Kaempferol soulaje domaj LD-mitokondriyo pa ankouraje otofaji: Enplikasyon nan maladi Parkinson Pati 2

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Nan MPP plis-trete selil yo, ki te ranvèse pa Ka (Fig.5a ak b).

Ogmantasyon aktivite newòn prevwa deklanche lipid ak peroksidasyon FA [33] epi li ka pwovoke pa MPP plis ekspoze. Lè sa a, nou te evalye si LD yo depoze yo te sibiperoksidasyonapre MPP plis tretman lè l sèvi avèk Ratiometric lipid peroksidasyon Capteur BODIPY 581/591 C11 (BD-Cl1). Apre peroksidasyon, pik emisyon fliyoresan BD-C1 la deplase soti nan 590 (wouj) a 510 (vèt) nm [34]. Nou te obsève yon ogmantasyon nan rapò BD-C11 (vèt-wouj) nan SH-SY5Y.

Fig. 4. （a） Vitabilite selil yo te mezire nan ka-trete (0, 3,30,60,100,300, oswa 600 μM; 24 h) selil SH-SY5Y pa tès CCK-8. Yo montre estrikti chimik Ka anba koub la. (b) Test LDH nan selil SH-SY 5Y trete ak Ka (3.10.30, oswa 60 uM) ak / oswa MPP (400 uM.24 h). (ce) Ka (30 UMD-ak/oswa MPp plis (400 uM)-trete SH-SY5Y selil yo te tache ak Hoechst 33,342 ak PI ak Lè sa a, obsève pa mikwoskopi fluoresans. Ba echèl, 80 μm. Quantification de Hoechst-pozitif (d )ak Hoechst/PI doub-pozitif (e) selil yo te fèt. (fg) SH-SY5Y selil yo te trete ak Ka (30 UMD- ak / oswa MPp plis (400 UMD pou 24 èdtan, Lè sa a, apoptoz te evalye pa Annexin V /). PI tach ak sikometri koule. Done yo pou analiz sikometri koule yo prezante kòm yon pousantaj nan popilasyon selil la pa nòmalize echantiyon kontwole. (hk) Ka (30 uM)-pretrete selil SH-SY5Y yo te ankouraje avèk oswa san MPp plis (400). uM, Reprezantan imunoblots (h) ak analiz quantitative Bcl-2, Bax,procaspase-3, ak kaspas clived-3 nan ekstrè selil (i,j,k). Done yo eksprime kòm mwayen ± SEM epi yo reprezante omwen twa eksperyans endepandan *P<0.05,><0.01,><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="">kaempferol.

Fig, 5. Ka siprime MPp plis-induit akimilasyon LD ak oksidasyon lipid-medyatè domaj mitokondriyo nan selil SH-SY5Y.SH-SY

Selil 5Y yo te pretrete ak Ka （30 μM） pou 3 èdtan anvan MPP plis （400 μM）stimulasyon pou 24 èdtan (ab) Imaj reprezantatif nan BODIPY 493/503 tach (a) ak analiz quantitative akimilasyon LD (b). Done yo kantite nòmalize nan gwoup kontwòl la. Echèl bars.20 um,(cd) Imaj reprezantatif BODIPY 581/591 Cl1 (BD-Cl1) tach (c).Wouj (591 nm) ak vèt (488 nm) montre total ak peroksidize lipid, respektivman. Kantite rapò peroksidasyon lipid (vèt / wouj) nòmalize nan gwoup kontwòl la (d). Twa eksperyans endepandan yo te fèt; n =5 kouvèti/tretman. Ba echèl, 20 um. (ef) Selil vivan yo te tache ak JC-1 pou 30 minit epi yo te analize pa mikwoskopi (e), Quantification nan potansyèl manbràn mitokondriyo a (f. Done yo reprezante twa eksperyans endepandan, yon kantite total {{22} } selil/tretman yo te bay nòt pou analiz quantitative.(gh)Mikwoskopik analiz mitokondri yo te kontwole pa imunostaining pou Tomm20(g).Kantifikasyonnan lamitokondriyozòn nòmalize nan gwoup kontwòl la (h). Twa eksperyans endepandan yo te fèt; 20 selil / tretman yo te bay nòt pou analiz la quantitative.

