Variants ki asosye ak maladi ren nan Apolipoprotein L1 montre pwogrè nan fonksyon nan aktivite chanèl kation.

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno ak John C. Edwards

Variants nan Apolipoprotein L1 (ApoL1) yo konnen yo responsab pou ogmante risk pou kèk pwogresis.renmaladipami moun ki gen zansèt Afriken yo. ApoL1 se yon pwoteyin anfitropik ki ka mete nan manbràn fosfolipid epi bay pèmeyabilite anyon oswa kasyon selektif nan manbràn fosfolipid depann sou pH. Si aktivite sa yo diferan pami variants yo oswa si yo kontribye nan patojèn maladi a pa konnen. Nou te itilize analiz de flux iyon vòltaj-kondwi soti nan vesik fosfolipid ak nan asosyasyon stablemembrane evalye diferans ki genyen ant ApoL1isoforms. Gen yon ogmantasyon siyifikatif (apeprè de fwa) nan aktivite permease iyon kasyon selektif de variants ki asosye ak maladi ren yo konpare ak pwoteyin referans la. Kontrèman, nou pa jwenn okenn diferans nan aktivite anyon-selektif pèmez la nan pH ki ba nan mitan izoform yo. Konpare ak sekans referans la, de variants ki asosye ak maladi yo montre ogmante asosyasyon ki estab ak vesik fosfolipid nan kondisyon ki sipòte aktivite cationpermeaz la, ki sijere ke a. ogmante aktivite ka akòz asosyasyon manbràn pi efikas ak ensèsyon.Pa gen okenn diferans nan asosyasyon manbràn nan mitan izoform nan kondisyon pi bon pou aktivite anion permease. Done sa yo sipòte yon modèl ki amelyore pèmeyabilite cation ka kontribye nan maladi ren pwogresif ki asosye ak alèl ApoL1 ki gen gwo risk.

Yo konnen de (2) varyant diferan nan pwoteyin ApoL1 yo responsab pou ogmante risk pou pwogresif pwoteyin.renmaladinan moun ki gen zansèt Afriken, sitou akòz glomerulosclerosis segmantal fokal, nefroskleroz ipèrtansif, ak nefropati ki asosye ak VIH (1-3). Wòl fonksyonèl ApoL1 nan selil imen yo, enpak varyasyon ki asosye ak maladi yo sou fonksyon sa yo, ak fason nenpòt chanjman sa yo inaktivite ka akselere.maladi renyo pa klè (4, 5).

Sèl aktivite byochimik ke pwoteyin ApoL1 genyen an se pou fonksyone kòm yon chanèl ion. Yo te note ke domèn tèminal N nan ApoL1 gen estriktirèl sanble ak bakteri colicin A1 (6). Tankou colicin A1, ApoL1 se yon pwoteyin anfitwopik ki nan sèten sikonstans ka antre nan yon manbràn lipid ki soti nan yon solisyon akeuz epi li fonksyone kòm yon pèmez iyon (6-9). Pirifye recombinant sovaj-kalite ApoL1 ki estab nan solisyon detèjan nan pH net (8, 9). Nan pH ba, ApoL1 ka antre nan manbràn fosfolipid ak ogmante pèmeyabilite anyon-selektif nan manbràn yo (6, 7, 9). Lè pH cis leve tounen nan net, pèmeyabilite anyon-selektif siprime epi yo aktive yon kanal selektif kasyon (8, 9). Done sa yo sipòte yon modèl nan ki ApoL1, prezante nan yon lòj asid ansanm swa wout yo ekzozitik oswa andozitik, ta ka mete nan manbràn limite theorganelle a ki mennen nan ogmante pèmeyabilite anyon. Trafik ki vin apre nan pwoteyin nan nan lòt konpatiman manbràn kote pH cis la ta net (tankou manbràn plasma oswa manbràn mitokondriyo) ta siprime pèmeyabilite anion ak aktive cationpermease la. Kit aktivite pèmez ion sa yo jwe yon wòl nan patojèn nan ApoL1-asosyerenmaladipa klè.

Nou te itilize metòd ki baze sou vesik pou analize diferans aktivite pèmez inyon ak manbràn obligatwa ant sekans referans (tip sovaj), ki deziyen G0, ak de varyant ki asosye ak maladi, ki deziyen G1 ak G2. Nou jwenn ke konpare ak G0, tou de G1 ak G2 izoform yo montre aktivite espesifik pèmez kasyon an nan pH net san yo pa chanje aktivite anyon-selektif pèmez la nan pH ba. Anplis de sa, izofòm G1 ak G2 ki asosye ak maladi yo montre ogmante asosyasyon manbràn ki estab konpare ak G0 nan kondisyon ki sipòte aktivite cationpermeaz la, men pa nan kondisyon ki sipòte aktivite permease theanion. Nou pa jwenn okenn efè sou modèl sansiblite pH swa etap obligatwa a oswa etap efflux nan aktivite chanèl kasyon an, epi nou pa jwenn okenn efè sou sansiblite pH nan aktivite anyon-selektif permease. Nou konkli ke varyant ki asosye ak maladi nan ApoL1 oaza amelyore aktivite chanèl kasyon pwoteyin nan, omwen pasyèlman pa amelyore ensèsyon manbràn. Nou pwopoze ke aktivite chanèl amelyore sa a kontribye nan pwogresisrenmaladinan moun ki pote jenotip ki gen gwo risk.

Cistanche ka tretemaladi ren

Rezilta yo

Yo te eksprime ak pirifye izoform recombinant nan ApoL1 ak sekans siyal N-terminal retire epi ranplase ak yon tag 6His/T7epitope. Tout twa te montre pwopriyete kwomatografik idantik atravè pirifikasyon an epi yo pa distenge pa jèl elektwoforèz Figi 1.

