Aktivasyon ISG15-depandan nan Capteur MDA5 an antagonize pa SARS-CoV-2 Proteaz ki sanble ak papain pou evite iminite natirèl la.
Nov 08, 2023
Aktivasyon reseptè RIG-I-tankou yo, jèn retinoik-asid I (RIG-I), ak pwoteyin melanom ki asosye ak diferansyasyon 5 (MDA5) etabli yon eta antiviral lè yo kontwole jèn entèferon (IFN)-stimulé (ISG). Pami sa yo se ISG15, wòl mekanik nan ki nan iminite natirèl toujou rete enigmatik. Nan etid la prezan, nou rapòte ke konjigezon ISG15 esansyèl pou repons antiviral IFN medyatè pa Capteur RNA viral MDA5 la. ISGylation nan deklanchman kaspase ak domèn rekritman nan MDA5 ankouraje oligomerizasyon li yo epi kidonk deklanche deklanchman iminite natirèl kont yon seri viris, ki gen ladan coronavirus, flavivirus, ak picornaviris. Aktivasyon MDA5 depandan ISG15-depandan an antagonize atravè de-ISGylation dirèk medyatè pa proteaz ki sanble papain nan SARS-CoV-2, yon coronavirus ki fèk parèt ki te lakòz pandemi COVID-19. . Travay nou an demontre yon wòl enpòtan pou ISG15 nan repons antiviral MDA5-medyatè epi tou li idantifye yon mekanis kle evazyon iminitè SARS-CoV-2, ki ka vize pou devlopman nouvo antiviral ak vaksen pou konbat COVID-19.
cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè
Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity
【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Perturbasyon viral nan omeyostaz iminitè lame a kontwole pa sistèm iminitè natirèl la, ki depann sou reseptè ki santi danje oswa modèl molekilè ki asosye ak patojèn (PAMPs) 1-3. Reseptè RIG-I-like (RLRs) RIG-I ak MDA5 yo esansyèl pou deteksyon viris lè yo fè sondaj sou sitoplasm nan pou RNAs iminostimulatwa viral oswa ki sòti nan lame4. Liaison RNA pou domèn C-terminal (CTD) ak helicase RIG-I ak MDA5 mennen nan konfòmasyon siyal-prime yo ki pèmèt pou rekritman plizyè anzim5. Anzim sa yo modifye RLRs nan plizyè domèn ak sit, ak modifikasyon pòs-tradiksyon (PTM) yo patikilyèman byen etidye pou deklanchman kaspase ak domèn rekritman (CARD), modil siyal yo. Pwoteyin fosfataz 1 (PP1) / dephosphorylate RIG-I ak MDA5 CARD6 yo. Nan ka RIG-I, dephosphorylation ankouraje Lys63-lyubiquitination CARD yo pa TRIM25 (motif triparti ki gen 25) ak lòt ligaz E37,8, ki estabilize fòm oligomerik RIG-I, kidonk pèmèt mitokondriyo antiviral. -Siyal pwoteyin (MAVS) obligatwa. Konpare ak sa yo ki nan RIG-I, etap endividyèl yo nan aktivasyon MDA5 ak PTM kritik ki enplike yo mwens byen konprann. Aktivasyon RLR pwovoke pwodiksyon kalite I ak III IFN ki, nan vire, difize siyal antiviral pa upregulating ISGs9,10. Pami sa yo se ISG15, yon pwoteyin ki tankou ubiquitin ki ka konjige kovalan ak rezidi lizin nan pwoteyin sib, yon pwosesis PTM ki rele ISGylation11. Malgre ke konjigezon ISG15 te lajman rekonèt pou aji antiviral12, mekanis ISGylation pwoteyin lame ki ta ka eksplike aktivite restriksyon antiviral laj ISG15 yo kounye a enkoni. Ajan ki lakòz pandemi COVID-19 k ap kontinye, sendwòm respiratwa egi grav coronavirus 2 (SCoV2), fè pati fanmi Coronaviridae ki genyen plizyè lòt patojèn imen. Kowonaviris yo gen yon kapasite eksepsyonèl pou siprime repons antiviral IFN yo, ak pwodiksyon IFN ki ba nan pasyan ki enfekte SCoV2-ki gen rapò ak maladi grav13. Pami antagonis IFN kowonaviris yo genyen proteaz ki tankou papain (PLpro) ki gen aktivite debiquitinating ak de-ISGylating14,15. Nan etid la prezan, nou idantifye yon wòl esansyèl pou ISGylation nan aktivasyon MDA5. Nou montre anplis ke SCoV2 PLpro reyaji ak MDA5 ak antagonize ISG15-depandan deklanchman MDA5 atravè de-ISGylation aktif, revele ke SCoV2 te deja evolye pou chape anba siveyans iminitè pa MDA5.
Rezilta yo
MDA5, men se pa RIG-I, siyal mande ISG15.
Pou idantifye PTM nan MDA5 CARD yo ki ka kontwole deklanchman MDA5, nou sibi MDA5-2CARD afinite-pirifye kole ak glutatyon-S-transferaz (GST-MDA5-2CARD), oswa GST pou kont li, ak kromatografi likid makonnen ak espektrometri mas tandem (LC). –MS/MS), epi li te jwenn ke, espesyalman, GST–MDA5–2CARD ko-pirifye ak ISG15, ki te parèt kòm de gwoup ki te imigre pi dousman (pa ~ 15 ak 30 kDa) pase san modifye GST–MDA5– 2CARD (Done pwolonje). Fig. 1a). Immunoblotting (IB) konfime ke GST-MDA5-2CARD modifye pa ISG15 (Done pwolonje Fig. 1b). Apre sa, nou te detèmine enpòtans ISG15 pou siyal MDA5-pwovoke. Lè nou konsidere ke ekspresyon FLAG-MDA5 nan fibroblast anbriyonik sourit (MEFs) ki gen fòm sovaj (WT) pwovoke RNA mesaje IFN ak pwoteyin ansanm ak transkripsyon Ccl5 nan yon fason ki depann de dòz, ekspresyon FLAG-MDA5 nan Isg15-/- MEF te mennen nan ablasyon. ekspresyon jèn antiviral ak pwoteyin (Fig. 1a ak Done Pwolonje Fig. 1c). Menm jan an tou, antiviral jèn endiksyon pa fòtman diminye nan ISG15 knockout (KO) HeLa (moun) selil konpare ak selil kontwòl WT (Fig. 1b ak Pwolonje Done Fig. 1d), eskli yon efè espesifik espès. Kontrèman, FLAG-RIG-I pwovoke kantite konparab sekrete IFN-pwoteyin osi byen ke Ifnb1 ak Ccl5 transkripsyon nan Isg15-/- ak WT MEFs (Fig. 1a ak Done Pwolonje Fig. 1c). Transkripsyon IFNB1 ak CCL5 ak pwodiksyon IFN-pwoteyin pa FLAG-RIG-I te sanble oswa yon ti kras amelyore nan selil ISG15 KO HeLa konpare ak selil WT (figi 1b ak done pwolonje fig. 1d), ki konsistan avèk rapò anvan yo ke ISGylation negatif. enpak sou siyal RIG-I16,17
Figi 1|ISGylation obligatwa pou siyal MDA5, men se pa RIG-I. a, b, ELISA nan IFN- ki soti nan supernatant nan MEFs (WT oswa Isg15-/-) (a) ak selil HeLa (WT oswa ISG15 KO) (b) transfekte tanporèman ak ogmante kantite MDA5 oswa RIG-I ki make FLAG pou 40 h. Lysates antye-selil (WCLs) te sonde pa IB ak anti-ISG15, anti-FLAG, ak anti-aktin (kontwòl chaje). c, ELISA nan IFN- soti nan supernatant nan WT oswa Isg15-/- MEFs ki te moke stimulé oswa transfekte ak EMCV RNA (0.1 oswa 0.4 µg ml-1), HMW-poly (I: C) (0.5 µg ml-1) oswa RABVLe (1 pmol ml-1), oswa ki enfekte ak SeV (10 inite hemaglutination (HAU) ml-1) pou 24 h. d, RT-qPCR analiz de Ifnb1, Ccl5, ak Tnf mRNA nan WT ak Isg15-/- MEFs ankouraje tankou nan c. e, Fosforilasyon IRF3 nan WCL nan NHLF yo ki te transfekte ak siRNA ki endike yo pou 30 èdtan ak Lè sa a, mock ankouraje oswa transfekte ak EMCV RNA (0.4 µg ml-1) oswa RABVLe (1 pmol ml-1) pou 6 èdtan, evalye pa IB ak anti-pSer396-IRF3 ak anti-IRF3. f, ELISA nan IFN- soti nan supernatant nan NHLF yo ki te transfekte ak siRNAs endike yo pou 30 èdtan ak Lè sa a, mock ankouraje oswa transfekte ak EMCV RNA (0.4 µg ml-1) oswa RABVLe (1 pmol ml-1), oswa enfekte ak SeV. (10 HAU ml−1) pou 16 h. g, ELISA nan IFN- ki soti nan supernatant PBMC yo ki te transdui pou 40 èdtan ak patikil lentiviral shRNA ki endike yo ak Lè sa a, enfekte ak mutEMCV (MOI=10) oswa SeV (200 HAU ml-1) pou 8 èdtan. h, RT-qPCR analiz IFNA2 ak IL-6 mRNA nan PBMC yo ki te transdui ak enfekte tankou nan g. Done yo reprezante omwen de eksperyans endepandan ak rezilta menm jan an (mwayèn ± sd nan n= 3 replike byolojik nan a–d ak f, ak mwayèn nan n= 2 replike byolojik nan g ak h). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.