Tanpri klike la a pou w konnen plis

(ij) Nivo ATP (i) ak Na plis -K plis -ATPaz aktivite (j) yo te mezire. Done yo eksprime kòm mwayen ± SEM ki soti nan twa eksperyans endepandan. ns, pa enpòtan, *P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mpp+,1-methyl-4-phenylpyridinium..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="">

selil trete ak MPP plis, ki endike ogmante peroksidasyon lipid, ki te anpeche pa Ka (figi 5c ak d).

Chanjman nan LD yo ka deklanche malfonksyònman nan anpil òganèl intraselilè, espesyalman mitokondri [16], ak estrès oksidatif se yon faktè enpòtan ki enplike nan domaj mitokondriyo ki ka pwovoke pa MPP plis [35]. Efò yo te fè yo eksplore wòl peroksidasyon lipid nan domaj mitokondriyo MPp plis-induit, epi nou egzamine chanjman nan potansyèl mitokondriyo ak mòfoloji mitokondriyo nan kontwòl ak selil MPP plis trete. Jan yo obsève, te gen yon diminisyon nan potansyèl manbràn mitokondriyo nan selil trete ak MPP * (Fig. 5e ak D, osi byen ke yon rediksyon nan gwosè mitokondriyo, jan sa evidanimunostainingpou Tomm20, yon pwoteyin ki sitiye nan manbràn mitokondriyo ekstèn lan (Fig.5g ak h), ak efè sa yo te soulaje pa adisyon nan a-tokoferol, yon antioksidan espesifik lipid-idrosolubl (Fig. 5e-h). Anplis de sa, a-tokoferol siyifikativman soulaje mank enèji MPP-induit, jan sa endike nan nivo ATP ak Na plis -K plis -ATPase aktivite (Fig.5i ak j), ki tou reflete fonksyon mitokondriyo. Done sa yo sijere ke Ka diminye akimilasyon MPp plis-induced LD pou anpeche peroksidasyon lipid, ki agrave domaj mitokondriyo nan selil SH-SY5Y.

Cistanche ka amelyore iminite

Rezilta 6. Ka ankouraje otofaji ak diminye pwodiksyon mtROS nan selil SH-SY5Y MPP plis trete Nòmalman, LD yo delivre nan lizozom atravè otofaji epi yo ka kraze nan FAs pou evite peroksidasyon. Sepandan, prèv endike ke otofaji gen pwoblèm, ki jwe yon wòl enpòtan nan PD [2]. Lè otofaji enplike nan pòsyon LD yo dwe kraze nan lizozòm (Fig.6a), pwosesis la espesyalman rele lipofaji [2]. Pou mennen ankèt sou si otofaji enplike nan efè neuroprotective Ka, nou egzamine nivo pwoteyin ki asosye ak otofaji. Jan yo montre nan Fig. 6b-d, nan kiltive selil SH-SY5Y, nivo a nan chèn limyè pwoteyin mikrotubule-asosye 3 (LC3)-I te ansibleman redwi, pandan y ap ekspresyon nan p62 te ansibleman ogmante nan MPP plis -selil trete, jan yo mezire pa imunoblot, ak efè sa a te siyifikativman ranvèse pa Ka. Nou plis egzamine chanjman ki fèt nan otofaji pa imunostaining pou LC3. Pou pèmèt otofagosòm yo akimile nan selil yo, yo te ajoute bafilomicin pou anpeche fizyon otofagosòm ak lizozom. Jan yo montre, ogmante kantite LC3b puncta yo te detekte nan selil MPP plis trete yo, ki endike degradasyon otofajik ki gen pwoblèm, e efè sa a te ranvèse tou pa Ka (Fig.6e ak f. Rezilta sa yo endike ke LD nan selil SH-SY5Y yo mobilize pa). otofaji pou retire evantyèlman e ke Ka ka ankouraje otofaji pou diminye akimilasyon lipid soksid.Ogmantasyon peroksidasyon lipid ka agrave domaj mitokondriyo lè yo ogmante estrès oksidatif mitokondriyo [4].Anplis de sa, tretman Ka siyifikativman redwi jenerasyon mtROS solid, jan yo detèmine pa tach MitoSOX (figi). .6g ak h), ak diminye kantite mitokondri disfonksyonèl, jan yo detèmine pa etikèt mitokondri espesifik yo fè distenksyon ant respirasyon (MitoTracker gwo twou san fon wouj) ak total (MitoTracker vèt) mitokondri (Fig. 6i ak j).Anplis de sa, gen yon View dirèk nan chanjman mitokondriyo, nou te detekte plis pousantaj konsomasyon oksijèn (OCR) pa analizè Seahorse XF la.Jan Fig.6k, respirasyon mitokondri yo montre. te redwi nan selil MPP plis trete, pandan y ap tretman Ka evidamman ranvèse domaj sa a ki te koze pa MPP plis (Fig. 6k).