Fraksyon pik yo te dilye a 100 ug / ml epi yo te sibi tès efflu tovesicle pou kapasite nan konfere klori ak pèmeyabilite potasyòm. Esè a konsiste de de etap separe. Nan etap asosyasyon an, ApoL1 melanje ak vesik fosfolipid ki chaje ak KCl epi yo pèmèt yo mete l nan manbràn yo. Lè sa a, yo retire KCl ekstra veyikil ak tanpon pa pasaj nan yon kolòn vire desaling ekilibre nan sikwoz izotonik, jenere gwo gradyan andedan-a-deyò nan tou de Kand. Cl iyon. Nan etap ekoulman an, eluate kolòn vire a dilue nan yon solisyon sikwoz tampon izotonik ki kenbe gradyan KCl nan pH vle a. Ekstravehicular Clkonsantrasyon kontwole ak yon elektwòd klori-selektif. Menm si swa K oswa Cl-selektif pèmeyabilite prezan, nitherion yo pral kapab sòti vesik yo paske nan mank de mouvman counterion. Voltage-kondwi iyon ekoulman inisye pa adisyon a nan yon konsantrasyon satire nan yon ionofòr counterion. Anplis de sa nan ionofò K-selektif, valinomycin (Val), pral pwovoke yon gwo potansyèl manbràn andedan-negatif ki, si pèmeyabilite Cl prezan, pral kondwi KCl efluks ki pral detekte pa elektwòd la klori-selektif; konsa apre Val, pousantaj Cl eflu reflete pèmeyabilite Cl. Kontrèman, adisyon a nan ionofò Cl-selektif, Ionofò klori 1 (CI1), pral pwovoke yon potansyèl manbràn andedan-pozitif ki pral kondwi KCl eflux si yon pèmeyabilite K prezan. Pakonsekan, apre adisyon a nan CI1, pousantaj Cl eflux reflete K pèmeyabilite. Egzamen sa a ka sèvi swa kòm yon tès pèmeyabilite Cl oswa K, tou depann de ki ionofò yo itilize. Pousantaj inisyal ionefflux apre adisyon ionofò yo pran kòm pèmeyabilite spesifik nan vesik yo. Remake byen, Cl eflu anvan adisyon a nan ionofò endike kèk pèmeyabilite nan tou de Kand Cl. Menm nan sikonstans sa a, pousantaj Cl ekoulman apre adisyon nan yon eksè nan ionofòr counterion reprezante pèmeyabilite nan ion nan enterè-Cl apre adisyon nan Val, ak K apre adisyon nan CI1.

Cistanche ka tretemaladi ren

Aktivite permease klori

Etid anvan nou yo te montre ke pèmeyabilite aniyon an se pi gwo lè tou de etap asosyasyon manbràn ak etap eflux yo te fèt nan pH 5.0, ak kondisyon sa yo te itilize pou konpare aktivite pèmeyabilite Cl nan twa izoform yo, lè l sèvi avèk Val pou kòmanse. Cl pèmeyabilite-depandan eflu. Egzanp done anvan tout koreksyon yo montre nan Figi 2A, ki montre pwodiksyon an soti nan elektwòd Cl-selektif nan milivolts trase kont tan. Anrejistreman an kòmanse anvan adisyon spincolumn eluate ki gen vesik ak pwoteyin, valè mV reflete konsantrasyon 10 μM Cl la. Kl-gratis vire kolòn eluate a ajoute nan premye flèch la, dilye Cl la, ki se reflete nan defleksyon an anwo nan trase mV la. Val ajoute nan dezyèm flèch la, deklanche Cl eflux si pèmeyabilite Cl prezan, ki reflete pa gout nan pwogresif inmV. Yo ajoute Triton X-100 nan twazyèm flèch la, lage tout klori intravesicular ki rete yo. Apre konvèsyon soti nan mV nan konsantrasyon klori lè l sèvi avèk yon koub estanda ki te pwodwi pou elektwòd la nan kondisyon tès la, yo detèmine pousantaj fraksyon nan lage Cl apre adisyon Val epi pran kòm pèmeyabilite klori a. Konpare ak pa gen okenn kontwòl pwoteyin (trase ble), pousantaj segondè nan lage Cl apre adisyon a nan Val endike ke ApoL1 konfere sibstansyèl Clpermeability ki parèt konparab nan mitan twa izoform yo (wouj, vèt, ak tras jòn). Pousantaj nan ekoulman ki ba anpil anvan Val endike ke pèmeyabilite potasyòm nan pi ba anpil pase pèmeyabilite Cl la. Yon seri de konsantrasyon nan izoform ApoL1 yo te teste pou Cl permeaseactivity (figi 2B). Jan nou te rapòte deja pou G0, nou jwenn aktivite Clpermease ki gen rapò ak mas pwoteyin nan tès pou tout twa izofòm yo. Aktivite pèmez la nan chak konsantrasyon pa diferan nan mitan twa izofòm yo. Yo te fè koub konsantrasyon an de fwa lè l sèvi avèk de seri diferan nan preparasyon pwoteyin, ki bay menm rezilta a.

Yo te teste sis preparasyon endepandan twa pwoteyin yo pou aktivite permeaz Cl nan pH 5.0 jan yo rezime nan Figi 2C. Nan youn nan seri preparasyon nou pa t jwenn diferans enpòtan nan aktivite permeaz Cl nan mitan izofòm yo (p > 0.05 pou konparezon G0 ak G1 oswa G2 nan chak seri) . Pousantaj mwayèn ekoulman tout sis preparasyon yo (ki make ALL nan Fig. 2C) yo te 1.21 ± 0.32 pousan / s pou referans sekans G0, 1.36 ± 0.41 pousan /s. pou G1, ak 1.18 ± 0.34 pou G2 (mwayèn ± SD, n=6 pou chak; p=0.47 ak 0.94 pou konparezon G0 ak G1 ak G2, respektivman). Pou detèmine si mitasyon ki asosye ak maladi a chanje sansiblite pH nan pèmeyaz teanyon, pèmeyabilite Cl konfere pa chak izoform te teste atravè yon seri valè pH, lè l sèvi avèk pH ki endike pou tou de etap asosyasyon ak eflu nan tès la (figi 2D). diferans enpòtan nan mitan izofòm yo. Eksperyans sa a te fèt de fwa lè l sèvi avèk de seri diferan nan preparasyon pwoteyin, ki bay menm rezilta a. Kidonk, aktivite Clpermease a pa siyifikativman diferan ant de variants ki asosye ak maladi a ak sekans referans lan.

