Kaempferol soulaje domaj LD-mitokondriyo pa ankouraje otofaji: Enplikasyon nan maladi Parkinson Pati 1

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé:Prèv émergentes endike ke depo inatandi ti gout lipid (LD) ak peroksidasyon ka akselere estrès òganèl epi li jwe yon wòl enpòtan nan patojèn nan maladi neurodegenerative (NDDs). Nan etid anvan nou an, nou te konfime ke kaempferol (Ka), yon flavonoid natirèl ti molekil, te ekspoze efè neuroprotective sou sourit ki gen maladi Parkinson la (PD) pwovoke LPS. Anplis de sa, etid anvan yo te montre ke otofaji jwe yon wòl enpòtan nan règleman an nan depo selilè LD. Nan etid aktyèl la, nou te montre ke Ka pwoteje kont pèt newòn ak defisi konpòtman nan sourit PD MPTP/p-induced, akonpaye pa redwi estrès oksidatif lipid nan substantia nigra pars compacta (SNpc). Nan selil newòn kiltive yo, Ka te montre yon seri konsantrasyon relativman an sekirite epi li te siyifikativman siprime akimilasyon LD ak apoptoz selilè pwovoke pa MPP plis. Pli lwen etid endike ke efè pwoteksyon Ka a te depann sou otofaji, espesyalman lipofaji. Kritikman, Ka ankouraje otofaji medyatè degradasyon LD nan lizozòm, ki Lè sa a, soulaje depozisyon lipid ak peroksidasyon ak domaj mitokondriyo ki kapab lakòz, kidonk diminye lanmò newòn. Anplis de sa, AAV-shAtg5-medyatè Atg5 knockdown aboli efè neropwotektif Ka kont oksidasyon lipid nan sourit PD. Travay sa a demontre ke Ka anpeche koripsyon newòn dopaminèrjik nan PD atravè anpèchman nan domaj mitokondriyo peroksidasyon lipid-medyatè pa ankouraje lip-ophagy epi li bay yon potansyèl nouvo estrateji terapetik pou PD ak NDD ki gen rapò.

Tanpri klike la a pou w konnen plis

1. Entwodiksyon

Maladi Parkinson la (PD) se yon maladi neurodegenerative komen (NDD) ki patolojikman karakterize pa pèt pwogresif newòn dopaminèjik (DA) nan substantia nigra pars compacta (SNpc). Malgre ke etyoloji egzak la ak kou natirèl maladi sa a poko klarifye nèt,anpilPwosesis nan nivo sistèm ak malfonksyònman, ki gen ladan fonksyon mitokondriyo, omeyostazi dopamine, neroenflamasyon, ak otofaji, yo te enplike nan patojèn nan PD [1,2]. Dènye rapò te revele ke gout lipid (LD) ki gen rapòlipotoksisiteta ka patisipe nan patoloji PD [3,4]. LD yo se òganèl trè dinamik ki sòti nan manbràn retikul endoplasmik (ER) epi nòmalman sèvi kòm sit entraselilè nan depo net lipid [5]. Dènyèman te montre LD yo jwe yon wòl pi laj pase depo asid gra (FA) epi patisipe nan anpil maladi. Pou egzanp, selil myeloid, ki gen ladan macrophages, leukocytes, ak eozinofil, fòme LD an repons a enflamasyon ak estrès, ak LD yo se sit pwodiksyon ak depo cytokine enflamatwa epi yo plis patisipe nan prezantasyon antijèn ak clearance patojèn [6]. Sa ki enpòtan, nan ateroskleroz, selil kim LD ki rich yo te demontre yo dwe danjere nan tout etap maladi a [7].

Cistanche ka amelyore iminite

Sepandan, LD yo pa te etidye anpil nan sistèm nève santral la (CNS), ak kèk papye rapòte prezans histolojik nan LD nan tisi nan sèvo imen [8,9]. Menm si sa, LD yo ka gen fonksyon enpòtan nan sèvo a, kòm etid resan konfime ke LDs total nan glia akselere neurodegeneration nan yon modèl Drosophila [10]. Yo te rapòte dènyèman ke nan sourit, lwil oliv wouj O-pozitif selil ki chaje lipid, ki gen ladan newòn, glial fibrillary asid pwoteyin (GFAP) plis astwosit, ak iyonize kalsyòm-obligatwa molekil adaptè -1 (IBA{{7} }) plis microglia, yo prezan nan anpil rejyon nan sèvo epi yo montre yo patisipe nan pwosesis ki asosye ak laj [1]. Travay anvan nou an te demontre tou ogmante akimilasyon LD nan sèvo a nan yon modèl sourit PD [12]. Ansanm, etid sa yo sijere ke LD yo ka patisipe nan patojèn nan PD, osi byen ke lòt NDDs.