Rezilta 7. Anpèchman otofaji ranvèse efè sipresyon Kaon LD akimilasyon, malfonksyònman mitokondriyo, ak DA newòn aksidan an vitro.

Pou egzamine si otofaji se youn nan mekanis prensipal yo pa ki ka medyatè DAneropwoteksyon, yo te itilize inhibiteur otofaji 3-MA. Nou te jwenn ke efè inhibition Ka sou MPp plis -pwovoke aksidan, ki gen ladan diminye akimilasyon LD (Fig. 7a ak b), redwi pwodiksyon mtROS (Fig. 7c ak d), ak soulaje malfonksyònman mitokondriyo (Fig. 7e ak f nan SH). Selil -SY5Y yo te bloke anpil pa 3-MA. Piske oksidasyon LD ak malfonksyònman mitokondriyo yo asosye byen ak lanmò newòn DA, nou te egzamine pwochen newòn DA ki kiltive yo. Nou te trete mesencephalon kiltive TH plis newòn ak Ka ak/oswa MPPt ak te quantifye kantite ak longè pwosesis newòn TH yo pa imunostaining. Analiz mòfolojik te revele ke kantite ak longè pwosesis newòn yo te siyifikativman diminye pa MPP plis ak pwoteje pa Ka, epi pwoteksyon sa a te ranvèse pa 3- MA (Fig. 7g-i) Done sa yo endike ke Ka soulaje domaj newòn DA nan fè pwomosyon otofaji.

Rezilta 8. Silans Atg5 aboli prevansyon Ka-medyatè pèt newòn nan vivo

Pou plis konfime ke Ka pwoteje kont MPTP/p-induit TH plis pèt newòn nan yon fason ki depann de otofaji, nou silans Atg5 pa microinjecting yon viris adeno-asosye (AAV-eksprime yon shRNA deja karakterize kont Atg5 nan mesencephalon bilateral la (Fig. 8a) jan sa te dekri anvan [25].Nan eksperyans preliminè, nou te obsève ke transfè Atg5 shRNA pou 2 semèn reyalize ase ekspresyon GFP nan newòn THt (Fig.8b) ak inibit ekspresyon ATG5 nan SNpc nan sourit yo sou fòm piki (Fig.8c) Nou te jwenn ke Atg5-knockdown ranvèse efè neropwotektif Ka a, jan sa pwouve pa ekspresyon pwoteyin ki regilasyon TH (figi 8d ak e) ak ogmante kantite newòn TH (figi 8f ak g). plis sipòte kontribisyon nan otofaji nan efè pwoteksyon Ka nan sourit PD. An konklizyon, nou konfime ke Ka pwoteje kont MPTP / blesi p-induit pa diminye LD.oksidasyon ak malfonksyònman mitokondriyopa ankouraje otofaji.