Apre sa, nou teste efè sipresyon jèn ISG15 sou aktivasyon MDA5 andojèn ak RIG-I pa ligand respektif yo. Pwodiksyon IFN- ak ekspresyon jèn IFNB1, CCL5, ak TNF pwovoke pa transfeksyon viris ansefalomyokardit (EMCV) RNA oswa segondè-molekilè-pwa (HMW)-poly (I: C), tou de nan yo se prensipalman santi pa MDA5, yo te pwofondman atténué nan Isg15-/- MEF, ISG15 KO HeLa ak ISG15 KO HAP-1 selil konpare ak selil kontwòl respektif yo (figi 1c, d ak done pwolonje fig. 1e-g). Sa ki enpòtan, ablasyon an nan endiksyon jèn antiviral pa EMCV RNA oswa HMW-poly (I: C) nan selil ISG15 KO pa te akòz ekspresyon jèn MDA5 anile; okontrè, ekspresyon mRNA MDA5 te amelyore nan selil ISG15 KO konpare ak selil WT (Done pwolonje Fig. 1f, g). Kontrèman ak eksitasyon ak agonist MDA5, eksitasyon Isg15-/- MEFs ak ISG15 KO HeLa selil pa transfeksyon lidè viris laraj RNA (RABVLe) oswa enfeksyon viris Sendai (SeV), ki se stimuli RIG-I, te mennen nan pwodiksyon IFN ak ekspresyon jèn antiviral konparab ak selil WT (Fig. 1c, d ak Done Pwolonje Fig. 1e). Pou eskli efè klonal potansyèl ki ta ka asosye ak selil ISG15 ki efase jèn yo, nou te fè eksperyans transitwa pou silans jèn nan fibroblasts nan poumon moun nòmal prensipal yo (NHLFs). ISG15 silansman, menm jan ak MDA5 knockdown, te mennen nan yon pèt prèske konplè nan fosforilasyon nan IFN-regleman faktè 3 (IRF3) - yon karakteristik nan RLR-siyal aktivasyon - apre eksitasyon ak EMCV RNA men se pa RABVLe ished IFN-pwodiksyon osi byen ke ekspresyon transkripsyon antiviral nan NHLFs transfekte ak EMCV RNA, men se pa nan selil ankouraje ak RABVLe oswa SeV (Fig. 1f ak Done Pwolonje Fig. 1h). Ti epengl (sh) RNA-medyatè silansman nan ISG15 oswa MDA5 nan selil prensipal mononikleyè san periferik imen (PBMCs) tou redwi sibstansyèlman pwoteyin antiviral ak ekspresyon transkripsyon apre enfeksyon ak yon EMCV mutan recombinant (mutEMCV) ki manke nan antagonism MDA518,19, konpare ak PBMC ki enfekte transduced ak shRNA kontwòl ki pa vize (Fig. 1g, h ak Done Pwolonje Fig. 1i). Kontrèman, ISG15 oswa MDA5 rediksyon pa t 'afekte repons sitokin nan PBMCs apre enfeksyon SeV (Fig. 1g, h ak Done Pwolonje Fig. 1i). Rezilta sa yo montre ke ISG15 esansyèl pou siyal iminitè pa MDA5, men se pa RIG-I. KAT MDA5 yo ISGylated nan Lys23 ak Lys43.
benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè
Pou kore analiz MS nou an ki te idantifye MDA5-2CARD ISGylation, nou premye teste si MDA5 andojèn tou modifye pa ISG15. Endogenous MDA5 te solidman ISGylated nan selil transfekte ak HMW-poly (I: C), oswa enfekte ak viris deng (DENV) oswa Zika (ZIKV) ki detekte pa MDA5 (ref. 5) (Fig. 2a). Miyò, MDA5 andojèn te ISGylated tou nan selil ki pa enfekte, byenke nan nivo ki ba anpil (Done pwolonje Fig. 2a), ki konsistan avèk rezilta anvan yo ke anpil pwoteyin lame yo tou ISGylated nan nivo ki ba nan kondisyon nòmal (ki pa enfekte)20. Nan selil trete ak anti-IFNAR2 pou bloke IFNAR-siyal-medyatè ISG upregulation, ISG15 oswa MDA5 silans te mennen nan yon rediksyon konparab nan ekspresyon jèn IFNB1 apre enfeksyon mutEMCV (Done pwolonje Fig. 2b), ki endike ke ISG15-depandan Siyal MDA5 rive menm nan absans siyal IFNAR.
t MDA5Δ2CARD (ki gen helicase ak CTD), se sit prensipal MDA5 ISGylation ki montre de gwoup enpòtan pou ISGylated 2CARD (figi 2b). Rekonstitisyon selil ISG15 KO HeLa ak swa WT ISG15, oswa yon mutan ISG15 ki pa konjigabl kote de glisin ki nesesè pou konjigezon yo te ranplase ak alanin (ISG15-AA)21, te demontre konjigezon ISG15 kovalan (Fig. 2c) . Mitasyon nan résidus lizin endividyèl nan GST-MDA5-2CARD nan arjinin revele ke mitasyon yon sèl-sit nan Lys23 ak Lys43 notables redwi ISGylation (Done pwolonje Fig. 2c), tandiske mitasyon konbine yo (Lys23Arg / Lys43Arg) prèske aboli ISGylation (Fig. ). Tout longè FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg te montre tou ISGylation siyifikativman diminye (Fig. 2e ak Done Pwolonje Fig. 2d); ISGylation rezidyèl yo wè nan FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg se pwobableman akòz lòt sit minè nan 2CARD la ak/oswa Δ2CARD. Nan nòt, Lys23Arg / Lys43Arg mitasyon an pa te afekte MDA5-2CARD SUMOylation5 (Done pwolonje Fig. 2e). Anplis de sa, tandiske RIG-I-2CARD te gaya omnikwitinasyon (ki reprezante kovalan Lys63-lye ubiquitination7 ), ni MDA5-2CARD WT ni Lys23Arg / Lys43Arg mutan te montre nivo detekte nan omnikwitinasyon (Done pwolonje Fig.2f). Ansanm, rezilta sa yo endike ke MDA5 CARD yo sibi ISGylation nan de gwo sit, Lys23 ak Lys43.
CARD ISGylation obligatwa pou aktivasyon MDA5.