Nòmalman, LD intraselilè yo degrade nanlizozòmepi delivre FAs nan mitokondri pou konsomasyon yo kòm yon sous enèji altènatif pandan peryòd rediksyon eleman nitritif [13]. Sepandan, newòn yo gen yon kapasite ki ba pou konsomasyon mitokondriyo FA pou pwodiksyon enèji [14]. Karakteristik sa a fè newòn yo patikilyèman sansib nan akimilasyon LD ak peroksidasyon. Anplis de sa, akimilasyon nan LDs amelyore pousantaj oksidasyon FA a epi li enpoze presyon ki pèsistan sou chèn transpò elèktron mitokondriyo a, ki ogmante pwodiksyon espès oksijèn reyaktif (ROS) pa konplèks chèn transpò elektwon I ak II [15] pou anplifye estrès oksidatif. Surcharge lipid tou mennen nan pwodiksyon ROS pa sous ekstramitokondriyo tankou nikotinamid adenine dinucleotide fosfat (NADPH) oksidaz ak lòt oksidatif.anzim. Konbine ak ekspresyon diminye nan anzim antioksidan ak kapasite ki ba pou konsomasyon FA nan newòn, akimilasyon LD medyatè estrès oksidatif epi li ka plis mennen nan domaj mitokondriyo.malfonksyònman lizozomal, otofaji ki defektye, ak aktivasyon an nan repons enflamatwa [6,17]. Sòf si LD yo akimile yo ka anpeche oswa retire, newòn trè aktif sibi fizyoloji, ki bay monte nan neurodegeneration [17]. Prèv endike ke pwosesis katabolik lizozom ki te medyatè yo rele otofaji jwe yon wòl esansyèl nan kenbe omeyostazi LD selilè nan tisi miltip [17,18]. An detay, LD yo ka selektivman sekrete nan autophagosomes epi delivre nan lizozom pou degradasyon pa lipas asid lizozomal, yon pwosesis ke yo rekonèt espesyalman kòm lipofaji [19]. Se poutèt sa, vize LD yo ak chemen yo retire otofaj yo ta ka reprezante yon apwòch roman nan jere neurodegeneration.

Etid la nan pwodwi natirèl ak ajan dyetetik kòm sous pou tretman potansyèl NDD ak estrateji te genyen yon enterè menmen nan dènye ane yo [20]. Kaempferol (Ka) se yon ti molekil polifenolik natirèl ki ka jwenn nan yon kantite remèd fèy Chinwa ak sous dyetetik [21]. Yo te rapòte ke Ka fè egzèsis efè anti-bakteri, anti-aje, ak imunomodulatwa, osi byen ke aktivite antioksidan ak neuroprotective [20,22,23]. Précédemment, Ka yo te rapòte yo anpeche enflamasyon nan selil microglial BV2 nan vitro [24] ak ogmante rezistans nan newòn DA nan neroenflamasyon nan vivo [25]. Sepandan, efè Kaon LDs nan PD poko te envestige.

Bay enpòtans LD yo ak koneksyon entim ant LDs, mitokondri, ak otofaji [16], ki tout patisipe nan PD, nou ipotèz ke Ka anpeche peroksidasyon LD ak anpeche DA neurodegeneration nan PD. Nan etid la prezan, nou demontre ke Ka siyifikativman pwoteje kont neurodegeneration nan yon modèl murin PD pa anpeche akimilasyon LD. Plis etid revele ke Ka deklanche otofaji ak redwi akimilasyon nan LDs oksidize pou soulaje malfonksyònman mitokondriyo ak pwodiksyon mitokondriyo ROS (mtROS), kidonk anpeche lanmò apoptotik newòn. Konklizyon yo jwenn nan etid sa a ka ede dirije desizyon klinik konsènan itilizasyon molekil natirèl Ka a nan NDD tankou PD.

2. Materyèl ak metòd

2.1. Bèt eksperimantal

Sourit C57BL/6J (gason, 4-mwa) yo te jwenn nan Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing). Sourit yo te kenbe ak elve nan Sant Resous Animal nan Fakilte Medsin, Nanjing Medical University, ak nan etablisman bèt nan Nanjing Drum Tower Hospital, Sourit yo gratis jwenn aksè nan manje ak dlo nan yon chanm ak yon tanperati anbyen nan 22 degre ±. 2 degre C ak yon sik limyè/fè nwa nan 12:12 h Tout pwosedi bèt yo te fèt an akò strik ak gid Gid Enstiti Nasyonal Sante pou swen ak itilizasyon bèt laboratwa yo.

2.2. Reyaktif

MPTP(M0896),3-MA (M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC> 95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 pousan ,96,353) pou eksperyans in vitro yo te jwenn nan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). BODIPY 493/503(D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) yo te achte nan men Thermo Fisher Scientific. Pou eksperyans bèt, Ka te fonn nan yon solisyon 10 pousan DMSO nan 16 pousan SBE- -CD nan saline esteril. Pou eksperyans selil, Ka te prepare nan DMSO (Sigma-Aldrich) ak PBS (konsantrasyon final DMSO se 0.01 pousan), pH 7.4.