Aktivite pèmez potasyòm

Etid anvan nou yo te endike ke pèmeyabilite kasyon se pi gwo lè etap asosyasyon manbràn lan te fèt nan pH 6. 0 epi etap eflux la te fèt nan pH 7.5, epi nou te itilize kondisyon sa yo sof si yo espesifye otreman. Egzanp done anvan tout koreksyon ki soti nan yon tès pèmeyaz K yo montre nan Figi 3. Menm jan ak tès pèmeyabilite Cl yo, yo ajoute eluate kolòn vire a nan premye flèch la, yo ajoute ionofò a (nan ka sa a, Chloride Ionophore1, CI1) nan dezyèm flèch la, epi detèjan ajoute nan twazyèm flèch la. Pousantaj inisyal ekoulman yo apre adisyon a nan ionofò, ki reprezante pèmeyabilite K a, yo montre pa liy tirè gri yo. Trase ble a soti nan pa gen okenn pwoteyin kontwòl, ki montre perméabilité background andojèn nan vesik yo pou kont li. Trase wouj la montre aktivite variant G0(tip sovaj) la, ki montre klèman prezans Kpermeability ki pi gran pase vesik kontwòl pwoteyin yo te bay la jan yo te deja rapòte (9). Tras jòn ak vèt yo montre aktivite variantes G1 ak G2, respektivman. Premye pant yo apre adisyon ionofò yo klèman pi gwo pou G1 ak G2 pase pou G0, sa ki endike ke variants ki asosye ak maladi yo sipòte pi gwo aktivite K permease pase G0.

Kontrèman ak tès pèmeyabilite Cl la, e jan yo te rapòte anvan pou izofòm G0 (9), nan kondisyon tès K permeaz la, gen kèk eflu anvan ionofò nan vesik ki gen nenpòt nan twa izofòm yo, ki reprezante pa pant anba a. nan anrejistreman yo apre adisyon nan echantiyon ak anvan adisyon a nan ionofò. Pandan ke gwo pousantaj ekoulman apre adisyon ionofò a endike prezans yon pèmeyabilite K sibstansyèl, ekoulman anvan ionofò a endike prezans kèk pèmeyabilite Cl tou, sa ki pèmèt tou de iyon yo koule soti nan vesik yo nan absans ionofò. Sa a leakprobable kont pou tou de monte nan bouche nan pwodiksyon elektwòd imedyatman apre adisyon a nan kolòn nan vire eluate ak pant anba a ki vin apre yo anvan CI1 ki wè ak tout anrejistreman ki gen ApoL1. Sipoze koule sa a kòmanse kòm echantiyon an ap pase nan kolòn nan vire, li tou ta kont pou diferans ki genyen nan konsantrasyon final la Cl apre adisyon a nan detèjan, paske nenpòt pèt nan KCl sou kolòn nan vire vle di mwens total KCl ajoute nan tès la. Entèpretasyon quantitative to ionofòr la pa senp yon lòt bagay ke li dwe yon fonksyon pèmeyabilite tou de Kand Cl. Menm jan anvan (9), nou atribiye aktivite sa a nan aktivite rezidualCl permease ke nou wè nan pH 7.5 tankou nan Figi 2D (gade tou Bruno et al. (9), Fig. 4D).

Yo te pote tès potasyòm pèmeaz sou yon seri konsantrasyon pwoteyin (figi 4A). Aktivite a te lineyèman ki gen rapò ak mas pwoteyin nan tès la pou chak izofòm, men de izofòm maladi ki asosye yo te montre yon gwo ogmantasyon nan aktivite ekoulman konpare ak G0. Koub konsantrasyon sa a te repwodui ak twa seri separe nan preparasyon pwoteyin ki bay rezilta ki sanble anpil.

Sis preparasyon endepandan nan twa izoform yo te teste pou aktivite K eflux lè l sèvi avèk 2 ug nan pwoteyin nan chak tès. Nan chak nan sis seri yo, aktivite pou G1 ak G2 izofòm yo te siyifikativman pi gran pase sa yo ki nan G0 (Fig. 4B). Mwayèn nan tout sis done yo bay pousantaj eflu nan 0.349 ± 0.063 pousan /s pou G{{10}}, {{15} }.709 ± 0.176 pousan /s pou G1, ak 0.673 ± 0.142 pousan /s pou G2 (vle di ± SD, n=6 pou chak; p <0.00001 pou="" konparezon="" g0="" ak="" swa="" g1="" oswa="" g2).="" aktivite="" espesifik="" k="" permeaz="" g1="" ak="" g2="" yo="" se="" 2.03-="" ak="" 1.93-pliye,="" respektivman,="" pi="" gwo="" pase="" g0="" pa="" tès="" sa="">

Depandans aktivite K permease sou pH etap asosyasyon manbràn ak etap eflux ion yo te analize separeman. Malgre ke nou konfime ke aktivite total eflux G1 ak G2 pi gran pase G0 nan kondisyon "estanda" (obligatwa nan pH 6, eflux nan pH 7.5), nou pa jwenn okenn diferans enpòtan nan fòm koub la. ofactivity kont ekstèn (cis) pH swa etap asosyasyon manbràn (Fig. 4C) oswa etap nan eflux ion (Fig. 4D). Nou pa jwenn okenn diferans tou pami izofòm yo nan depandans aktivite a sou pH segondè intravesicular (trans) oswa nesesite pou prezans kasyon divalan (figi 4E), epi sonje ke swa kalsyòm oswa mayezyòm se egalman efikas nan bay kasyon divalan ki nesesè pou plen. aktivite. Chak nan eksperyans sa yo te fèt de fwa lè l sèvi avèk diferan seri pwoteyin pirifye, bay rezilta ki idantik.