Lè yo konpare kapasite transdiksyon siyal yo, MDA5–2CARD Lys23Arg ak Lys43Arg yon sèl-sit mutan te montre yon pati nan redui deklanchman IFN-pwomotè konpare ak WT MDA5–2CARD, tandiske Lys23Arg/Lys43Arg mutan te gen yon aktivite siyal pwofondman redwi, ki te prèske osi fò. kòm sa yo ki nan mutan yo siyal-defektye Ser88Glu ak Ser88Asp6 (Done pwolonje Fig. 2g). Kontrèman, yon mutan nan ki Lys68, ki se rezidi lizin ki pi proximal nan Lys43 ak Lys23, te ranplase ak arjinin (Lys68Arg) te montre konjigezon konparab ISG15 ak konpetans siyal WT 2CARD (Done pwolonje Fig. 2c, g). MDA5-2CARD Lys23Arg / Lys43Arg, kontrèman ak WT MDA5-2CARD, tou echwe pou pou pwovoke IRF3 dimerization (Done pwolonje Fig. 2h). FLAG-MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg oswa Lys23Arg/Lys43Arg te montre tou redwi, oswa prèske aboli, kapasite aktive pwomotè IFN, konpare ak FLAG-MDA5 WT (Fig. 2f). MDA5 Lys23Arg / Lys43Arg te montre yon defo siyal pwofon menm lè yo eksprime nan gwo kantite, tandiske WT MDA5 pwovoke transkripsyon antiviral nan yon fason ki depann de dòz (figi 2g). Nan akò, STAT1 fosforilasyon, yon karakteristik nan siyal IFNAR, osi byen ke ekspresyon pwoteyin ISG yo te trè pwovoke pa MDA5 WT, men se pa Lys23Arg / Lys43Arg (Fig. 2h). Konpleman MDA5-jene-edited astwosit imen (SVGAs) ak MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg oswa Ser88Glu te mennen nan anpil diminye transkripsyon IFNB1, CCL5 ak ISG konpare ak selil ki eksprime WT MDA5 (figi 2i ak pwolonje done). . Rezilta sa yo montre ke ISGylation nan Lys23 ak Lys43 esansyèl pou repons cytokine MDA5-medyatè.
benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè
Dephosphorylation pa PP1 kontwole MDA5 ISGylation.
Menm jan ak RIG-I, MDA5 fosforil nan CARD yo nan selil ki pa enfekte, sa ki anpeche otoactivasyon; defosforilasyon RIG-I ak MDA5 pa PP1 / enpòtan anpil pou debouche RLR yo nan eta siyal yo reprime6,22-24. Dephosphorylation nan RIG-I pèmèt Lys63-lye ubiquitination nan CARD yo, ki ankouraje miltimerizasyon RIG-I ak siyal5. Detay yo sou fason CARD dephosphorylation (nan Ser88) deklannche MDA5 aktivasyon yo te rete flotant, ak Se poutèt sa nou teste si dephosphorylation kontwole MDA5 ISGylation. Silans nan PP1 / fòtman diminye MDA5–2CARD ISGylation (Done pwolonje Fig. 3a). Anplis de sa, mutan fosfomimetik Ser88Glu ak Ser88Asp te redwi ISGylation, tandiske fosfo-null Ser88Ala mutan te montre ISGylation pi fò pase WT MDA5-2CARD (Done pwolonje Fig. 3b). Kontrèman, MDA5 WT ak Lys23Arg / Lys43Arg te gen fosforilasyon Ser88 konparab (Done pwolonje Fig. 3c). Ansanm, done sa yo sijere ke dephosphorylation MDA5 nan Ser88 anvan CARD ISGylation. Apre sa, nou te sèvi ak pwoteyin lawoujòl viris V (MeV-V), ki antagonize dephosphorylation MDA5 Ser88 atravè PP1 / antagonism25. Ekspresyon MeV-V amelyore fosforilasyon Ser88 (ki endike defosforilasyon ablated) GST-MDA5-2CARD oswa FLAG-MDA5 nan yon fason ki depann de dòz la, jan yo montre deja25. Fosforilasyon amelyore pa MeV-V ki gen rapò ak yon bès nan ISGylation (Done pwolonje Fig. 3d, e). Kontrèman ak WT MeV-V, yon mutan MeV-V ki te aboli PP1-obligasyon ak MDA{5-dephosphorylation antagonism (MeV-VΔtail)25, te montre yon ti efè sou MDA5–2CARD ISGylation (Done pwolonje). Fig. 3f), ranfòse anpèchman ISGylation ke yo te sitou akòz PP1 anpèchman, epi yo pa lòt efè antagonis, pa MeV-V. Pwoteyin V ki soti nan viris Nipah ak Hendra (NiV-V ak HeV-V) tou amelyore fosforilasyon MDA5 Ser88 epi, kòmsadwa, diminye MDA5 ISGylation (Done pwolonje Fig. 3g, h), sijere ke plizyè pwoteyin paramyxoviral V anpeche MDA5 ISGylation atravè manipilasyon. nan fosforilasyon Ser88, byenke mekanis egzak pou pwoteyin endividyèl V rete yo dwe detèmine. Ansanm, done sa yo sijere ke MDA5 CARD ISGylation a depann sou defosforilasyon nan Ser88.
ISGylation ankouraje asanble MDA5 ki pi wo yo.
Aktivasyon RLR mande pou RNA obligatwa, RLR oligomerization, ak translokasyon yo soti nan sitosol la nan mitokondri pou entèraksyon ak MAVS5. Pou elicide mekanis ki ISGylation afekte aktivite MDA5, nou premye egzamine si ISGylation afekte RNA obligatwa. Endogenous MDA5 pirifye soti nan WT oswa Isg15-/- MEFs kominike egalman byen ak HMW-poly (I: C) nan vitro (Done pwolonje Fig. 4a). MDA5 WT ak Lys23Arg/Lys43Arg te montre konparab obligatwa ak HMW-poly (I: C), ki endike ke ISGylation pa afekte kapasite nan RNA-obligatwa nan MDA5 (Done pwolonje Fig. 4b). Lè nou te kontwole translokasyon MDA5 soti nan sitosol la nan mitokondri apre eksitasyon EMCV RNA, nou te jwenn ke ISG15 silans, men se pa konsa.C transfèksyon, aboli MDA5 translokasyon (Fig. 3a). Kontrèman, translokasyon RIG-I apre transfèksyon RABVLe te efikas nan tou de ISG15-apovri ak si. C-transfected selil (figi 3b). Done sa yo endike ke ISGylation kontwole translokasyon MDA5 oswa yon etap en li. Kòm translokasyon cytosol-a-mitokondri MDA5 mande pou entèraksyon ak 14-3-3η26, nou konpare 14-3-3η obligatwa WT ak mutan MDA5. Kapasite MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg pou mare 14-3-3η te sanble ak WT MDA5 oswa mutan Lys68Arg (Done pwolonje Fig. 4c). Sepandan, tandiske EMCV RNA eksitasyon efektivman pwovoke MDA5 oligomerization nan WT MEFs, fòmasyon nan oligomè MDA5 te ablated nan ISG 15-defisyan MEFs (figi 3c). ISG15 knockdown nan selil 293T tou aboli oligomerization FLAG-MDA5-2CARD (Fig. 3d). Kontrèman, ko-ekspresyon nan konpozan machin ISGylation yo, Ube1L ak UbcH8, fòtman amelyore oligomerizasyon MDA5-2CARD nan si. Selil C-transfekte, men se pa nan selil ISG15-apovri (Fig. 3d), ki endike ke ISGylation obligatwa pou fòmasyon oligomè MDA5. Nan sipò konsèp sa a, FLAG-MDA5 Lys23Arg / Lys43Arg te montre prèske aboli oligomerizasyon, tandiske WT MDA5 oligomerize avèk efikasite (figi 3e). Nou menm tou nou te konpare efè a nan Lys23 Arg / Lys43Arg mitasyon ak sa ki nan oligomerization-deranje mitasyon ki lokalize swa nan koòdone ki genyen ant monomè MDA5 ak anpeche RNA-obligatwa-medyatè filamentasyon MDA5 (Ile841Arg / Glu842Arg ak Asp848Ala / Phe848Ala, 2849Ala). oswa nan CARD yo (Gly74Ala/Trp75Ala) epi deranje oligomerizasyon 2CARD27. Kontrèman ak WT MDA5, Lys23Arg / Lys43Arg mutan an, menm jan ak MDA5 Gly74Ala / Trp75Ala, te montre oligomerizasyon ensufizant epi, ki konsistan avèk sa a, aboli IFN-promotè-aktive kapasite (Fig. 3f, g). Entwodiksyon Lys23Arg/Lys43Arg nan background nan Ile841Arg/Glu842Arg oswa Asp848Ala/Phe849Ala, swa nan ki pou kont li diminye MDA5 oligomerization ak siyal, tou aboli fòmasyon oligomè MDA5 ak IFN- endiksyon (Fig. 3f, g). Kòm LGP2 fasilite nikleyasyon MDA5 sou RNA doub-chachen epi kidonk MDA5 oligomerization29,30, nou konpare obligatwa LGP2 nan MDA5 WT ak Lys23Arg / Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg te kominike avèk LGP2 kòm efikasite kòm WT MDA5 (Done pwolonje Fig. 4d), ranfòse pwopozisyon an ke CARD ISGylation ankouraje MDA5 oligomerization poukont li nan filamentasyon RNA-obligatwa-medyatè. Ansanm, rezilta sa yo etabli ke ISGylation fasilite oligomerizasyon CARD ak asanble MDA5 ki pi wo yo.