4. Diskisyon

Etid la te montre ke ti molekil natirèl Ka a te yon faktè kle kote siyal otofajik te kapab anpeche toksisite oksidatif lipid. Rezilta nou yo te demontre ke wout otofaji a se yon bouk regilasyon kle nan ki Ka soulaje peroksidasyon LD ak domaj mitokondriyo ki vin apre yo epi konsantre sou wòl toksisite LD otofaji-reglemante nan soulaje domaj mitokondriyo pandan y ap pre-ventile neurodegenerasyon akòz estrès oksidatif twòp (Fig. 9).

LD yo se sit intraselilè nan depo net lipid [5] epi yo kritik pou metabolis lipid ak omeyostazi enèji, pandan y ap malfonksyònman LD yo te lye nan anpil maladi [16]. Prèv akimile te sijere ke wòl LD yo jwe nan byoloji ak patoloji yo siyifikativman pi laj pase te panse deja. Nan CNS la, prèv yo montre ke ogmante LD nan newòn ak glia yo enplike nan patoloji neurodegenerative [10,36].An detay, LD yo te detekte tou de nan axons yo nan newòn Aplysia kiltive nan vitro [37] ak nan seksyon nan sèvo soti nan. Modèl maladi Huntington [38]. Anplis de sa, li te montre ke newòn yo patikilyèman sansib a toksisite lipid, ak akimilasyon nan LDs ki pa ka retire nan yon fason apwopriye mennen nan peroksidasyon LD akselere epi yo ka bay monte nan neurodegeneration [171.

Akimilasyon lipid nan newòn ipèaktif se toksik pa sèlman akòz sansiblite lipid sa yo nan peroksidasyon. Anplis, sa ki depase LD yo ka antre nan chemen metabolik ki pa oksidatif, sa ki lakòz twòp pwodiksyon seramid, ki toksik pou selil yo [39]. Dènye etid yo te montre tou ke nan selil LD ki defektye, FA yo ka konvèti nan acilcarnitines, ki Lè sa a, lakòz malfonksyònman mitokondriyo ak pwodiksyon ROS [40]. Pwosesis sa yo gen anpil chans pou yo gen konsekans espesifik ak pwofon nan newòn ipèaktif paske mitokondri disfonksyonèl konpwomi kapasite pou konsomasyon FA, ak pwodiksyon mtROS plis lakòz peroksidasyon lipid manbràn.

Kidonk, omeyostaz LD ta dwe byen kontwole nan newòn, ki se kritik pou evite toksisite epi finalman kenbe sante nan sèvo a. Nan etid la prezan, nou te jwenn ke ti molekil natirèl Ka a inibit toksisite newòn LD ki manifeste kòm ogmante akimilasyon LD, peroksidasyon lipid ki wo, ak ekspresyon jèn ki gen rapò ak toksisite lipid regilasyon nan selil MPP plis ensilte SH-SY5Y. Sa ki pi enpòtan, nou te montre tou ke tretman Ka diminye a

Fig. 6. Ka ankouraje otofaji ak diminye pwodiksyon mtROS nan selil SH-SY5Y MPP plis trete yo.

Ka (30 uM, 3 h)-pretreated SH-SY5Y selil yo te ankouraje ak (oswa san) MPP (400 uM, 24 h). (a) Degradasyon LDs (LDs) atravè otofaji, ki rele lipofaji. (bd) Reprezantan imunoblots (b) ak analiz quantitative LC3 (c) ak p62 (d) nan sitoplasm selil SH-SY5Y yo. Done yo kantite nòmalize nan gwoup kontwòl la. (ef) Imaj reprezantan nan LC3B puncta yo te analize lè l sèvi avèk mikwoskospi konfokal (e). Selil yo te trete ak bafilomicin anvan imunostaining. Ba echèl, 20 um. Kantite LC3B puncta pou chak selil te quantified(f). (gh) SH-SY5Y selil yo te tache ak MitoSOX ak analize pa mikwoskòp konfokal (g). Nwayo yo te tache ak DAPI (ble). Ba echèl, 20 um. Kantifikasyon entansite fliyoresan MitoSOX lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ (h). (ii) SH-SY5Y selil yo te tache ak MitoTracker Green ak MitoTracker gwo twou san fon wouj ak analize pa sikometri koule (h) ak kantite mitokondri disfonksyonèl yo te quantifye (i). Done yo eksprime kòm mwayèn ± SEM nan twa a senk eksperyans endepandan.