Asosyasyon manbràn ki estab

Nou te deja demontre ke pirifye recombinantApoL1 espontaneman mare nan manbràn fosfolipid ki montre depandans menm jan an sou pH ak konpozisyon fosfolipid kòm sa yo ki nan aktivite yo pèmez ion (9). Sèvi ak metòd menm jan an, nou konpare pwopriyete yo obligatwa vesik lipid nan vèsyon referans ApoL1 ak varyant ki asosye ak maladi ren yo nan kondisyon ki sipòte aktivite optimal Cl oswa K pèmez (figi 5). Pou kondisyon Clpermease yo, yo te enkube pwoteyin nan ak vesik lipid nan pH 5.0 anvan ekstraksyon chaotropic pou retire pwoteyin ki pa te asosye estab ak vesik yo. Pwoteyin nan manbràn yo te izole pa flotasyon atravè yon sucrosecushion ak evalye pa quantitative Western blotting. Rezilta yo montre nan Figi 5A. Pa te gen okenn diferans enpòtan nan kantite pwoteyin ki asosye ak vesik ant G{{10}} ak swa G1 oswa G2 izofòm. Nan 5 00 ng pwoteyin nan chak reyaksyon, kantite ki te mare nan vesik yo te 223 ± 33 ng pou G0,239 ± 38 ng pou G1, ak 191 ± 28 ng pou G2 (mwayèn ± SD). ; n=8 pou chak gwoup, p=0.35 ak 0.076 pou konparezon G0 ak G1 ak G2, respektivman). Apeprè 40-50 pousan nan pwoteyin nan tès la mare nan manbràn nan kondisyon sa yo. Yo te fè eksperyans sa a de fwa bay rezilta ki sanble anpil.

Pou evalye obligatwa nan kondisyon ki pi bon pou aktivite Kpermeaz la, yo te enkube pwoteyin nan ak vesik nan pH6.0, Lè sa a, deplase nan pH 7.5 anvan ekstraksyon chaotropic pou retire pwoteyin ki pa estab. Manbràn-bound proteinwas izole pa flotasyon nan vesik yo manbràn nan kousen asukroz ak evalye pa quantitative Western blotting.Rezilta yo montre nan Figi 5B. Variant ki asosye ak maladi yo montre siyifikativman pi efikas obligatwa konpare ak G0. Nan 5 00 ng pwoteyin ki te ajoute nan chak reyaksyon, kantite ki te mare nan vesik yo te 43,5 ± 14,5 ng (n=8) pou G{{30}} ,73.0 ± 17.7 ng (n=7) pou G1, ak 69.3 ± 10.3 ng (n=8) pou G2 (mwayèn ± SD; p=0.00076 ak 0.0018 pou konparezon G0with G1 ak G2, respektivman). Apeprè 9 pousan nan G0protein nan reyaksyon an te asosye estab ak vesicles yo konpare ak apeprè 14 pousan nan G1 ak G2 nan kondisyon sa yo. Eksperyans sa a te fè de fwa lè l sèvi avèk preparasyon endepandan ki bay rezilta menm jan an.

Diskisyon

Nou isit la prezante rezilta etid nan aktivite pèmez ion nan ApoL1 ak li yoren-maladi-asosye varyant ki bay plizyè rezilta enpòtan. Premyèman, nou jwenn variants ApoL1 ki asosye ak maladi a ogmante anpil aktivite Kpermeaz, ki se apeprè doub izoform G0 nan tès nou yo. Dezyèmman, kontrèman ak Kpermeaz la, pa gen okenn diferans enpòtan nan aktivite espesifik Cl permease nan pH 5. 0 nan mitan izoform yo. Twazyèmman, pa gen okenn diferans nan sansiblite pH swa aktivite permease K oswa Cl, oswa egzijans pou pH trans segondè ak nesesite kation divalan pou aktivite Kpermease nan mitan izoform yo. Katriyèmman, nan kondisyon optimal ki sipòte K pèmez la, varyan ki asosye ak maladi yo montre asosyasyon manbràn ki estab améliorée konpare ak G0, men pa gen okenn diferans nan asosyasyon manbràn anba kondisyon pi bon pou aktivite Cl permease.

Konklizyon nou yo ki montre ogmante K permeaz ki pa gen okenn efè sou permeaz Cl yo trè gaya. Sèvi ak kondisyon pi bon pou chak aktivite pèmez, nou te jwenn rezilta esansyèlman idantik nan mitan sis seri endepandan de preparasyon, ak aktivite Kpermease nan varyant ki asosye ak maladi yo siyifikativman pi gran pase G0 nan chak. Chak seri te prepare epi teste an menm tan an lè l sèvi avèk reyaktif komen. Validite konsantrasyon pwoteyin yo detèmine pa tès BCA a te konfime pa entansite konparab tach Coomassie sou SDS-PAGE. Done sa yo gen ladann tout tantativ siksè pou pirifye similtane-nou pa janm avèk siksè pwodwi aset nan tout twa varyant nan ki aktivite relatif sa yo pa te obsève.

Menm jan an tou, absans diferans nan aktivite espesifik aniyon-permease nan pH 5 te konsistan nan tout seri preparasyon yo. Se konsa, konklizyon prensipal nou an se ke varyant maladi yo ki asosye nan ApoL1 bay benefis selektif nan fonksyon nan aktivite a pèmez K san yo pa afekte aktivite a permease Cl, jan yo teste nan kondisyon pi bon pou chak nan aktivite sa yo. Prezans diferans konsiderab nan aktivite chanèl kasyon varyant ApoL1 ki gen rapò ak kapasite pou kondwi maladi a gen enplikasyon pou mekanis patojèn posib. Nati selektif nan ogmante pèmeyabilite iyon an endike ke ogmante aktivite permease kation nan varyant ki asosye ak maladi yo ta ka kontribiye nan maladi, men ke aktivite anion pèmeyas nan pH ba, ki pa diferan nan mitan izoform yo, se fasil pou jwe yon wòl kritik.

Envestigasyon yo nan efè varyant yo sou pHsensitivities aktivite yo ak sou limit la nan stablemembrane obligatwa pa pwoteyin nan koule limyè sou mekanis nan ki aktivite a K permease ka amelyore. Premyèman, lòt pase konfime aktivite amelyore K permease nan kondisyon pi bon yo, nou pa jwenn okenn diferans nan fòm koub yo ki montre efè pH sou manbràn asosyasyon ak etap eflux aktivite K permease oswa efè pH sou aktivite total Cl permease. Anplis de sa, pa te gen okenn diferans nan egzijans pou pH elve nan enteryè a nan vesik yo oswa nan egzijans pou prezans nan kation divalan nan reyaksyon an pou aktivite a pèmez K nan mitan tout izofòm. Se konsa, nou pa jwenn okenn prèv pou yon diferans nan pwopriyete yo intrinsèques nan kanal la tèt li. Kontrèman, varyan yo te montre siyifikativman ogmante asosyasyon ki estab ak vesik fosfolipid nan kondisyon ki sipòte aktivite a Kpermease, ak echèl la nan efè sa a se apeprè menm ranje ak chanjman nan inaktivite. Ansanm, done yo sigjere ke baz pou aktivite a ogmante K permease se senpleman pi efikas ensèsyon manbràn anba kondisyon yo sipòte aktivite a, san yo pa bezwen envoke yon chanjman fondamantal nan pwopriyete yo nan pwoteyin ki mete.

