 2B), ak GRIA1. (glutamate ionotropic reseptè AMPA kalite subunit 1) oswa en sib potansyèl tankou PTGS274 oswa NOS275 ki asosye ak neuroinflammation oswa divès maladi nan sistèm nève yo.

Analiz rezo Compound-Target-Pathway montre 12 konpoze ki soti nan 10 pi gwo pè dwòg atravè algorithm PEA a, ki konekte ak 43 sib potansyèl yo ak chemen ki lye ak neroenflamasyon, pou egzanp, chemen siyal kalsyòm, entèraksyon neuroaktif ligand-reseptè oswa TNF siyal chemen ak sou sa. Nan sistèm nan, konpoze sa yo prevwa ta ka aji sou non sèlman pwoteyin yo nan en a, men tou en wout ki asosye ak neuroinflammation ak biomarkers enflamatwa, an patikilye. Anplis, enfòmasyon adisyonèl pou tès depistaj konbinezon dwòg ak efè potansyèlman anti-enflamatwa yo bay ak fyab la nan estrateji nan ekran in silico verifye pa validation eksperimantal. Chemen neuroenflamasyon an gen ladann chemen maladi alzayme a, chemen siyal kalsyòm, chemen siyal GnRH, chemen siyal VEGF, ak sinaps serotonèrjik la. Rezilta analyse yo byen klè eksplike nou ke lanmò selil, enflamasyon, ak modil neropwoteksyon yo montre egzanp pou dechifre mekanis nan.Cistanche tubulosa pou tretman neuroinflammation.

Neuroinflammation akonpaye divès maladi neurodegenerative ki ta ka pa sèlman yon konsekans men yon deklanche nan patoloji, kidonk, terapi anti-enflamatwa yo sijere yo dwe yon apwòch tretman pwomèt. Nan desepsyon nou an, menmsi nou te reyalize limit monoterapi yo, evalyasyon ak mekanis ki kache nan terapi konbinezon yo toujou gwo defi nan devlopman nouvo estrateji altènatif la. Se poutèt sa, travay sa a ta ka ofri nouvo opòtinite terapetik pou neroenflamasyon epi li ka louvri yon nouvo avni pou dekouvri konbinezon dwòg ki soti nan pwodwi natirèl.

Materyèl ak metòd

Koleksyon Konpoze

Yon total de 66 engredyan chimik nan Cistanche tubulosa yo rasanble manyèlman nan TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, ki gen ladan 26 glikozid fenilethanoid, 22 iridoid, 4 lignans, 7 glikozid monoterpene, 2 sibstans nitwojèn, 3. benzèn acryloyl sik, 1 sterol, 1 ketol. Bay saglikozid nan Cistanche tubulosayo anjeneral idrolize libere aglycone ki Lè sa a, absòbe nan mukoza entesten an, kidonk, nou pran molekil yo san glikolik ak an konsiderasyon, ki make kòm _qt. Sa a te mennen nan jenerasyon an nan konpoze yo 103. Yo bay molekil sa yo nan Tablo Siplemantè S1.

Evalyasyon ki sanble ak dwòg

Pou jwenn potansyèl konpoze bioaktif nan Cistanche tubulosa, nou evalye resanblans dwòg la nan engredyan sa yo lè nou kalkile resanblans Tanimoto ant konpoze èrbal ak pwopriyete molekilè mwayèn nan tout pwodwi chimik yo nan baz done Drugbank la. Epi, modèl prediksyon DL la te aplike avèk siksè nan anpil etid, pou chwazi konpoze bioaktif. Nan travay la, endèks DL pi gran pase oswa egal a 0.18 kandida yo defini kòm valè papòt la pi byen adapte analiz ki vin apre yo.