2.3. Endiksyon ak tretman metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) - pwovoke PD modèl sourit

Pou evalye efè Ka nan modèl PD MPTP/p-toksisite, sourit (gason, ki gen laj 4-5 mwa) yo te owaza divize an gwoup trete saline, gwoup trete MPTP, MPTP plis ka trete. gwoup, ak Ka pou kont li trete gwoup. Nan gwoup MPTP-trete, sourit yo te resevwa MPTP kwonik administrasyon ak yon pwotokòl ki sanble ak sa ki te dekri deja [26]: MPTP te fonn nan saline epi yo te enjekte anba lar nan 25 mg / kg ki te swiv pa 250 mg / kg probenecid (fonn nan dimethyl sulfoxide) piki intraperitoneally (ip) nan entèval 1 èdtan chak 3.5 jou sou yon peryòd de 5 semèn. Sourit kontwòl yo te resevwa piki saline ak probenecid. Nan gwoup la MPTP plis Ka-trete, sourit te resevwa Ka (50 mg / kg, yon sèl piki / jou pandan eksperyans, Jingzhu Biotechnologie, Nanjing, Lachin) intraperitoneally (ip) chak jou 3 d anvan tretman ak MPTP ak plis pase 5 MPTP la. semèn piki. Yon semèn apre dènye piki MPTP, sourit yo te sibi tès konpòtman avèg pou gwoup yo. Apre, tout sourit yo te anestezi ak 40 mg / kg sodyòm pentobarbital ak sakrifye pou deteksyon pwoteyin nan sèvo ak imuno-istochimi oswa analiz qPCR.

2.4. Operasyon estereyotaksik in vivo ak tretman eksperimantal

Operasyon estereotaksik anba anestezi pentobarbital sodyòm (40 mg/kg, ip) te fèt jan sa dekri [25]. Sourit Atg5 ak kontwòl shRNA te transfekte ak vektè anbalaj (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP) pou jenere AAV. Pou mikro-enjeksyon, sourit anestezi yo mete nan yon aparèy estereyotaksik. Yo te enjekte ak 1μL AAV a pa elektwòd vè ki vize DG(AP:-0.3 mm; ML:±0.13 mm; DV:{-0.45 mm) nan yon to 0.25 μL/min. Lè sa a, zegwi a te kenbe pou yon lòt 2-min 2 semèn apre viris microinjection, sourit yo te sibi MPTP-induit PD modèl kondiksyon ak (oswa)Ka tretman.

Atg5 shRNA te jwenn nan Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Pou silans Atg5 la, yo te montre primè yo nan Tablo Siplemantè 1.

2.5. Analiz konpòtman

Yon semèn apre piki final la nan MPTP oswa saline, tès la rotarod ak tès poto yo te fèt jan sa dekri anvan [27]. Pou tès rotarod la, sourit yo te aklimate ak rotarod la nan de esè (6 min ak yon vitès akselere de 12-20 rpm) pou chak jou pandan 2 jou youn apre lòt anvan yo kòmanse eksperyans la. Lè sa a, sourit yo te teste nan 20 rpm pou 300 s pou lòt 3 jou youn apre lòt. Latansi a tonbe te anrejistre lè l sèvi avèk Rotarod Analiz System (Jiliang, Shanghai, Lachin).Pou tès poto a, sourit yo te mete tèt moute sou tèt yon poto an bwa vètikal (ki graj sifas, wotè 50 cm, dyamèt 1 cm). Tout sourit yo te abitye ak aparèy la 2 jou anvan tès la ak Lè sa a, teste pou twa fwa nan twazyèm jou a. Tan total la (T-total, jiskaske sourit la rive nan etaj la ak kat grif li yo) ak tan an vire (T-vire, pou sourit la vire tèt nèt anba) yo te anrejistre. Eksperyans lan te avèg nan gwoup sourit pou chak tès konpòtman epi yo te fè tès la twa fwa.

2.6. Koleksyon echantiyon nan sèvo

Apre dènye tès konpòtman yo, sourit yo te anestezi pa pentobarbital sodyòm (40 mg / kg, ip). Pou qPCR, Western blotting, ak segondè-pèfòmans likid chromatografi (HPLC) analiz, tout sèvo yo te rapidman ekstrè soti nan bèt yo Lè sa a, midbrain ak tisi striatum yo te byen vit diseke, pre-jele pa nitwojèn likid. Tout echantiyon yo te estoke nan -80 degre jiskaske analiz yo.

Pou analiz imunohistochimik, sourit yo te perfused trans-cardially ak 4 pousan paraformaldehyde (PFA). Sèvo yo te ekstrè, post-fiks, dezidrate, entegre nan OCT (Tissue-Tek), ak seksyon seri nan sèvo yo te kriseksyone （30 μm pou chak tranch） atravè chak strat antye ak mitan sèvo lè l sèvi avèk yon mikrotom konjelasyon (Leica CM1950, Nussloch, Almay). ). Tout seksyon yo te kolekte nan sis seri separe epi yo te estoke tranch nan sèvo nan 50 pousan gliserin epi yo te jele nan -20 degre jiskaske analiz.