Twa domèn yo te idantifye nan estrikti ApoL1 (6). Aktivite chanèl ion yo panse se nan domèn "pore-forming" homologue colicin, ki okipe apeprè 60 pousan pwoteyin nan tèminal N li yo. Varyasyon sekans maladi-asosye yo pa nan domèn pore-forming men nan yon distans de li nan yon domèn bobin bobin, ki genyen apeprè 16 pousan nan pwoteyin nan tèminal C a. Sipresyon domèn sa a pa gen okenn efè sou aktivite tripanolitik men li trè konsève nan mitan izofòm Apol ni nan ak ant espès yo (10). Li te sigjere rejyon sa a fonksyone kòm yon domèn kontwole (10), ak done nou yo endike ke mutants ki lakòz maladi nan domèn sa a tout bon te ogmante manbràn nan kondisyon ki sipòte aktivite chanèl kasyon ak aktivite chanèl kasyon ogmante. Youn nan entèpretasyon se ke domèn C-tèminal la sèvi pou siprime asosyasyon manbràn/ensèsyon ki nesesè pou aktivite permease kation, epi mitasyon domèn sa a detann repwesyon sa a.

Cistanche ka treterenmaladi

Obsèvasyon yo sou manbràn obligatwa gen plis enplikasyon ak eklere kèk aspè nan relasyon ki genyen ant aktivite anyon ak kasyon pèmez. Isit la nou jwenn ke anpil plis pwoteyin ki mare nan manbràn nan kondisyon aktivite anyon pi bon (pH 5.0) pase kondisyon obligatwa nan pi bon ki sipòte aktivite permease kasyon (pH 6.0), e sa a se vre pou tout moun. izofòm (figi 5). Note thedifference nan pH sansiblite aktivite anyon pèrmeas (figi 2D) ak etap la manbràn-obligatwa nan aktivite a cationpermease (figi 4C): anyon pèmez ogmante dramatikman pi ba pase pH 6, pandan y ap kapasite nan pwoteyin insertedinto nan manbràn nan sipòte kasyon. Pèmèt aktivite dropssiyifikativman. Done nou te rapòte deja te montre ke asosyasyon stablemembrane G0 ogmante anpil lè pH tonbe nan menm ranje pH sa a, e sa se seri kote fliyoresans pwoteyin intrinsèk yo pi dramatikman siprime (9), ki endike yon tranzisyon enpòtan nan estrikti pwoteyin lan. . Ansanm done yo sijere ke ensèsyon manbràn nan pH 6.0 se fondamantalman diferan pase ensèsyon manbràn nan pH 5.0. Nan pH 6.0, yon fraksyon ki pi piti nan pwoteyin yo asosye ak manbràn, akonpaye pa sèlman yon ti chanjman nan fliyoresans intrinsèques ak aktivite limite anyon pèmeze, men ak kapasite nan tranzisyon nan yon fòm cationpermeable lè lòj la cis titrate a pH7. .5. Anplis de sa, efikasite nan obligatwa sa a pi gwo pou varyant ki asosye ak maladi a, paralèl ak aktivite a ogmante kationpermease apre chanjman pH. Kontrèman, nan pH 5.0 se yon fraksyon pi gwo nan pwoteyin ki asosye ak manbràn yo; lyezon sa a akonpaye pa yon gwo chanjman nan fluoresans intrinsic ak aparans nan pi gwo aktivite anyonpermease. Ni manbràn obligatwa ni aktivite anionpermease diferan nan mitan izofòm yo. Kapasite pou pwoteyin sa a antre nan tranzisyon nan konfimasyon pèrmeaze kasyon an diminye anpil. Nou ipotèz ke chanjman ki te rapòte anvan nan fliyoresans intrinsèques kòm pH tonbe soti nan 6 a 5 se reflete yon transfòmasyon estriktirèl nan yon fòm ki pa kapab fè tranzisyon nan konformasyon pèrmeaze kasyon an, ak diferans ki genyen ant izofòm yo pa gen okenn efè sou pwopriyete yo pèmezi iyon nan konfòmasyon sa a.

Yon lòt obsèvasyon roman se ke iyon kalsyòm ak mayezyòm yo egalman efikas nan sipòte aktivite chanèl thecation nan ApoL1. Sa a fòtman sijere ke wòl nan kasyon divalan se pa nan kèk segondè-affinitybinding pa pwoteyin nan, men gen plis chans yon efè mwens espesifik chaj-pon ki pèmèt negatif chaje pwoteyin tointeract ak sifas la chaje negatif nan fosfolipidmembran.

Lòt envestigasyon evalye diferans ki genyen nan aktivite chanèl ion nan izoform ApoL1 yo te pibliye. Thompson ak Finkelstein (8) te itilize metòd elèktrofizyolojik ak teknik planar lipid bilayer pou evalye aktivite chanèl ApoL1 recombinant pirifye, pa rapòte okenn diferans nan karakteristik kanal nan mitan izoform yo. Li enpòtan pou sonje ke metòd bikouch lipid planè ak tès eflux ki baze sou vesik, pandan ke tou de yo se analiz chanèl, bay diferan kalite enfòmasyon epi yo ka konsidere kòm sistèm eksperimantal konplemantè. Metòd lipid bicouch yo se yon apwòch san parèy pou defini pwopriyete sèl-chanèl nan pwoteyin pirifye, men yo se zouti mwens pwisan pou quantifier aktivite espesifik, tandiske tès vesikul eflux ka bay done quantitative sou aktivite a nan yon popilasyon, men ti enfòmasyon sou pwopriyete sèl-chanèl. Kidonk, obsèvasyon yo nan Thomp pitit gason ak Finkelstein yo pa konsistan avèk nou an, ki montre tou pa gen okenn diferans aparan nan pwopriyete yo intrinsèques nan kanal la, men se sèlman yon diferans nan aktivite espesifik nan apeprè de fwa, yon echèl nan diferans ki ta dwe byen difisil. detekte nan sistèm bikouch lipid.