Figi 2|Aktivasyon MDA5 mande pou ISGylation nan Lys23 ak Lys43. yon ISGylation MDA5 andojèn nan NHLF yo ki te trete, transfekte ak HMW-poly(I: C) (0.1 µg ml-1) pou 40 èdtan (agòch) oswa ki enfekte ak DENV oswa ZIKV (MOI {{ 10}} pou chak) pou 48 h (adwat), detèmine pa IP ak anti-MDA5 (oswa yon kontwòl izotip IgG) ak IB ak anti-ISG15. b, ISGylation nan MDA5-2CARD ak MDA5Δ2CARD ki make FLAG nan selil HEK293T transfèkte tanporèman ki eksprime tou V5-ISG15, HA-Ube1L ak FLAG-UbcH8, evalye pa FLAG PD ak IB ak anti-V5 nan 40 èdtan apre transfeksyon. c, Endogenous MDA5 ISGylation nan selil ISG15 KO HeLa ki estab rekonstitye ak vektè, WT ISG15 oswa ISG15-AA ak ko-transfekte ak HA-Ube1L ak FLAG-UbcH8 apre tretman IFN- (1,000 U ml-1) pou 24 èdtan, detèmine pa IP ak anti-MDA5 ak IB ak anti-ISG15. d, ISGylation nan GST-MDA5-2CARD WT ak Lys23Arg / Lys43Arg nan selil HEK293T ki te ko-transfekte ak V5-ISG15, HA-Ube1L ak FLAG-UbcH8 pou 24 èdtan, detèmine pa GST PD ak IB ak anti-V5. e, ISGylation FLAG-MDA5 WT ak Lys23Arg/Lys43Arg nan selil HEK293T ki te ko-transfekte ak V5-ISG15, HA-Ube1L ak FLAG-UbcH8, detèmine pa FLAG PD ak IB ak anti-V5. f, IFN- luciferase repòtè aktivite nan selil HEK293T ki te transfekte pou 40 èdtan ak vektè, FLAG-MDA5 WT oswa mutan. Valè luciferase yo prezante kòm pliye endiksyon relatif nan valè yo pou selil vektè-transfekte, mete nan 1. WCL yo te sonde pa IB ak anti-FLAG ak anti-aktin. g, RT-qPCR analiz de IFNB1 ak CCL5 mRNA nan selil HEK293T ki te transfekte tanporèman ak swa vektè oswa ogmante kantite FLAG-MDA5 WT oswa Lys23Arg/Lys43Arg. h, fosforilasyon STAT1 ak abondans pwoteyin ISG (IFIT1 ak -2) nan WCL selil HEK293T ki te transfekte tanporèman ak vektè oswa FLAG-MDA5 WT oswa Lys23Arg/Lys43Arg, ki detèmine pa IB. Mwen, RT-qPCR analiz de jèn antiviral ki endike yo nan MDA5 KO SVGAs ki te rekonstitye tanporèman ak swa vektè vid oswa MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg oswa Ser88Glu ki make FLAG. Done yo reprezante omwen de eksperyans endepandan ak rezilta menm jan an (mwayèn ± sd nan n= 3 replike byolojik nan f, g, ak i). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Figi 3|CARD ISGylation ankouraje fòmasyon asanble MDA5 ki pi wo yo. a, b, fraksyon sitosol-mitokondri nan WCL soti nan NHLF yo ki te transfekte pou 30 h ak siRNA kontwòl ki pa vize (si. C) oswa siRNA espesifik ISG15- (si.ISG15), ak Lè sa a, mock-trete oswa transfekte ak EMCV RNA (0.4 µg ml-1 ) (a) oswa RABVLe (1 pmol ml-1 ) (b) pou 16 èdtan. IB te fèt ak anti-MDA5 (a), anti-RIG-I (b), anti-ISG15, ak anti-aktin (a ak b). -Tubulin ak MAVS te sèvi kòm makè pite pou fraksyon cytosolic ak mitokondriyo, respektivman (a ak b). c, Endogenous MDA5 oligomerization nan WT ak Isg15-/- MEFs ki te transfekte ak EMCV RNA (0.5 µg ml-1) pou 16 èdtan, epi evalye pa SDD-AGE ak IB ak anti-MDA5. WCL yo te analize plis pa SDS-PAGE ak sonde pa IB ak anti-MDA5 ak anti-aktin. d, Oligomerizasyon FLAG-MDA5-2CARD nan selil HEK293T ki te transfekte ak siRNA ki endike yo, swa avèk oswa san HA-Ube1L ak FLAG-UbcH8 pou 48 èdtan, ki detèmine pa NativePAGE ak IB ak anti-FLAG. WCL yo te analize plis pa SDS-PAGE ak sonde pa IB ak anti-FLAG, anti-HA, anti-ISG15, ak anti-aktin. e, Oligomerization FLAG-MDA5 WT ak Lys23Arg/Lys43Arg nan selil MDA5 KO HEK293 transfèksyon transfè, evalye pa SDD-AGE ak IB ak anti-FLAG. WCL yo te analize plis pa SDS-PAGE ak IB ak anti-FLAG ak anti-aktin. f, Oligomerization nan MDA5 WT ki make FLAG ak mutan nan selil MDA5 KO HEK293 transfèkte transfèksyon, yo evalye pa NativePAGE ak IB ak anti-MDA5. WCL yo te analize plis pa SDS-PAGE ak sonde pa IB ak anti-MDA5 ak anti-aktin. g, aktivite repòtè IFN- luciferase nan selil MDA5 KO HEK293 ki te transfekte pou 24 èdtan ak swa vektè vid, oswa MDA5 WT ki make FLAG oswa mutan. Aktivite lisiferaz prezante kòm endiksyon pliye parapò ak valè selil vektè transfekte yo, mete a 1. Done yo reprezante omwen de eksperyans endepandan ak rezilta menm jan an (mwayèn ± sd nan n= 3 replike byolojik nan g). ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Siyal MDA5 ki depann de ISGylation limite replikasyon viris la.
Nou te evalye si wi ou non ISGylation nan MDA5 obligatwa pou kapasite li nan mete restriksyon sou replikasyon viris. FLAG-MDA5 WT, men se pa Lys23Arg / Lys43Arg, ki pisan (pa ~ 2log) anpeche replikasyon EMCV (Fig. 4a). Menm jan an tou, selil MDA5 KO HEK293 rekonstitye ak WT MDA5, men se pa selil ki konplete ak Lys23Arg / Lys43Arg mutan, efektivman limite replikasyon DENV (Fig. 4b). Nou menm tou nou rekonstitye MDA5 KO astrocyte SVGAs, yon kalite selil fizyolojik ki enpòtan pou enfeksyon ZIKV, ak swa vektè, oswa MDA5 WT oswa Lys23Arg/Lys43Arg, epi answit evalye replikasyon ZIKV sou yon tan 40-h. Replikasyon ZIKV te atténue pa ~100-pliye nan selil rekonstitye ak WT MDA5 konpare ak selil ki eksprime vektè. Kontrèman, selil ki konplete ak MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg pa t limite ZIKV, menm jan ak selil ki eksprime MDA5 Ser88Glu (figi 4c). WT MDA5, men se pa Lys23Arg/Lys43Arg, tou limite replikasyon SCoV2, byenke nan yon pi piti limit pase sa yo wè pou lòt viris yo teste (figi 4d).