Prediksyon Sib Dwòg

Idantifikasyon objektif efikasite pou konpozan dirijan yo rete yon etap kle pou pwogrese konpoze nan devlopman dwòg. Isit la, de zouti nan kay la: SysDT ak WES yo te pote soti nan dériver enfòmasyon an sib molekilè pou lapèch dwòg. SysDT se yon modèl in-solo ki fèt ak konbinezon enfòmasyon chimik, jenomik ak famasi ki baze sou de zouti matematik pwisan: Random Forest (RF) ak Support Vector Machine (SVM) pou abòde pwoblèm idantifikasyon sib la efektivman. Modèl yo jwenn te sèvi kòm yon platfòm ki gen anpil valè pou prediksyon entèraksyon dwòg-sib ak yon presizyon an jeneral nan 97.3%, yon presizyon prediksyon aktive nan 87.7%, ak yon presizyon prediksyon inibit nan 99.8%. Pou pran plis konpozan pwomèt, kritè filtraj yo defini kòm valè RF pi gran pase oswa egal a 0.7 oswa SVM pi gran pase oswa egal a 0.8 nan etid sa a.

Resanblans ansanbl pondéré (WES) se yon nouvo modèl enfòmatik pwisan pou idantifye sib dirèk dwòg la nan engredyan bioaktif aktyèl yo. Kòm yon zouti roman, modèl la jwenn fè byen nan predi obligatwa a ak yon sansiblite mwayèn nan 85% (SEN) ak modèl yo ki pa obligatwa ak 71% (SPE) ak zòn yo mwayèn anba koub yo opere reseptè (ROC, AUC) de 85.2% ak yon konkordans mwayèn de 77.5%. Objektif yo jwenn yo trase plis sou Uniprot pou nòmalize non yo ak òganis yo imedyatman. Isit la, nou sèlman chwazi objektif Homo sapiens pou plis analiz. Objektif kandida yo nan konpoze yo chwazi yo trase nan baz done CTD pou jwenn maladi ki gen rapò ak yo epi nou analize sib potansyèl ki gen rapò ak neroenflamasyon finalman.

GO anrichisman ak analiz pou objektif

Pou sonde pwosesis byolojik ki enplike nan sib yo jwenn yo, nou kat sib yo nan DAVID ak tèm ki gen valè P mwens pase 0.05 yo chwazi nan seksyon sa a.

Analiz konbinezon dwòg

Nan travay anvan nou an, yo te eksplwate yon kad farmakoloji sistèm pou predi konbinezon dwòg sou yon modèl ki fèk fèt, ki rele Pwobabilite Ensemble Approach (PEA) pou analize efikasite klinik ak efè negatif konbinezon dwòg yo. An detay, yo te devlope yon rezo Bayezyen ki entegre ak yon algorithm resanblans pou modèl konbinezon yo soti nan efè konpoze molekilè ak famasi. Lè sa a, te prezante evalyasyon konbine ki kouvri efikasite klinik la ak efè negatif pou pè yo prevwa. Yon ti tan, li montre ke PEA te kapab predi efikasite nan pè yo ak espesifikite segondè ak sansiblite (AUC =0.90) nan travay nou an. Nan travay sa a, nou chwazi pi gwo dis konbinezon dwòg yo baze sou pwobabilite sinèrji yo, ki reprezante posibilite pou pwovoke sinèrji ant de konpoze.

Rezo/Pathway Building ak analiz

Pou envestige relasyon ant engredyan aktif yo ak maladi enflamatwa yo, rezo konpoze-sib (CT) ak rezo konpoze-sib-chemen (CTP) yo pwodwi pa Cytoscape 2.8.1, yon pake byoenfòmatik popilè pou vizyalizasyon rezo byolojik ak entegrasyon done. Pwopriyete yo quantitative nan rezo a analize pa de grefon sa yo Network Analyzer ak CentiScaPe 1.2. Nan rezo grafik la, nœuds endike swa konpoze, sib, oswa chemen pandan y ap kwen kode entèraksyon dwòg-sib. Pou plis eksplore efè byolojik ki jan sib selilè travay atravè modulation plizyè chemen metabolis, yon "chemen" enkòpore rasanble pa enfòmasyon ajou sou patoloji neuroinflammation. Premyèman, lè l sèvi avèk kat yo sou baz done KEGG la, pwofil sib yo reyalize yo rasanble nan plizyè chemen. Apre abandone seksyon endirèk yo, lè sa a, yon chemen relativman sentèz se manyèlman entegre sou kont done yo patolojik ak klinik.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU TRÈTE MALADI PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Validasyon eksperimantal

Preparasyon echantiyon yo

Echinacoside, verbascoside, isoacteoside ak 2′-acetylatteosideyo achte nan men Nanjing Zelang Byolojik Teknoloji co, Ltd (Nanjing, Jiangsu, Lachin). Echantiyon tès yo fonn nan dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, USA) pou jwenn 100 mM, kòm yon solisyon stock, epi answit estoke nan 4 degre. Dilusyon final yo nan DMSO ajoute nan mwayen kilti a pa janm depase 0.1% ki asire pa te gen okenn efè sou viabilite selil.