Envestigasyon ki sèvi ak pwoteyin pirifye ak lipid yo gen valè nan revele pwopriyete ki klèman akòz pwoteyin nan tèt li epi ki pa chanje pa nenpòt lòt konpozan, sinetik ekspresyon, oswa trafik manbràn ki konpwomèt sistèm pi konplèks. Sepandan, yo nesesèman silans sou efè final aktivite sa yo genyen sou selil vivan yo. Yo rapòte etid ki sèvi ak sistèm ekspresyon ki baze sou selil yo pou teaseout aktivite chanèl ion nan ApoL1 (revize nan Friedman and Pollak, 2019 (3)). Olabisi et al.(11) te eksprime izoform ApoL1 nan selil HEK ak evalye konsantrasyon potasyòm entraselilè nan eta a. Yo te jwenn potasyòm intraselilè pi ba nan selil ki eksprime G1 ak G2 konpare ak selil ki eksprime G0. Pandan ke obsèvasyon sa a ta ka konsistan avèk ogmante pèmeyabilite plasmamembrane K a, pi ba a K intraselilè kapab tou yon konsekans non espesifik nan pi gwo efè sitotoksik nan Variant a atravè nenpòt mekanis, ki mennen nan aktivite mwens aktif NaK ATPase ak / oswa dekonpozisyon nan entegrite plasmamembran. O'Toole et al. (12) ak anpil atansyon kalibre nivo ekspresyon nan selil HEK ak evalye aparans nan aktivite chanèl kasyon manbràn plasma, jwenn nodifferences nan mitan izoform yo. Shah et al. (13) rapòte vize ApoL1 nan mitokondri kote variants ki asosye ak maladi a te pwovoke ouvèti pò tranzisyon mitokondrial la, ki konsistan avèk prèv resan pou sitotoksisite tripanozòm. Si efè sa a egzije aktivite chanèl ion nan ApoL1 pa klè. Nan chak etid sa yo, akòz konpleksite sistèm ekspresyon ki baze sou selil yo, li pa ka sèten si nenpòt diferans ki te note se akòz pwopriyete intrinsèques nan pwoteyin lan oswa lòt konpozan kominike nan selil prezan yo.

Patojèn genyen-of-fonksyon mitasyon tipikman montre modèl eritaj dominan, pandan y ap lafenotip maladi renki asosye ak varyant ApoL1 se resesif. Youn nan mekanis kote yon mitasyon genyen-of-fonksyon ka berecessive se si pwoteyin nan fonksyone kòm yon omomultimer, ak WT a ka egzèse yon efè dominan-negatif sou varyant aktive a. Si ApoL1 fonksyone kòm yon chanèl kòm yon monomèr yon multimè se kounye a enkoni.

Done nou yo sijere ke ogmante pèmeyabilite kasyon nan nivo ekspresyon pwoteyin ka kontribiye tositotoksisite nan podosit oswa lòt selil. Sepandan, li ka sanble pa fasil ke yon jis ogmantasyon de fwa nan aktivite ta ka konvèti yon molekil w pèdi benign nan yon sèl maladi kondwi. Sepandan, maladi ki asosye ak varyant ApoL1 yo gen tandans pi piti pwogresif, ak diferans sibtil sou yon peryòd tan ki pwolonje (mwa rive ane) ta ka gen yon gwo efè kimilatif. Lòt mekanis potansyèl de ApoL1action responsab pourenblesiyo te pwopoze ak sipòte pa prèv (3-5, 11-16), ki gen ladan efè onapoptoz, otofaji, fonksyon mitokondriyo, trafik entracellularmembrane, ak efè medyatè nan molekil siyal ekstèn selilè, pami lòt moun. Enpòtans relatif diferans nan aktivite chanèl ApoL1 ki dekri isit la kont lòt mekanis potansyèl aksyon nan kondwi maladi rete yo dwe detèmine.

Cistanche ka treterenmaladi

Pwosedi eksperimantal

Konstwi ekspresyon

PET-ApoWT kodaj N-tèminal 6His ak T7 epitop-tagged ApoL1 (G0 vèsyon) te deja dekri (9). Pwoteyin ki kode a se ki idantik ak sa ki gen Genbank adhesion #BC143038 (aplotip 150K, 228I, 255K) soti nan asid amine 28 rive 398, elimine sekans siyal la nan asid amine 1-27 ak adisyon N-terminal {{ 17}}Tag epitop li a ak T7 kode pa plasmid pET28a a. Plasmid ki kode variants G1 ak G2 yo te pwodwi nan pET-ApoWT pa ranplasman nan fragman restriksyon AleI ak XhoI ak fragman ki gen sekans variant yo, sentèz pa Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, ak idantite plasmid ki kapab lakòz yo konfime pa sekans dirèk. Tout twa konstri yo te idantik eksepte pou sibstitisyon S342G ak I384M asid amine nan izofòm G1 ak efase N388-Y389 nan izofòm G2 la. Recombinant ApoL1isoforms yo te eksprime nan bakteri ak pirifye jan sa dekri (8) eksepte ke tanpon kolòn S200 la te genyen 0.03 pousan n dodecyl- -D-maltoside (DDM) (Millipore-Sigma). Pou tout seri eksperyans ki konpare izoform yo, yo te prepare materyèl yo an menm tan nan kondisyon ki idantik lè l sèvi avèk menm reyaktif yo. Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine ak BCA Pwoteyin Assay Twous (Thermo Fisher Scientific) lè l sèvi avèk estanda albumin bovineserum. Pou pwoteyin total tankou nan Figi 1, jèl yo te tache ak Instant Blue (Expedeon Inc). Pwoteyin nan tanpon S200 te jele nan nitwojèn likid epi estoke nan -80 C. Yo te dekonjle alikòt sou glas epi yo te dilye nan tanpon S200 anvan tès yo.

Ionofò

Valinomycin (Millipore Sigma) te fonn nan 5 0 mM etanòl inabsoli epi dilye a 1 mM nan etanòl absoli imedyatman anvan yo itilize. Chloride Ionophore 1 (MilliporeSigma) te fonn nan 100 mM nan 1-hexanol ak dilye nan 0.2 mM nan etanòl absoli imedyatman anvan yo itilize.