Pou TEM, sourit yo te melanje ak 2.5 pousan glutaraldehyde ak 2 pousan paraformaldehyde jan sa dekri 【12】. Yon ti pòsyon （<1 mm²）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Analiz imunohistochimik

Tranch sèvo yo te rense nan PBS ki te swiv pa 3 pousan H2O, pou 10 min Lè sa a, enkubasyon ak 0.3 pousan Triton X{-100 nan PBS konplete 5 pousan BSA pou 1 èdtan. Apre sa, glisad yo te enkube ak antikò prensipal yo nan 4 degre lannwit lan nan PBS ki gen 5 pousan BSA nan 4 degre lannwit lan, Lè sa a, lave ak enkubate nan antikò segondè pou 1 èdtan nan tanperati chanm, ki te swiv pa enkubasyon ak diaminobenzidine (DAB) oswa aliye nan. DAPI (Life Technologies, Cat P36931) kòm tach imunofluoresan pou 5 min.Pou tach Nissl, glisad yo te fizyone nan solisyon kresyl vyolèt (CV) (0.1g kresyl vyolèt, 99 ml H,O, ak 1 pousan asid acetic 1 ml) pou 30 min nan tanperati chanm Lè sa a, dezidrate ak alkòl ak ksilèn. Yo te obsève imaj epi yo te pran foto anba yon mikwoskòp Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Etazini). Kantite total newòn TH-pozitif ak Nissl-pozitif nan SNpc la te jwenn serolojik lè w itilize metòd fraksyonè optik ak lojisyèl MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. High-pèfòmans likid chromatography (HPLC) analiz

Echantiyon striatal sourit yo te omojènize ak {{0}}.1 M asid perchloric (1 mg tisi nan 10{0 μL asid perchloric) ak 0.1 mM EDTA, trete pa ultrasons ak santrifuje. nan 20,000 rpm pou 30 min jan yo rapòte [27]. Lè sa a, likid supernatant yo te kolekte pou mezire. Faz mobil lan se yon solisyon melanje ki fòme ak 90 mM fosfat sodyòm monobazik, 1.7 mM 1-oktan asid sulfonik, 50mM sitrat, 50 μM EDTA, 10 pousan acetonitrile ak pousantaj koule nan 0.2 ml / min. An paralèl, pou kalkil koub estanda quantitative, solisyon estanda stock pou dopamine ak dihydroxy-phenyl asid acetic (DOPAC) (Sigma-Aldrich, USA) yo te prepare nan 0.1 M HClO4. Yo te enjekte yon kantite 10 ul nan sipènatant prepare oswa solisyon estanda. nan faz mobil lan epi teste pa ESA Coulochem ⅢI detektè elektwochimik (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Echantiyon yo te mezire ak pik yo te quantifye. Konsantrasyon monoamin yo te kantite lè yo konpare ak estanda a lè l sèvi avèk lojisyèl ClarityChrom (Knauer, Almay) ak Lè sa a sa ki nan strat yo te konvèti dapre rapò a dilution.Kob estanda DA ak DOPAC yo te montre nan Fig.1a ak b siplemantè.

2.8. Kilti selil ak tretman

Kilti newòn prensipal mesencephalic yo te fèt jan sa dekri deja [12].An brèf, tisi mesencephalic sourit C57BL/6 nan jou anbriyon 14/15(E14/15) yo te retire ak anpil atansyon, mekanikman disyosye yo retire manbràn yo ak gwo veso sangen, epi answit diseke. Apre sa, yo te dijere ak tripsin-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA) epi yo te filtre nan yon filtè 100-μm pou jwenn yon sispansyon yon sèl selil. Apre sa, selil yo te plake sou poly-L-lizin. -plak pre-kouvwi 12-/{24-byen nan 2.5×10 selil degre/ml ki gen mwayen Neurobasal (Cat 21103049, GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) konplete ak B27 (2 pousan v:v, Cat 17504044,GibcoTM) ak penisilin/streptomycin (0.5 pousan v:v). Kilti yo te konsève nan yon chanm imidite (37 degre, 5 pousan CO2 enkibatè). Yo te chanje mwayen kilti a chak 3 jou. epi selil yo ka itilize nan 7-10 jou.

Liy selilè: Liy selil SH-SY5Y yo te kiltive nan 10 pousan FBS ak 1 pousan penisilin/streptomycin nan yon enkibatè imidite a 37 degre ak 5 pousan CO2. Nan eksperyans yo, selil SH-SY5Y yo te trete ak MPP (200 μM) oswa diferan dòz Ka (0,3,30,60,100,300,600 μM) pou 24 èdtan. Ka （3,10,30,60μM,3 h）selil prime-SH-SY5Y yo te ankouraje ak MPp plis (400 μM) pou 24 èdtan. Ka （30 μM,3 h） ak (oswa san) 3-MA （3 mM,1 h）oswa -tocopherol（50 μM,1h, Sigma-Aldrich, 47783）primed-SH-SH5Y selil yo te ankouraje ak MPP plis （200 μM） pou 24 h.