Kilti Selil

Selil microglia sourit BV2 yo te devlope orijinèlman pa Chinese Academy of Sciences Shanghai selil bank ak kiltive nan travay 25 oswa 75 cm2 ak mwayen Dulbecco modifye Eagle a (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, USA) complétée ak 10% serom fetal bovine (FBS) (Gibco BRL, USA), penisilin G (100 inite/mL) ak streptomycin (100 mg/mL) nan yon enkibatè imidite ak 5% CO2/95% O2 nan 37 degre.

Selil Viabilite Esè

Selil BV2 microglia yo simen nan yon plak 96-byen nan yon dansite 1 × 105 selil/ml, apre yo fin enkube pou 18 èdtan, selil yo trete ak 100 ul nan medyòm fre avèk oswa san divès kalite konsantrasyon endike nan echantiyon tès pou yon lòt 24 h. Tès CCK-8 (BestBio, Shanghai, Lachin) se yon metòd pratik, serye pou detèmine viabilite selil yo. Pou elimine background nan echantiyon tès yo, nou jete tout mwayen kilti a, apre sa yo ajoute 100 ul/byen fre medya ki gen 10% solisyon CCK-8. Valè OD yo nan 450 nm yo li sou yon lektè microplate (Molecular Devices, Kalifòni, USA) apre yon enkubasyon 3 èdtan nan 37 degre ak 5% CO2.

Analiz Western Blot

Pwoteyin selilè a soti nan liy selil yo lè l sèvi avèk yon Kit Preparasyon Pwoteyin Mamifè Qproteome™ (Qiagen, Almay) apre pwosedi pwotokòl manifakti a endike yo. Quick Stari Bradford Pwoteyin Assay Twous (Bio-Rad, USA) aplike nan quantification pwoteyin. Kantite ekivalan pwoteyin (50ug) yo denatire lè yo bouyi a 100 degre pou 10 min ak 2 * laemmli echantiyon tanpon chaje (Bio-Rad, USA) plis 5% -mercaptoethanol nan yon rapò 1:1 ak chaje pou chak liy sou 12% SDS-PAGE (sodyòm dodecyl sulfat poliakrilamid minigels), electrotransferred sou 0.45 μm polyvinylidene fuoride membranes (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, USA) pou 150 min nan 200 mA. Apre sa, manbràn yo bloke nan 3% albumin serik bovin (BSA) nan tanperati chanm epi yo enkube ak antikò prensipal iNOS ak COX-2 (Abcam) nan 4 degre lannwit lan. Apre twa lave bon jan nan Tris-tampon Saline-Tween (TBST) chak pou 5 minit, manbràn yo sonde ak peroksidaz refor (HRP)-konjige antikò segondè (1: 10000 dilution; Abcam) pou 1.5 èdtan nan tanperati chanm. Lè sa a, bann imunoreactive yo vizyalize lè l sèvi avèk yon twous deteksyon chemiluminescence ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifòni, USA) apre yo fin lave de fwa nan TBST ak yon fwa nan TBS, chak fwa pou 5 min. Valè densitometrik yo nòmalize lè l sèvi avèk -actin kòm loading kontwòl entèn yo.

Analiz estatistik

Done yo prezante kòm mwayen ± erè estanda, epi analiz Western blot repete nan twa eksperyans endepandan ak menm rezilta a. Yo itilize analiz yon-fason nan divèjans pou konpare diferans ki genyen nan mwayen pou twa oswa plis gwoup, yo analize siyifikasyon estatistik ak tès t Elèv la ant de gwoup.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU TRÈMAN MALADI PARKINSON AK MALADI ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%