(k) Pousantaj konsomasyon oksijèn (OCR) selil SH-SY5Y vivan yo te detèmine pa analizè Seahorse XF, apre piki oligomycin. FCCP, ak rotenone/antimycin A. (n =3, vle di ± SD). *P<0.05.**p><>< 0.001,="" by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka.="" kaempferol;="" mpp+,1-methyl-4-phenylpyridinium..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="">

Fig. 7. Anpeche otofaji ranvèse efè pwoteksyon Kaon MPp plis blesi pwovoke nan selil newòn yo. Selil SH-SY5Y yo te trete ak 3-MA (3 mM) pou 1 èdtan anvan Ka （30 μM, 3 h） tretman ki te swiv pa MPP plis (400 μM, 24 h) eksitasyon. （ab）Imaj reprezantatif（a） ak quantification （b）akimilasyon LD nan selil SH-SY5Y. Nwayo yo te tache ak DAPI (ble). Ba echèl, 40 μm. （cd）Selil SH-SY5Y yo te tache ak MitoSOX（c）, epi mtROS yo te quantifye （d）. Ba echèl, 40 μm.（ef） SH-SY5Y selil yo te tache ak MitoTracker Green ak MitoTracker gwo twou san fon wouj ak analize pa flow cytometry （e） ak kantite mitokondri disfonksyonèl yo te quantifye (f). (gi) Mesencephalic prensipal newòn yo te pretreated ak 3-MA (3 mM,1 h), ki te swiv pa Ka (30 uM,3 h) ak MPp plis (50uM,24 h)tretman. Imaj reprezantatif nan TH imunostaining nan newòn (g) ak quantification nan nimewo a vle di branch (h) ak longè total neurite (i).Ba echèl, 100 μm. Done yo reprezante twa eksperyans endepandan, yo te konte yon kantite total 17-20 newòn/tretman an （h,j）. Done yo eksprime kòm mwayèn ± SEM nan twa a senk eksperyans endepandan.*P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mpp+,1-methyl-4-phenylpyridinium..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="">

akimilasyon LDs ak diminye ekspresyon jèn toksisite lipid nan modèl sourit PD MPTP-induit. Done sa yo endike ke Ka ka siprime LD toksisite nan vitro ak nan sourit modèl PD.

Etid nou an plis revele mekanis molekilè ki kache efè sipresyon Kaon LD-medyatè toksisite. Li te demontre ke LDs ektopik ki estoke ak entèmedyè lipid toksik yo pwodwi yo ka lakòz efè danjere ke yo kolektivman ke yo rekonèt kòm lipotoksisite ak kontribye nan pwoblèm siyal selilè, malfonksyònman mitokondriyo, ak lanmò selil [29,41]. Prèv émergentes te revele yon korelasyon negatif ant yon rediksyon nan otofaji

Fig. 8. Atg5 knockdown blunts Ka-medyatè anpèchman nan neurodegeneration nan sourit MPTP/p-blese.

Tout sourit yo te sou fòm piki ak AAV-EGFP-shRNA kont Atg5 oswa kontwòl （1 ul nan 1013 jenom viral / ul, bilateralman）, ki te swiv pa MPTP/p-induced （saline kòm blesi kontwòl ak / oswa tretman Ka, jan sa dekri deja. (ab) Immunostaining verifye transfè AAV (GFP) nan TH plis newòn (wouj) (a). Ba echèl yo jan sa endike a. Immunoblotting konfime knockdown ATG5 nan mesencephalon nan sourit sou fòm piki (b). (cd) Western blotting (c) ak analiz densitometrik (d) nan