Figi 4|ISGylation obligatwa pou restriksyon viral pa MDA5. Tit EMCV nan sipènatan selil HEK293T ki te transfekte pou 40 h ak swa vektè, oswa FLAG–MDA5 WT oswa Lys23Arg/Lys43Arg, epi answit enfekte ak EMCV (MOI=0.001) pou 24 h, detèmine pa tès TCID50. b, Pousantaj selil MDA5 KO HEK293 ki enfekte ak DENV ki te transfekte pou 24 èdtan avèk swa vektè, oswa FLAG–MDA5 WT oswa Lys23Arg/Lys43Arg, epi answit trete oswa enfekte ak DENV (MOI=5) pou 48 èdtan. , evalye pa FACS lè l sèvi avèk anti-flavivirus E (4G2). SSC, gaye bò. c, Tit ZIKV nan sipènatan MDA5 KO SVGA yo ki te transfekte pou 30 èdtan ak vektè oswa MDA5 WT ki make FLAG, Lys23Arg/Lys43Arg oswa Ser88Glu epi ki te enfekte ak ZIKV (MOI=0.1) pou tan ki endike yo. , detèmine pa tès plak. pfu, inite ki fòme plak; hpi, èdtan apre enfeksyon. d, tit SCoV2 nan supernatant selil HEK293T–hACE2 ki te transfekte pou 24 èdtan avèk swa vektè vid, oswa FLAG–MDA5 WT oswa Lys23Arg/Lys43Arg, epi answit enfekte ak SCoV2 (MOI=0.5) pou 24 h, detèmine pa tès plak. e, Chema apwòch eksperimantal pou 'dekouple' wòl ISG15 nan MDA5-medyatè endiksyon IFN nan wòl li nan diminye siyal IFNAR. Sup., supernatant. f, selil 'donatè' NHLF yo te transfekte pou 40 èdtan ak siRNAs ki endike yo ak Lè sa a, enfekte ak mutEMCV (MOI=0.1) pou 16 èdtan. Supernatant selil yo te inaktive UV epi yo te transfere sou selil Vero 'destinatè' yo. Apre 24 èdtan, selil yo te enfekte ak ZIKV (MOI=0.002-2) pou 72 èdtan, ak selil ZIKV-pozitif yo te detèmine pa imunostaining ak anti-flavivirus E (4G2) ak substra peroksidaz TrueBlue. g, RIG-I KO HEK293 'donatè' selil yo te transfekte ak si. C oswa si.ISG15 ansanm ak swa vektè oswa FLAG–MDA5 WT oswa Lys23Arg/Lys43Arg, pou 24 èdtan, ki te swiv pa enfeksyon EMCV (MOI=0.001) pou 16 èdtan. Supernatant selil ki inaktive UV yo te transfere sou selil Vero 'destinatè' pou 24 èdtan, ki te swiv pa enfeksyon ak EMCV (MOI=0.001-0.1) pou 40 èdtan. Efè sitopatik pwovoke EMCV yo te vizyalize pa tach Coomassie Blue. Done reprezante omwen de eksperyans endepandan ak rezilta menm jan an (mwayèn ± sd nan n= 3 repwodui byolojik nan a–d). *P< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Apre sa, nou te detèmine efè silansman ISG15 sou kapasite MDA5 pou anpeche replikasyon viris la. Malgre ke MDA5 Lys23Arg / Lys43Arg echwe pou pou siprime replikasyon EMCV kèlkeswa silansman ISG15, WT MDA5 efektivman limite replikasyon EMCV nan si. C-transfekte selil epi, san atann, tou nan ISG 15-selil apovri (Done pwolonje Fig. 5a). Nan yon eksplorasyon nan mekanis ki kache nan rezilta sa yo inatandi, nou te jwenn ke selil yo ki enfekte EMCV ki eksprime WT MDA5 te ogmante nivo ekspresyon pwoteyin ISG lè ISG15 te silans konpare ak selil ki enfekte transfekte ak WT MDA5 ak si. C (Done pwolonje Fig. 5b). Menm jan an tou, yo te obsève transkripsyon ISG ki wo ak ekspresyon pwoteyin nan selil ISG15-defisyan ki te transfekte ak EMCV RNA oswa ki te enfekte ak mutEMCV, malgre anilasyon IFN-endiksyon (Done Pwolonje Fig. 5c, d). Kontrèman, MDA5 knockdown abroge tou de ekspresyon pwoteyin IFN- ak ISG, jan yo espere (Done pwolonje Fig. 5d). Nou remake ke abondans pwoteyin USP18, yon anzim debiquitinating ki kontwole negatif siyal IFNAR31, te diminye anpil nan selil ISG15-apovri apre enfeksyon EMCV konpare ak selil enfekte ki te transfekte ak si. C oswa MDA5-siRNA espesifik (Done pwolonje Fig. 5b, d), ki konsistan avèk wòl ISG15 rapòte nan anpeche degradasyon USP1832. Ansanm, done sa yo sijere ke nan anviwònman eksperimantal nan vize jèn ISG15-(ki se, silans oswa KO) efè antiviral MDA5 ISGylation maske pa regilasyon aberan ISG akòz ablasyon efè inhibition ISG15 sou siyal IFNAR.
Figi 5|SCoV2 PLpro mare ak de-ISGylate MDA5–2CARD. yon Riban reprezantasyon estrikti kristal SCoV2 PLpro: ISG15 konplèks (Protein Data Bank, asansyon No 6YVA). Rezid kle ki medyatè sit 1 entèraksyon (Asn156 ak Arg166/Glu167) oswa sit 2 entèraksyon (Phe69) nan PLpro, osi byen ke sit katalitik aktif li yo (Cys111), yo endike. b, ISGylation nan GST-MDA5-2CARD nan selil HEK293T ki te ko-transfekte pou 20 èdtan ak vektè oswa V5-tagged SCoV2 PLpro WT oswa mutan, ansanm ak FLAG-ISG15, HA-Ube1L ak FLAG-UbcH8, detèmine pa GST PD ak IB ak anti-FLAG ak anti-GST. WCL yo te sonde pa IB ak anti-V5, anti-HA, anti-FLAG, ak anti-aktin. c, Liaison de HA-tagged MDA5 oswa RIG-I ak V5-tagged SCoV2– PLpro oswa FLAG-tagged MeV-V (kontwòl pozitif) nan selil HEK293T transfekte transfè, detèmine pa HA PD ak IB ak anti-V5 oswa anti-drapo, ak anti-HA. WCL yo te sonde pa IB ak anti-V5 ak anti-FLAG. d, Oligomerizasyon FLAG-MDA5-2CARD nan selil HEK293T ki te ko-transfekte ak vektè, oswa V5-tagged SCoV2 PLpro WT oswa Cys111Ala pou 24 èdtan, NativePAGE ak IB evalye pa anti-FLAG. WCL yo te analize plis pa SDS-PAGE ak IB sonde ak anti-FLAG, anti-V5, ak anti-aktin. e, ISGylation nan GST–MDA5–2CARD nan selil HEK293T ki te eksprime tou FLAG–ISG15, HA–Ube1L, ak FLAG–UbcH8, epi yo te ko-transfekte pou 40 èdtan ak vektè oswa V5-tagged coronaviral PLpro. pwoteyin, detèmine pa GST PD ak IB ak anti-FLAG, anti-V5 ak anti-GST. Done reprezante omwen de eksperyans endepandan ak rezilta menm jan an.