2.9. Vitabilite selil CCK8 tès

Selil Counting Kit-8(CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA) te detekte vibilite selil ki chanje nan tretman Ka. An brèf, selil SHSY5Y yo te simen nan yon 96- byen plak ak Lè sa a, trete ak konsantrasyon diferan nan Ka (3,30,60,100,300,600 μM) pou 24 h. Apre sa, yo te ajoute 10ulof CCK-8 reyaktif nan chak pi pou 4 èdtan. Finalman, yo te detekte absorbans pa Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) nan 450 nm.

2.10.ATP tès

Nivo ATP selilè yo te detekte pa yon ATP Bioluminescence Assay Twous (Beyotime Biotechnology Co, Lachin〕dapre enstriksyon manifakti a. Apre tretman an, selil yo te lysed ak santrifuje nan 12,000 rpm pou 5 min nan 4 degre ak yo te kolekte supernatant yo.Solisyon travay （100μL）te ajoute nan 20μL echantiyon nan plak la 96-byen, epi yo te mezire luminesans la imedyatman sou yon lektè microplate oto-mated.Mezi ki soti nan tout echantiyon yo te nòmalize nan konsantrasyon pwoteyin.

2.11. Na plis -K -ATPase tès

Pou mezi Na plis -K plis -ATPase (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Lachin), selil yo te sonike ak santrifuje nan 6000 rpm pou 10 minit pou jwenn supernatant. Solisyon reyaksyon Na plis -K plis -ATPase deteksyon yo te ajoute ak enkubasyon dapre enstriksyon manifakti a. Lè sa a, absòbe a nan 660 nm te detekte. Mezi tout echantiyon yo te nòmalize nan konsantrasyon pwoteyin.

2.12. Western blotting analiz

Selil oswa tisi nan sèvo yo te lysed nan tanpon RIPA (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 pousan NP-40 (FNNO021, Thermo), 0.5 pousan sodyòm. deoxycholate (D6750, Sigma), 0.1 pousan SDS (74255, Sigma) complétée ak inibitè pwoteyaz ak fosfataz (Roche, Shanghai, Lachin). Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine ak Micro BCA Kit la (Beyotime, Shanghai, Lachin) A {{13 }} ug pwoteyin chak echantiyon yo te separe pa SDS-PAGE lè l sèvi avèk jèl poliakrilamid TGX (Bio-Rad, Hercules, Kalifòni, USA) ak Lè sa a, transfere nan manbràn polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Apre bloke, PVDF manbràn yo te enkube ak divès kalite antikò prensipal espesifik nan TBST nan 4 degre lannwit lan Lè sa a, lave ak enkubasyon nan korespondan peroksidaz refor (HRP) konjige antikò segondè pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Gwoup imunoreactive yo te vizyalize ak detekte pa chemiluminescence améliorée (ECL) plis reyaktif deteksyon. (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) epi analize lè l sèvi avèk sistèm imaj ImageQuantM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

2.13. An tan reyèl quantitative(Q)-ak ranvèse transcription (RT)-PCR

RNA total te extrait nan tisi sèvo ak selil kiltive lè l sèvi avèk Trizol reyaktif (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transkripsyon ranvèse te fèt lè l sèvi avèk twous reyaktif TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Japon). Realtime qPCR te pote soti lè l sèvi avèk SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) nan yon enstriman StepOnePlus (Applied Bio-systems). Jadendanfan yo te achte ak valide pa Jeneral la (Shanghai, Lachin). Jadendanfan yo itilize pou qPCR yo te montre nan Tablo Siplemantè 2.

2.14. Laktat dehydrogenase (LDH) tès

Dapre enstriksyon manifakti a, selil yo te plake nan yon plak 96-byen nan 5000 selil/pi, epi yo te kolekte yon mwayen kilti pou mezire nivo LDH ak yon twous tès (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Lè sa a, absorpsyon echantiyon yo te detekte pa Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) nan 450 nm.

2.15.BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11, ak MitoTracker gwo twou san fon tach wouj

Selil vivan yo te lave ak PBS epi yo te enkube ak 2ug/ml BOD-IPY 493/503(InvitrogenTM, Cat D3922) oswa BODIPY 581/591 C11 (BD-Cl1）（2.0 μM). , InvitrogenTM, Cat D3861）nan PBS pou 15 min nan 37 degre. Pou MitoTracker Deep Red tach, selil vivan yo te enkube ak 0.5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) nan PBS pou 30 min nan 37 degre selil yo. yo te lave de fwa nan PBS epi yo te fikse nan 3.5 pousan PFA pou 10 minit ki te swiv pa lave ak counterstaining ak Hoechst 33342 (Sigma, Cat B2261) pou 10 minit anvan yo te kouvri sou glisad an vè pou D. Imaj yo te obsève ak foto yo te kaptire pa mikwoskòp fluoresans. (Olympus, Tokyo, Japon).