Vezik manbràn

Asolectin (soja fosfatidilkolin tip II, Sigma) wasacetone-extrait jan sa dekri (30), seche, ak Lè sa a, fonn nan klowofòm epi estoke nan -20 C. Yo te cheche yon alikòt fosfolipid nan klowofòm anba yon kouran nitwojèn epi sispann. nan 20 mg/ml nan 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH8.0 pa senk sik friz-dekonjle ak vortexing wòdpòte. Sispansyon sa a te estoke nan -20 degre. Pou jenere KCl-loadedunilamellar vesik nan apeprè 200 nm dyamèt, sispansyon thelipid te pase 15 fwa nan yon filtè manbràn porepolycarbonate 200 nm lè l sèvi avèk yon chanm extruder (Avanti Polar Lipids) ak pwotokòl la bay pa themanufacturer (17, 18). Vesikil ekstride yo te kenbe sou glas epi yo te itilize nan 24 èdtan.

Esay aktivite

Egzamen aktivite Ion pèrmeas lè l sèvi avèk manbràn potansyèl kondwi KCl eflux detekte ak yon electrodewere klori selektif fè jan sa deja dekri (9). Yo ajoute ven mikrolit ApoL1 nan tanpon S200 (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH8.3, 0.3 pousan DDM). a 380 ul melanj reyaksyon ki gen ladann 82 mM KCl, 127 mM sikwoz, 42.1 mM tanpon nan pH ki endike (MES pou pH 5-6.5, HEPES pou pH 7.0-8.0), 2.63 mMCa (gluconate)2, ak 1.84 mg/ml izolectin ekstrè. Vesicles.Se melanj lan enkube nan tanperati chanm pou 4 min anvan yo pase nan yon 3 ml Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) spinkolumn ekilibre nan 330 mM sikwoz. Eluate a imedyatman ajoute nan 2 ml sikwoz 330 mM, 10-5 M KCl, 2.5 mM Ca(gluconate)2, ak 10 mM tanpon (MES pou pH 5-6.5; HEPES pou pH 7-8) jan sa endike, ak siveyans kontinyèl ak yon elektwòd selektif klori ak anrejistre jan sa dekri. Apre 20 s, yo te inisye ekoulman vòltaj-kondwi pa adisyon a nan yon ionofò (2.5 ul nan swa 1 mM valinomisin oswa 0.2 mMClorur Ionofò 1 nan etanòl) ak pèmèt yo kontinye pou 30 s. Apre sa, ajoute Triton X-100 a 0.1 pousan pou libere klori intravesicular ki rete yo. Done kri nan mV te konvèti nan konsantrasyon Cl lè l sèvi avèk yon koub estanda ki te pwodwi pou elektwòd la nan kondisyon tès la. Pousantaj inisyal fraksyon nan lage klori te sòti nan 3 s pandan repons maksimòm imedya a nan adisyon a nan ionofò.

Tout konparezon aktivite yo te fèt lè l sèvi avèk materyèl ki soti nan preparasyon similtane twa izofòm yo ki te dilye a 100 ug/ml pwoteyin nan tanpon S200 anvan tès yo.

Esè asosyasyon manbràn

Egzamen asosyasyon manbràn yo te fèt separeman nan kondisyon ki pi bon pou aktivite permeaz Cl ak aktivite pèmeaz K. Pou kondisyon ki sipòte aktivite Clpermeaz, 5 ul nan 100 ug/ml pwoteyin nan 1{{30}} mM Tris pH8.2, 150 mM NaCl , 0.03 pousan DDM te ajoute nan 95 ul nan reactionmix (3.4 mg / ml izolektin vesik (chaje ak 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 5.0, 2.5 mM Ca (gluconate) 2, 100 mM KCl, 100 mM sikwoz) ak enkube tanperati atroom pou 1 min. Pwoteyin ak lipid nan tès la se 1:680 mas/mas. Te echantiyon an dilye san pHshift pa adisyon nan 200 ul nan 60 mM MES pH 5.0, 2.5 mMCa (gluconate)2, 100 mM KCl, 100 mM sikwoz ak incubatedfor 20 s. Yo te ajoute yon santèn mikrolit 8 M ure, melanje, ak Lè sa a, enkube nan tanperati chanm pou 15 min.Konsantrasyon sikwoz la te pote nan 40 pousan pa adisyon a nan 1.6 ml nan 50 pousan sikwoz. Echantiyon an 2 ml te kouch anba a 1 mlof 30 pousan sikwoz nan 8 mM MES pH 5.0, ki te nan vire anba a 1.7 ml nan sikwoz-gratis 8 mM MES pH 5.0. Te santrifuje gradyan apik yo nan 200,000g nan yon rotor Beckman Coulter TLA{-110 pou 90 min nan 4 C. Yo te kolekte vesik yo nan koòdone sikwoz 0 a 30 pousan. Fraksyon egal echantiyon yo te dilye 4 fwa epi santrifuje nan 100,000g pou 1 èdtan. Granules manbràn yo te cheche, separe pa SDS-PAGE, blotting topolyvinylidene fliyò manbràn, ak sonde pa westernblotting ak antikò nan epitop T7 (MilliporeSigmaproduct no. 69522-3) ak deteksyon chemiluminescence usinga digital D' sistèm. Dilusyon seri de pwoteyin pirifye yo te enkli sou jèl la pou jenere yon koub estanda izotip ak blot-espesifik pou chak pwoteyin.