Nou pwochen te anplwaye yon tès pwoteksyon viris ki eksperimantal dekouple siyal MDA5 nan selil ki enfekte ak viris soti nan siyal IFNAR en nan selil yo menm (figi 4e). Supernatant ki soti nan selil 'donatè' ki enfekte ak mutEMCV ki te swa si. C transfekte, oswa apovri nan swa ISG15 oswa MDA5, yo te iltravyolèt (UV) inaktive ak Lè sa a, transfere sou selil 'destinatè' ki pa enfekte. Lè sa a, selil moun k ap resevwa 'Primed' yo te enfekte ak ZIKV pou kontwole dirèkteman efè antiviral pwodiksyon IFN MDA5-medyatè pa selil donatè yo. Lè nou konsidere ke supernatant yo soti nan si. Selil 'donatè' C-transfekte yo ki pisan anpeche replikasyon ZIKV, ak supernatant yo ki soti nan selil knockdown ISG15 oswa MDA5 minim restriksyon enfeksyon ZIKV (Fig. 4f). Menm jan an tou, supernatant kilti ki soti nan selil donatè EMCV ki enfekte transfekte ak WT MDA5 ansanm ak si. C te mennen nan pi gwo pwoteksyon nan selil benefisyè yo soti nan defi viral la pase sa ki soti nan selil eksprime WT MDA5 ak apovri nan ISG15 (Fig. 4g). Ansanm, done sa yo montre ke ISGylation enpòtan pou restriksyon MDA5-medyatè nan yon seri viris RNA.
Figi 6|SCoV2 PLpro anpeche siyal ISG15-medyatè MDA5 atravè aktivite de-ISGylase li yo. a, RT-qPCR analiz de IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5, ak RIG-I transkripsyon nan NHLF yo ki te transfekte ak siRNAs endike yo pou 4 0 h ak Lè sa a, transfekte ak mock RNA oswa SCoV2 RNA (0.4 µg ml). −1) pou 24 èdtan. b, Liaison nan SCoV2 Nsp3 ak MDA5 andojèn nan selil A549-hACE2 ki te enfekte ak SCoV2 (MOI=0.5) pou 24 èdtan, detèmine pa IP ak anti-MDA5 (oswa yon kontwòl izotip IgG) ki te swiv pa IB ak anti-Nsp3 ak anti-MDA5. WCL yo te sonde pa IB ak anti-Nsp3 ak anti-aktin. c, Endogenous MDA5 ISGylation nan selil A549–hACE2 ki te enfekte ak SCoV2 (MOI=0.5) pou 40 èdtan nan prezans inibitè PLpro (GRL{-0617; 50 µM) oswa machin. kontwòl (dimethylsulfoxide), detèmine pa IP ak anti-MDA5 (oswa yon kontwòl izotip IgG), ki te swiv pa IB ak anti-ISG15 ak anti-MDA5. Abondans pwoteyin nan IFIT1, RSAD2, ISG15, ak aktin nan WCL yo te sonde pa IB. IB te verifye replikasyon viris efikas ak anti-Nsp3 ak anti-Spike (S). d, analiz RT-qPCR nan transkripsyon IFNB1, CCL5, ak IFIT1, ak EMCV jenomik RNA (gRNA), nan selil HeLa ki te transfekte tanporèman pou 24 èdtan ak vektè, oswa V5-SCoV2 PLpro WT oswa mutan, ak Lè sa a, enfekte ak mutEMCV. (MOI=0.5) pou 12 h. e, tit EMCV nan sipènatan selil RIG-I KO HEK293 ki te transfekte transfèksyon pandan 24 èdtan ak vektè oswa FLAG-MDA5, ansanm ak V5-tagged SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala oswa Arg166Ser/Glu167Arg, epi apresa enfekte. ak EMCV (MOI=0.001) pou 16 èdtan, detèmine pa tès plak. f, Pwoteyin abondans nan ISG yo endike nan WCL yo soti nan eksperyans la nan e, detèmine pa IB ak antikò yo endike. Done yo reprezante omwen de eksperyans endepandan ak rezilta menm jan an (mwayèn ± sd nan n= 3 replike byolojik nan a, d, ak e). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
SCoV2 PLpro vize MDA5 pou de-ISGylation.
Kowonaviris tankou SARS-CoV (SCoV), MERS-CoV ak SCoV2 ki fèk parèt kode yon PLpro ki medyatè klivaj poliprotein viral33. Anplis de sa, PLpro gen aktivite debiquitinating ak de-ISGylating. SCoV2 PLpro dènyèman te montre modil repons antiviral prensipalman atravè aktivite de-ISGylase li yo15. Kòm yo rekonèt MDA5 se yon detèktè pi gwo pou detekte coronavirus34,35, epi paske done nou yo te montre ke ISGylation obligatwa pou restriksyon viris MDA5-medyatè, nou te egzamine si SCoV2 PLpro anzimatik retire MDA5 ISGylation pou antagonize iminite natirèl. SCoV2 PLpro WT, men se pa mutan katalitik inaktif li yo (PLpro Cys111Ala) 15, aboli ISGylation nan GST-MDA5-2CARD ak FLAG-MDA5 (figi 5a, b ak done pwolonje Fig. 6a). PLpro Asn156Glu ak Arg166Ser/Glu167Arg mutan yo, ki majinalman ak gwo pwoblèm nan ISG15 obligatwa nan 'sit 1' koòdone, respektivman14,36, te fè yon ti kras, oswa ou pa, afekte ISGylation. Kontrèman, PLpro Phe69Ala, nan ki koòdone 'sit 2' la ki pi preferans detèmine obligatwa nan ubiquitin, men se pa ISG15, detounen14,36, diminye MDA5 ISGylation osi pisan ke WT PLpro (Fig. 5a, b ak Done Pwolonje Fig. 6a). ). SCoV2 PLpro pa t ', sepandan, siprime ubiquitination RIG-I-2CARD (Done pwolonje Fig. 6b). Nou te jwenn ke PLpro kominike espesyalman ak MDA5, men se pa RIG-I, menm jan ak MeV-V ki mare MDA5 ak sèvi kòm yon kontwòl37 (Fig. 5c). Kantite ki ba nan PLpro inibit siyal pa MDA5, men se pa RIG-I, tandiske pi gwo kantite PLpro siprime siyal antiviral pa tou de RLRs (Done pwolonje Fig. 6c). Sa a ranfòse MDA5 kòm yon sib dirèk nan PLpro. De-ISGylation nan IRF3 pwobableman kont pou efè inhibition ke pi wo dòz PLpro genyen sou siyal RLR15,38. Lè w ap egzamine efè PLpro sou oligomerizasyon MDA5-2CARD, PLpro WT men pa Cys111Ala te bloke avèk efikasite oligomerizasyon MDA5-2CARD (figi 5d), ki endike ke SCoV2 PLpro inibit fòmasyon oligomer MDA5 ki depann de ISGylation atravè aktivite anzimatik li yo. Anzim PLpro ki gen rapò ak -coronavirus, SCoV, MERS-CoV ak viris epatit murin (MHV), osi byen ke -coronavirus HCoV-NL63 (NL63) tou mare ak efikasman redwi MDA5-2CARD ISGylation (Fig. 5e) , sijere ke antagonis MDA5 pa PLpro ka lajman konsève nan mitan coronavirus yo.
cistanche plant-ogmante sistèm iminitè
SCoV2 PLpro antagonize siyal ISG15-depandan MDA5.
Apre sa, nou te detèmine enpòtans siyal MDA5 ki depandan ISG15-pou endiksyon antiviral cytokine ki soti nan SCoV2. Kòm enfeksyon SCoV2 konnen pou yon minimòm pwovoke IFNs tip I akòz antagonism viral efikas39, nou izole total RNA soti nan SCoV2-selil ki enfekte ak Lè sa a, nou re-transfekte li nan selil yo estimile siyal iminitè natirèl. SCoV2 RNA, men se pa RNA ki soti nan mock-trete selil yo, fòtman pwovoke transkripsyon IFN; sepandan, endiksyon sa a te redwi anpil lè ISG15 oswa MDA5 te fèmen bouch (figi 6a). Knockdown RIG-I pa t 'fè yon move efè sou ekspresyon jèn antiviral SCoV2 RNA, ki endike ke SCoV2 RNA-PAMP yo prensipalman detekte pa aks ISG15-MDA5 (Fig. 6a).