2.16. Hoechst ak PI tach

Selil yo te tache ak Hoechst 33,342（1 ul dilye nan 500 ul PBS, Sigma, Cat B2261） ak （oswa）PI （0.1 ul dilye nan 500 ul PBS, Solarbio, CA1020) ak Lè sa a, fikse 10 ul. ak obsève pa mikwoskospi fluoresans (Olympus, Tokyo, Japon).

2.17. Sitometri koule

Selil yo te dijere epi rense ak D-hank a Lè sa a, tache ak Annexin V-FITC（5 ul dilye nan 500ul PBS）/PI（0.1 ul dilye nan 500 ul PBS) twous apoptoz (CA1020, Solarbio, Beijing, Chian) selon pwotokòl manifakti a. Apre, selil apoptotik yo te analize lè l sèvi avèk sitometri koule (guava easyCyteTM 8, Millipore, USA). Mitokondriyo ROS ak mezi potansyèl manbràn mitokondriyo yo te fèt jan yo te pibliye 【12】. Selil SH-SY5Y yo te tache ak MitoSOX （2.5 μM, Invitrogen, USA） oswa ak Jul（10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA） nan 37 degre pou 30 min. Apre yo fin lave ak PBS de fwa, selil yo te resuspend nan PBS frèt ki gen 1 pousan FBS pou analiz sikometrik koule. Done yo te analize ak lojisyèl FCS Express (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Esay respirasyon Seahorse

Fonksyon respiratwa mitokondriyo nan selil SH-SY5Y vivan yo te mezire lè l sèvi avèk analizeur Seahorse ekstraselilè (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, USA) atravè chanjman nan pousantaj konsomasyon oksijèn (OCR). Selil SH-SY5Y simen nan 3 × 103. selil/byen yo te pèmèt yo konfòme yo ak plak kilti selil Seahorse yo epi yo rive nan apeprè 80 pousan konfluyans nan moman eksperyans la. Nan jou ki vin apre a, selil yo te pretrete ak Ka epi yo te ekspoze a MPp plus pou yon lòt 24 èdtan. OCR te detekte nan kondisyon fondamantal ki te swiv pa adisyon sekans nan 1 μM oligomycin, 1 μM FCCP, osi byen ke 1 μM rotenone ak antimycin A.

2.19. Analiz estatistik

Done yo te prezante kòm mwayen ± SEM. Siyifikasyon diferans lan te detèmine pa tès t Elèv la, analiz De-fason nan divèjans, oswa analiz yon sèl-fason nan divèjans (ANOVA) ki te swiv pa tès post hoc Tukey la. Diferans lan te konsidere kòm enpòtan nan P<>

3. Rezilta yo

Rezilta 1. Ka retabli malfonksyònman motè ak ogmante nivo dopamine nan striatum sourit modèl MPTP/p PD.

Pou envestige efè neuroprotective patojèn Kaon PD, 4-mwa sourit gason C57BL/6 yo te sou fòm piki ak neurotoxin MPTP pou etabli modèl MPTP/p PD epi yo te trete ak Ka (Fig. la). Apre endiksyon modèl, tès rotarod ak tès poto yo te itilize pou evalye pèfòmans motè ak konpòtman sourit nan diferan gwoup yo. Jan yo montre, tan an pèfòmans rotarod te siyifikativman redwi nan sourit MPTP-trete, ak efè sa a te anpeche pa Ka (Fig. 1b). Ka tou retabli defisi konpòtman ki pwovoke pa MPTP, jan sa endike nan rediksyon yo nan tan an vire ak tan total nan tès la poto (figi lc ak d), san yo pa afekte pwa kò yo nan sourit yo (figi le). Anplis de sa, analiz HPLC te montre ke nivo dopamine nan striatum a te siyifikativman diminye nan MPTP/p-challenged sourit, e nivo sa a te retabli pa tretman Ka (Fig. 1f. Ka tretman tou soulaje MPTP/p-induit rediksyon nan dihydroxy). -phenyl asid acetic (DOPAC, yon metabolit nan dopamine) nivo nan striatum a (Fig.1g).Rezilta sa yo sijere ke Ka retabli malfonksyònman motè ak ogmante nivo dopamine nan striatum a nan sourit PD MPTP-induit.

Rezilta 2. Ka soulaje pèt newòn DA nan SNpc sourit modèl MPTP/p PD.