quantification(f). Ba echèl la se jan sa endike a. Done yo eksprime kòm mwayen ±SEM.n=4-5 sourit pou chak gwoup.ns, pa enpòtan,*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="">

ak PD [42,43].Autophagy se yon sistèm degradasyon katabolik kote eleman selilè ki pa nesesè oswa ki domaje yo degrade ak resikle [44]. Prèv sijere ke otofaji jwe yon wòl esansyèl nan kenbe omeyostazi lipid selilè nan tisi miltip [18,28]. 29]. Aktivasyon famasi oswa jenetik otofaji a ka retade aparisyon an ak soulaje patoloji PD [25,44]. Lipofaji jwe yon wòl esansyèl nan neurodegeneration ki asosye ak PD, ki lye kontwòl kalite mitokondriyo ak neurodegeneration kwonik [38,

45].Nan etid prezan an, nou te obsève otofaji / lipofaji ki defektye nan selil newòn MPP plis blese, ki gen ladan nivo redwi LC3-II ak ekspresyon p62 ki wo, ak yon ogmantasyon kantite LC3B puncta depoze nan selil yo. Lipofaji ki defektye nan selil SH-SY5Y ki blese yo te ranvèse pa tretman ak Ka. Kòm yon konsekans, Ka diminye akimilasyon nan LDs oksidize, mitokondri domaje, ak jenerasyon mtROs nan selil SH-SY5Y trete MPP yo. Sa ki enpòtan, anpèchman otofaji pa 3-MA aboli eliminasyon Ka-medyatè nan LDs oksidize ak mitokondri domaje ak soulajman nan blesi newòn DA nan vitro. Anplis, anpèchman otofaji pa Atg5 knockdown nan vivo ranvèse efè pwoteksyon Kaon DA koripsyon newòn nan modèl sourit PD MPTP-induit. Ansanm, rezilta sa yo endike ke Ka inibit domaj mitokondriyo ki gen rapò ak toksisite LD pa ankouraje otofaji nan yon modèl eksperimantal PD.

Prèv akimile endike ke ogmante jenerasyon mtROS se yon karakteristik prensipal nan newòn ki gen gwo aktivite e yo te obsève nan anpil NDD, ki gen ladan PD [46]. Rapò sou si ROS yo se yon kòz oswa konsekans fòmasyon LD yo kontradiktwa [47,48]. Enteresan, rezilta in vitro nou yo te demontre ke anpèchman famasi nan peroksidasyon LD ak -tokoferol anpeche jenerasyon mtROS ak anòmal potansyèl manbràn mitokondriyo ak soulaje rediksyon mitokondriyo, jan sa evidans Tomm20 tach nan selil SH-SY5Y, ki sipòte lide ke peroksidasyon LD jwe yon kozatif. wòl nan MPP-pwovoke malfonksyònman mitokondriyo ak jenerasyon an nan mtROS. Sepandan, li posib ke ROS elve okòmansman akselere fòmasyon LD, epi imedyatman, LD yo pwovoke plis jenerasyon ROS ak agrave nivo ROS intraselilè ak mitokondriyo.

Nan etid la prezan, nou te montre ke sourit ki gen MPTP-induit PD te gen nivo segondè nan akimilasyon LD, ki te akonpaye pa pèt la ogmante nan newòn DA, akselere estrès ROS-medyatè, ak defisi konpòtman. Tretman Ka anpeche LD toksisite nan vitro ak amelyore pèt newòn DA ak defisi konpòtman nan modèl sourit PD a, ak efè sa yo te depann de otofaji. Se poutèt sa, li rezonab pou konkli ke Ka ankouraje otofaji, ak otofaji amelyore sa a diminye akimilasyon LD oksidize, diminye pwodiksyon mtROS, ak soulaje domaj mitokondriyo nan newòn DA, ki kontribye nan anpèchman toksisite LD, kidonk diminye patoloji PD (figi). . 9).

Atik sa a soti nan https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.101911 Resevwa 23 Novanm 2020; Resevwa sou fòm revize 1 fevriye 2021; Aksepte 18 fevriye 2021