Nou te jwenn ke SCoV2 ki pa estriktirèl pwoteyin 3 (Nsp3), nan ki PLpro bay manti, fasilman kominike avèk andojèn MDA5 pandan enfeksyon SCoV2 natif natal (Fig. 6b). Endogenous MDA5 ISGylation pa detektab nan selil ki enfekte SCoV2-, byenke viris la deklanche ekspresyon ISG15; sepandan, nan selil ki enfekte trete ak yon inhibitor15 espesifik PLpro, MDA5 ISGylation ak endiksyon ISG en te fòtman amelyore (Fig. 6c), sipòte pwopozisyon an ki PLpro efektivman siprime MDA5 ISGylation ak siyal pandan enfeksyon SCoV2 ap viv. Apre sa, nou te egzamine efè WT ak mutan PLpro sou deklanchman MDA5 andojèn pandan enfeksyon mutEMCV. Konfòm ak efè yo sou MDA5 ISGylation (Fig. 5b ak Done Pwolonje Fig. 6a), SCoV2 PLpro WT ak Phe69Ala anpeche endiksyon transkripsyon antiviral, tandiske MDA5 Arg166Ser / Glu167Arg, menm jan ak Cys111Ala mutan an, pa t 'afekte ekspresyon antiviral gene. 6d). An akò ak sa a, replikasyon mutEMCV te amelyore nan selil ki eksprime PLpro WT oswa Phe69Ala, men se pa nan selil ki eksprime PLpro Cys111Ala oswa Arg166Ser / Glu167Arg (Fig. 6d). Menm jan an tou, WT PLpro, men se pa mutan Arg166Ser/Glu167Arg oswa Cys111Ala, bloke restriksyon EMCV pa FLAG-MDA5 (Fig. 6e); efè a sou replikasyon viris ki gen rapò ak pwoteyin ISG pwovoke (figi 6f). Ansanm, sa a etabli SCoV2 PLpro kòm yon antagonis IFN ki aktivman de-ISGylates MDA5.
Diskisyon
Konjigezon ISG15 li te ye konfere aktivite antiviral nan yon foul moun nan viris; sepandan, se sèlman kèk substrate otantik yo te idantifye12. Nan lòt men an, ISG15 nan fòm ki pa konjige li aji provirally pa fòtifye USP 18-medyatè IFNAR-siyal anpèchman31,32,40. Etid la prezan idantifye yon wòl kle pou ISGylation nan MDA 5-medyatè IFN endiksyon. Travay nou an tou ensiste sou enpòtans ki genyen nan konsepsyon eksperimantal nan ki dekouplage wòl nan ISG15 nan aktivasyon MDA5 ak sa ki nan atenuasyon siyal IFNAR esansyèl pou revele pisan aktivite antiviral ISG15 la. Nan yon òganis ki enfekte, se pwobableman sòm plizyè evènman ISGylation (ki afekte tou de pwoteyin lame ak viral) ki detèmine rezilta enfeksyon ak patojèn, ki ka depann de kontèks12.
Benefis cistanche tubulosa-ranfòse sistèm iminitè
Konklizyon nou yo endike ke ISGylation nan MDA5 aji analòg ak Lys63-lye ubiquitination nan RIG-I5: tou de PTMs (1) yo reglemante pa PP1-dephosphorylation pwovoke ak (2) ankouraje oligomerization CARD ak RLR pi wo. -orde asanble yo. Sepandan, tandiske ubiquitin abondan nan tou de selil ki pa enfekte ak selil ki enfekte, ekspresyon ISG15 ogmante anpil pa eksitasyon IFN. Men, menm nan nivo fondamantal, ISG15 konjige ak anpil pwoteyin lame20, ki gen ladan MDA5 jan travay nou te montre, ki ka ase pou premye deklanchman MDA5. Pandan enfeksyon viral yo detekte pa plizyè PRR, MDA5 ISGylation ka yon mekanis 'priming' kote ISG15 upregulation pa yon detèktè imedya natirèl (pa egzanp, RIG-I)41 prime MDA5 pou antre nan yon mòd 'kick-start'. Kòm ISG15 kontwole negatif RIG-I16,17, ISGylation ka deklanche 'chanjman detèktè' kote deklanchman MDA5 ankouraje lè nivo ISG15 ogmante, pandan y ap aktivite RIG-I ap diminye. Nou idantifye ke SCoV2 PLpro antagonize MDA5 ISGylation atravè aktivite anzimatik li apre li fin mare nan Capteur a; estrateji sa a pwobableman konsève nan mitan coronavirus yo, ki jistifye plis envestigasyon. Analiz mikwoskopi kriyo-elektron revele ke Nsp3 coronaviral se yon pati nan yon konplèks pò ki kouvri vesik doub-manbràn ki sòti nan retikul endoplasmik epi ekspòte RNA42 viral ki fèk sentèz. Kidonk, MDA5 ka pozisyone tèt li tou pre sit la nan ekspòtasyon RNA viral pou fasilite deteksyon PAMP; sepandan, domèn PLpro nan Nsp3 (ki sou bò sitoplasmik la) bloke siyal MDA5 atravè de-ISGylation dirèk. Gen kèk viris ki ka anpeche MDA5 ISGylation tou atravè disregulasyon fosforilasyon MDA5, jan yo montre pou MeV-V. An rezime, etid nou an dekouvri yon wòl enpòtan pou ISGylation nan aktive MDA5-medyatè iminite osi byen ke anpèchman li pa SCoV2, revele yon potansyèl sib molekilè pou konsepsyon terapetik kont COVID-19.
Referans
1. Liu, G. & Gack, MU Fonksyon diferan ak òkestre nan detèktè RNA nan natirèl. Iminite 53, 26–42 (2020).
2. Wu, J. & Chen, ZJ Inate iminitè deteksyon ak siyal nan asid nikleyik cytosolic. Ann. Rev Immunol. 32, 461–488 (2014).
3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I ak lòt detèktè RNA nan iminite antiviral. Ann. Rev Immunol. 36, 667–694 (2018).
4. Schlee, M. Mèt detèktè patojèn RNA-RIG-I renmen reseptè yo. Imunobyoloji 218, 1322-1335 (2013).
5. Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I-like reseptè: règleman yo ak wòl nan deteksyon RNA. Nat. Rev Immunol. 20, 537–551 (2020).
6. Wies, E. et al. Dephosphorylation detèktè RNA RIG-I ak MDA5 pa fosfataz PP1 esansyèl pou siyal iminitè natirèl. Iminite 38, 437–449 (2013).
7. Gack, MU et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase esansyèl pou aktivite antiviral RIG-I-medyatè. Nature 446, 916-920 (2007).
8. Chiang, C. & Gack, MU Kontwòl pòs-tradiksyon nan chemen deteksyon patojèn intraselilè. Tandans Immunol. 38, 39–52 (2017).
9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Fonksyon pataje ak diferan nan entèferon tip I ak tip III. Iminite 50, 907–923 (2019).
10. Schoggins, JW entèferon-stimile jèn: kisa yo tout fè? Ann. Rev Virol. 6, 567–584 (2019).
11. Zhang, D. & Zhang, DE entèferon-ankouraje jèn 15 ak sistèm nan pwoteyin ISGylation. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119–130 (2011).
12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 nan iminite antiviral ak pi lwen. Nat. Rev Microbiol. 16, 423–439 (2018). 13. Hadjadj, J. et al. Aktivite entèferon tip I andikape ak repons enflamatwa nan pasyan ki grav COVID-19. Syans 369, 718–724 (2020).
14. Klemm, T. et al. Mekanis ak anpèchman proteaz ki sanble ak papain, PLpro, nan SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).