Apre sa, pou evalye plis efè neuroprotective Kaon MPTP/p-induced DA newòn andikap, nou te egzamine tyrosine hydroxylase (THD plis newòn nan murin SNpc la pa imunostaining. Jan yo montre nan Fig.2a ak b, MPTP/p pwovoke yon rediksyon enpòtan. nan kantite TH plis newòn, ki te soulaje pa tretman an Ka. Anplis de sa, konte estereolojik nan total newòn nan SNpc a, jan sa defini nan Nissl

Fig.1. Ka tretman soulaje malfonksyònman motè ak ogmante nivo dopamine nan striatum nan sourit modèl MPTP / p PD.

(a) Dyagram chema konsepsyon eksperimantal la. (b) Tan sou baton an te mezire pou tès la rotarod sou twa jou youn apre lòt. (cd) Tan an pran yo vire alantou (tan nan vire) ak desann yon poto (tan nan k ap grenpe) yo te anrejistre pou tès la poto. (e)Pwa kò sourit yo te mezire nan fen etid la. (fg) Dopamine (DA) ak asid dihydroxy-phenyl acetic (DOPAC) nan striatum la te analize pa segondè-pèfòmans likid chromatografi. Done yo eksprime kòm mwayen ± SEM.n =9-10 pou chak gwoup nan (b,c,d); n =6-8 pou chak gwoup nan (f, g).ns, pa enpòtan, *P<><><0.001,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

tach, verifye ke pèt la nan selil TH te reflete lanmò selilè men se pa downregulation nan ekspresyon TH epi li te montre ke tretman Ka retabli diminisyon nan kantite newòn Nissl-pozitif nan SNpc nan sourit MPTP-trete soti nan 43.3 pousan a 25.4 pousan ( Fig.2c ak d) .Anplis de sa, Ka siyifikativman amelyore rediksyon an MPTP-induit nan ekspresyon pwoteyin TH ak DAT, jan yo mezire pa Western blotting (Fig. 2e-g). Prèv sa a konfime efè neuroprotective Ka sou modèl sourit PD la.

Rezilta 3. Ka diminye akimilasyon vakuol LD ak estrès oksidatif nan SNpc sourit MPTP/p-trete.

Ogmante prèv te montre patisipasyon LD yo nan NDDs[10], toujou, travay anvan nou an te idantifye ogmante LD nan SNpc sourit PD MPTP-induit [12]. LD yo ka fasilman idantifye epi montre estrikti wonn ki ba-dansite ak kontni omojèn amòf [28]. Nòmalman, LD yo ka degrade atravè otofaji pou evite akimilasyon [29]. Pou mennen ankèt sou si wi ou non Ka ka kontwole LD nan PD, akimilasyon LD yo te analize pa mikwoskopi elektwonik transmisyon (TEM) nan SNpc nan kontwòl, MPTP/p, ak MPTP/p plis Ka sourit. Jan yo montre nan travay anvan nou an [12], kantite ak gwosè LD yo te ogmante nan sourit MPTP / p konpare ak kontwòl saline trete (Fig. 3a ak b) epi yo te siyifikativman redwi nan sourit Ka-trete (Fig.3c-). e). Anplis, nan sourit Ka-trete yo, LD yo te obsève pi souvan tou pre, fèmen nan, oswa degrade pa otolysosomes, ki te defini kòm granules lipofuscin elèktron-dans. Pli lwen tach istolojik nan newòn TH * ak BODIPY, yon lank ki espesyalman mete etikèt sou lipid net epi ki souvan itilize pou detekte LDs [30], te montre ke tou de kantite ak gwosè BODIPY LDs nan SNpc a te pi wo nan sourit PD pase nan kontwòl. epi yo te siyifikativman diminye pa tretman Ka (Fig.3f-h).

Si LD yo pa ka degrade nan yon fason apwopriye, LD yo akimile ka sibi peroksidasyon epi kontribye nan estrès mitokondriyo ROS-medyatè [4], ki anplifye nerotoksisite ak pwogresyon maladi. Pakonsekan, nou plis egzamine pwofil ekspresyon jèn ki asosye ak pwoteksyon kont toksisite gratis FA (Gpx8), netralize espès oksidatif, radikal superoksid (Sod3) ak oksijene idwojèn (Cat), ak metabolis FA (Acsbg1 ak Dbi) jan yo rapòte [31] , tout nan yo ki te frapan diminye nan SNpc nan sourit MPTP-trete konpare ak kontwòl, ak efè sa yo te amelyore nan Ka-trete sourit PD (Fig.3i). Menm jan an tou, MPTP/p ogmante nivo ekspresyon mRNA yo

Fig.2. Ka amelyore pèt newòn DA nan SNpc sourit modèl MPTP/p PD.