Pou kondisyon ki sipòte aktivite K permeaz, yo te ajoute 5 ul nan 100ug/ml pwoteyin nan 10 mM Tris pH 8.2, 150 mM NaCl, 0.03 pousan DDM nan 95 ul nan melanj reyaksyon (3.4 ug/ml izolectinvesicles (chaje ak 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 6.0, 2.5 mM Ca (gluconate)2, 100 mM KCl, 100 mM sikwoz) ak enkubasyon nan tanperati chanm pou1 min. Te echantiyon an dilye ak chanjman pH a 7.5 pa additionof 200 ul nan 60 mM HEPES pH 8.0, 2.5 mM Ca (gluconate) 2,100 mM KCl, 100 mM sikwoz ak enkubasyon pou 20 s. Yo te ajoute yon santèn mikrolit 500 mM Na2CO3 epi yo te enkube nan tanperati chanm pou 15 min. Konsantrasyon sikwoz la te pote nan 40 pousan pa adisyon a nan 1.6 ml nan 50 pousan sikwoz. Echantiyon an 2 ml te kouch anba a 1 ml 30 pousan sikwoz nan 8 mM Tris pH 8.3, ki te nan vire anba a 1.7 ml ofsucrose-gratis 8 mM Tris pH 8.3. Kousen sikwoz yo te santrifuje epi yo te kolekte yon echantiyon epi trete jan pi wo a.

Estatistik

Siyifikasyon diferans ki genyen ant pè vle di nan seri done yo te detèmine lè l sèvi avèk analiz divèjans (ANOVA) (19). Paramèt estatistik yo te detèmine lè l sèvi avèk yon fonksyon entegre nan Excel. Valè P yo te kalkile lè l sèvi avèk socscistatistics.com. Tout pwen done yo prezante kòm mwayèn ± devyasyon estanda (SD), detèmine ak fonksyon STDEV.S nan Excel pou chak gwoup endividyèl nan kopi.

Done disponib Tout done ki sipòte papye sa a pral pataje sou demann Dr John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche ka treterenmaladi

Rekonesans—Nou remèsye Divizyon Nefroloji ak Depatman Medsin Entèn nan Saint Louis University pou sipò esansyèl pou fè travay sa a.

Kontribisyon otè—JCE te vin ansent ak sipèvize etid la, asire finansman, fè tès eflux yo, entèprete done, epi ekri papye a; JB pirifye pwoteyin yo, fè tès asosyasyon manbràn yo, entèprete done, prepare figi yo, ak edited papye a.

Finansman ak enfòmasyon adisyonèl—Travay la te finanse pa resous enstitisyonèl Saint Louis University ak pa National Institutes of Health sibvansyon R01 DK120651 bay JCE Kontni papye sa a se responsablite sèlman otè yo epi li pa nesesèman reprezante opinyon ofisyèl Enstiti Nasyonal Sante yo.

Konfli enterè—Otè yo deklare ke yo pa gen okenn konfli enterè ak sa ki nan atik sa a.

Abreviyasyon yo—Abreviyasyon yo itilize yo se: ApoL1, apolipoproteinL1; CI1, ionofò klori 1; DDM, n-dodecyl- -D-maltoside;PVDF, fliyò polivinilidèn; SD, devyasyon estanda; Val, valinomisin.

Soti nan: 'ren-maladi-asosye variants de Apolipoprotein L1 montre gain fonksyon nan aktivite chanèl cation' byJonathan Bruno ak John C. Edwards

---J. Biol. Chem. (2021) 296 100238

Referans

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, et al. (2010) Asosyasyon variants trypanolytic ApoL1 akrenmaladinan Afriken Ameriken yo. Syans 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) APOL1 risk varyant, ras, ak pwogresyon nan kwonikrenmaladi. N. Engl. J. Med. 369, 2183–2196
3. Friedman, DJ, ak Pollak, MR (2020) APOL1 akrenmaladi: Soti nan jenetik nan byoloji. Ann. Rev Physiol. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF, ak Sedor, JR (2017) Idantifye fonksyon entraselilè APOL1. J. Am. Soc. Nefròl. 28, 1008–1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H., and Okamoto, K. (2018) Apolipoprotein L1 nephropathies: 2017 in review. Curr. Opinyon. Nefròl. Hypertens. 27, 153–158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R., ak Pays, E. (2005) Apolipoprotein LI ankouraje liz tripanozòm pa fòme porositë nan manbràn lizozomal. Syans 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S., ak Hajduk, SL (2009) Permeabilization manbràn pa faktè trypanosom litik, yon lipoprotein cytolytic imen segondè-dansite. J. Biol. Chem. 284, 13505–13512
8. Thomson, R., ak Finkelstein, A. (2015) Faktè trypanolytic imen APOL1 fòme chanèl cation-selectif pH-gate nan planar lipid bilayers: Relevance to trypanosome lysis. Pwosedi. Natl. Acad. Sci. USA 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J., ak Edwards, JC (2017) Apolipoprotein L1 bay pèmeyabilite ion pH-chanje nan vesik fosfolipid. J. Biol. Chem. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B., ak Pays, E. (2006) Fonksyon apolipoproteins L. Cell Mol. Lavi Sci. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3yèm, Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ, ak Pollak, MR (2016) APOL1renmaladivaryant risk lakòz sitotoksisite pa diminye potasyòm selilè ak pwovoke
kinaz pwoteyin ki aktive estrès. Pwosedi. Natl. Acad. Sci. USA 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA, ak Sedor, JR. (2018) ApoL1 twòp ekspresyon kondwi cytotoxicity varyant-endepandan. J. Am. Soc. Nefròl. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR, ak Friedman, DJ (2019) APOL1renvaryant risk pwovoke lanmò selil atravè translokasyon mitokondriyo ak ouvèti pò a tranzisyon pèmeyabilite mitokondriyo. J. Am. Soc. Nefròl. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Gram, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) Yon konplèks triparti nan suPAR, APOL1 risk varyant ak alphavbeta3 integrin sou podocytes medyatè kwonik.ren maladi. Nat. Med. 23, 945–953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) APOL1 ren-risk varyant pwovoke malfonksyònman mitokondriyo. J. Am. Soc. Nefròl. 28, 1093–1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z., ak Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, yon roman Bcl -2 domèn omoloji {{4 }}sèlman pwoteyin lipid-obligatwa, pwovoke lanmò selil otofaj. J. Biol. Chem. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G., ak Cullis, PR (1985) Pwodiksyon gwo vesik unilamellar pa yon pwosedi ekstrizyon rapid: Karakterizasyon distribisyon gwosè, volim kwense ak kapasite pou kenbe yon potansyèl manbràn. Biochim. Biophys. Acta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ, ak Papahadjopoulos, D. (1979) Preparasyon lipozom nan distribisyon gwosè defini pa extrusion nan manbràn polikarbonat. Biochim. Biophys. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Wayòm Ini.