15. Shin, D. et al. Pwoteaz ki sanble ak papain kontwole pwopagasyon viral SARS-CoV-2 ak iminite natirèl. Nature 587, 657–662 (2020).
16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY Regilasyon negatif fidbak nan siyal antiviral RIG-I-medyatè pa konjigezon ISG15 entèferon-induit. J. Virol. 82, 1474–1483 (2008).
17. Du, Y. et al. LRRC25 anpeche siyal IFN tip I lè li vize RIG-I ki asosye ISG15-pou degradasyon otofajik. EMBO J. 37, 351–366 (2018).
18. Hato, SV et al. Te mengoviris lidè pwoteyin bloke entèferon-alfa/beta transkripsyon jèn ak inibit aktivasyon nan entèferon faktè regilasyon 3. Microbiol selil. 9, 2921–2930 (2007).
19. Deddouche, S. et al. Idantifikasyon yon agonist MDA5 ki asosye ak LGP2-nan selil ki enfekte ak picornavirus. eLife 3, e01535 (2014).
20. Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Te ISG15 sistèm konjigezon lajman vize pwoteyin ki fèk sentèz: enplikasyon pou fonksyon antiviral ISG15. Mol. Selil 38, 722–732 (2010).
21. Lenschow, DJ et al. Idantifikasyon jèn entèferon-stimile 15 kòm yon molekil antiviral pandan enfeksyon viris Sindbis nan vivo. J. Virol. 79, 13974–13983 (2005).
22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Phosphorylation-medyatè règleman negatif nan aktivite antiviral RIG-I. J. Virol. 84, 3220–3229 (2010).
23. Nistal-Villan, E. et al. Wòl negatif nan RIG-I serine 8 fosforilasyon nan règleman an nan pwodiksyon interferon-beta. J. Biol. Chem. 285, 20252–20261 (2010).
24. Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU Konvansyonèl pwoteyin kinaz C-alfa (PKC-alfa) ak PKC-beta negatif kontwole transdiksyon siyal antiviral RIG-I. J. Virol. 86, 1358–1371 (2012).
25. Davis, ME et al. Antagonism nan fosfataz PP1 pa pwoteyin lawoujòl viris V obligatwa pou chape iminitè natirèl nan MDA5. Cell Host Microbe 16, 19–30 (2014).
26. Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3eta chaperone pwoteyin ankouraje iminite natirèl antiviral atravè fasilite oligomerizasyon MDA5 ak redistribisyon entraselilè. PLoS Pathog. 15, e1007582 (2019).
27. Wu, B. et al. Baz estriktirèl pou rekonesans dsRNA, fòmasyon filaman, ak aktivasyon siyal antiviral pa MDA5. Selil 152, 276–289 (2013).
28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Estrikti Cryo-EM nan filaman MDA5-dsRNA nan diferan etap nan idroliz ATP. Mol. Selil 72, 999–1012 (2018).
29. Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Te detèktè iminitè natirèl LGP2 aktive siyal antiviral pa reglemante entèraksyon MDA5-RNA ak asanble filaman. Mol. Selil 55, 771–781 (2014).
30. Uchikawa, E. et al. Analiz estriktirèl nan dsRNA obligatwa nan reseptè rekonesans modèl anti-viral LGP2 ak MDA5. Mol. Selil 62, 586–602 (2016).
31. Malakhova, OA et al. UBP43 se yon regilatè roman siyal entèferon endepandan de aktivite izopeptidaz ISG15 li yo. EMBO J. 25, 2358–2367 (2006).
32. Zhang, X. et al. ISG15 imen intraselilè anpeche entèferon-alfa/beta twòp anplifikasyon ak oto-enflamasyon. Nature 517, 89–93 (2015).
33. Harcourt, BH et al. Idantifikasyon pwodi kowonaviris sendwòm respiratwa grav grav epi karakterizasyon aktivite proteaz ki sanble ak papain. J. Virol. 78, 13600–13612 (2004).
34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Murine coronavirus sourit epatit viris MDA5 rekonèt epi li pwovoke entèferon tip I nan macrophages/microglia nan sèvo. J. Virol. 82, 9829–9838 (2008).
35. Menachery, VD et al. Atténuation ak restorasyon gwo sendwòm respiratwa egi kowonaviris mutan ki manke aktivite 2′-O-methyltransferase. J. Virol. 88, 4251–4264 (2014).
36. Bekes, M. et al. Rekonesans Lys48-di-ubiquitin ak aktivite deubiquitinating nan proteaz ki sanble ak papain coronavirus SARS la. Mol. Selil 62, 572–585 (2016).
37. Childs, K. et al. mda-5, men se pa RIG-I, se yon sib komen pou pwoteyin paramyxovirus V. Viroloji 359, 190-200 (2007).
38. Shi, HX et al. Règleman pozitif nan entèferon faktè regilasyon 3 aktivasyon pa Herc5 atravè modifikasyon ISG15. Mol. Selil Biol. 30, 2424–2436 (2010).
39. Blanco-Melo, D. et al. Repons lame dezekilib nan SARS-CoV-2 mennen devlopman COVID-19. Selil 181, 1036–1045 (2020).
40. Speer, SD et al. Defisi ISG15 ak ogmante rezistans viral nan imen men pa sourit. Nat. Komin. 7, 11496 (2016).
41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. Te wòl esansyèl, ki pa redondant RIG-I ak MDA5 nan detekte ak kontwole enfeksyon viris West Nile. J. Virol. 87, 11416–11425 (2013).
42. Wolf, G. et al. Yon pò molekilè kouvri doub manbràn òganèl replikasyon coronavirus la. Syans 369, 1395–1398 (2020).
43. Gwo, EO et al. Etablisman yon liy selil glial fetis imen ki sipòte miltiplikasyon viris JC. Pwosedi. Natl Acad. Sci. USA 82, 1257–1261 (1985).
44. Hertzog, J. et al. Enfeksyon ak yon izole brezilyen nan viris Zika jenere RIG-I stimulatory RNA ak viral NS5 pwoteyin blòk tip I IFN endiksyon ak siyal. Lajan ewo. J. Immunol. 48, 1120–1136 (2018).
45. Cerikan, B. et al. Adaptasyon selil-intrinsèk ki soti nan ablasyon kwonik nan yon regilatè kle rho GTPase. Dev. Selil 39, 28–43 (2016).
46. Chan, YK & Gack, MU Yon mekanis ki baze sou fosfomimetik nan viris deng pou antagonize iminite natirèl. Nat. Imunol. 17, 523–530 (2016).
47. Riedl, W. et al. Zika viris NS3 imite yon 14-3-3-motif ki konekte selilè pou antagonize RIG-I- ak MDA5-medyatè iminite natirèl. Cell Host Microbe 26, 493–503 (2019).
48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM STAT3 ubiquitylation ak degradasyon pa malmouton viris siprime cytokine ak onkogene siyal. J. Virol. 77, 6385–6393 (2003).
49. Oudshoorn, D. et al. HERC6 se E3 ligase prensipal la pou konjigezon ISG15 mondyal nan selil sourit yo. PLoS ONE 7, e29870 (2012).
50. Kim, DK et al. Yon koleksyon konplè, fleksib nan rejyon kodaj SARS-CoV-2. G3 (Bethesda) 10, 3399–3402 (2020).
51. Chiang, C. et al. Onkoprotein E6 papillomavirus imen an vize USP15 ak TRIM25 pou siprime siyal iminitè natirèl RIG-I-medyatè. J. Virol. 92, e01737-17 (2018).
52. Gack, MU et al. Wòl RIG-I N-tèminal tandem CARD ak variant épissure nan TRIM25-transdiksyon siyal antiviral medyatè. Pwosedi. Natl Acad. Sci. USA 105, 16743–16748 (2008).
53. Chiang, JJ et al. Demaske viral nan transkripsyon pseudogene selilè 5S rRNA pwovoke iminite RIG-I-medyatè. Nat. Imunol. 19, 53–62 (2018).
54. Sparrer, KMJ et al. TRIM23 medyatè viris-induit otofaji atravè aktivasyon nan TBK1. Nat. Microbiol. 2, 1543–1557 (2017).