(ab) Mikwofoto newòn tyrosine hydroxylase(TH)-pozitif (a) ak konte estereolojik newòn TH-pozitif nan substantia nigra pars compacta (SNpc)(b).Ba echèl yo jan sa endike.(cd) Mikwofoto kresyl vyolèt. -pozitif selil(c) ak stéréologiques de cresyl vyolèt-pozitif cellules nan SNpc(d). Echèl ba, 120μm. (eg) analiz Western blot nan ekspresyon pwoteyin TH ak DAT nan SNpc a (e) ak analiz quantitative (f, g). Done yo kantite yo nòmalize nan gwoup la kontwòl saline. Done yo eksprime kòm mwayen ± SEM.*P<0.05,><0.01,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.)="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" noxl,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Rezilta 4. Ka pwoteje selil SH-SY5Y kont apoptoz MPP plis pwovoke

MPP plis, metabolit aktif MPTP, inibit anzim mitokondriyo konpleks epi lakòz lanmò selil ki asosye dirèkteman ak PD[32]. Apre sa, nou te envestige si Ka ka anpeche apoptoz newòn MPP plis pwovoke nan vitro. Jan yo montre nan Fig. 4a ak b, MPPt（400 μM, 24 h) pwovoke liberasyon LDH nan selil SH-SY5Y, ak Ka (30 ak 60 μM) siyifikativman atenue lage LDH san yo pa afekte siviv selil (Fig.4a). Depi Ka pwovoke yon efè pwoteksyon sibstansyèl nan yon konsantrasyon nan 30 μM（Fig.4b）, nou te itilize konsantrasyon sa a nan eksperyans ki vin apre yo.Rezilta yo tach Hoechst / PI te montre tou ke Ka siyifikativman redwi pousantaj la nan selil ki gen MPP plis -pwovoke kondansasyon chromatin. (Fig.4c ak d) ak apoptoz selilè, jan sa evidans pa ogmante entansite fliyoresan Hoechst (Fig. 4c) ak pousantaj selil Hoechst/PI-tache (Hoechst plis /PI plis) (Fig.4e). detekte pa sikometri koule, MPPt pwovoke apoptoz selil, evidans pousantaj la ogmante nan selil Annexin V-tache (AV plis / PI- ak AV plis / Prt) te pwoteje pa Ka (Fig. 4f ak g). Anplis de sa, Ka miyò ranvèse Chanjman MPP plis pwovoke nan ekspresyon pwoteyin ki gen rapò ak apoptoz, jan sa evidans regilasyon B a. cl -2, downregulation nan Bax (Fig.4hi-j), ak redwi klivaj kaspase -3 (Fig.4h, k). Done sa yo sijere ke Ka ka aboli efè prejidis nan MPp plis sou siviv selil.

Rezilta 5. Ka siprime akimilasyon MPp plis LD ak peroksidasyon lipid, ki medyatè domaj mitokondriyo nan selil SH-SY5Y.

Dènye etid yo te montre ke akimilasyon LD inatandi ka lakòz ogmante estrès peroksidasyon lipid-medyatè ak akselere malfonksyònman mitokondriyo, ki ankouraje neurodegeneration [10]. Travay anvan nou an te montre tou ke ogmante LD yo nan SNpc la te asosye ak patoloji PD nan sourit [12]. Pou mennen ankèt sou si efè pwoteksyon Ka a te gen rapò ak akimilasyon LD nan vitro, nou te premye fè tach LD-espesifik nan selil SH-SY5Y lè l sèvi avèk BODIPY 493/503 epi obsève ogmante depo LD (nivo amelyore nan lipid net)

Fig. 3. Ka redwi akimilasyon nan vakuol LD elèktron-dans ak oksidasyon lipid nan SNpc nan sourit MPTP/p-trete.

(ac) Imaj reprezantatif EM ki montre vacuoles elèktron ki klere (ti gout lipid), vakuol otofajik ki gen otofaj ki gen otolysosomes (ALS), oswa lipofuscin ki gen lizozom (Lys) nan SNpc sourit ki trete ak saline (a), MPTP/p (b), ak MPTP/p plis Ka (c).Ba echèl, 500 nm. Avèk (a, b) jan sa endike nan travay anvan nou an (PMID:29967574). (de)Kantifikasyon elèktron-klere vakuol LD pou chak newòn nan SNpc nan sourit ki endike yo. n =3 sourit,10-12 newòn pou chak gwoup. (fh) Seksyon midbrain ki soti nan saline-, MPTP/p-, ak MPTP/p plis Ka-trete sourit yo te tache pou BODIPY (LDs) ak TH (DA newòn). Panno ki pi dwat yo montre agrandisman BODIPY plis TH plis newòn yo. Flèch yo endike LDs.(gh), Quantification de BODIPY plis LD nimewo ak gwosè. (ii) ekspresyon mRNA nan jèn ki gen rapò ak toksisite FFA (Gpx8, Sod3, Gat, Acsbg1, ak Dbi) (i) ak jèn estrès oksidatif (Nox1, Nox2, ak Nox4) (j) nan SNpc sourit ki endike yo te analize. pa an tan reyèl qPCR.n=4-5 pou chak gwoup, twa eksperyans endepandan. Done yo eksprime kòm mwayen an ± SEM; ns, pa enpòtan, *P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mptp,="">

Atik sa a extrait dehttps://doi.org/10.1016/j.redox.2021.101911Resevwa 23 Novanm 2020