KLRG1 make sou-ansanm selil CD4 T ki enfiltre timè ki asosye ak pwogresyon timè ak repons imunoterapi.

Résumé

Metòd aktyèl pou dekouvèt biomakè ak idantifikasyon sib nan imuno-nkoloji konte sou snapshots estatik nan iminite timè. Pou byen karakterize nati tanporèl repons iminitè antitumoral yo, nou devlope yon 34-panèl sitometri flux espektral paramèt epi nou te fè analiz gwo debi nan kontèks kritik yo.

Nou te ogmante de modèl preklinik distenk ki refè kansè iminoediting (NPKC1) ak repons iminitè pòs kontwòl (ICB) (MC38), respektivman, ak pwofil plizyè tisi ki enpòtan nan ak alantou pwen enfleksyon kle nan siveyans iminitè ak chape ak / oswa repons ICB.

Objektif yo refere a biomolekil enpòtan nan selil yo, tankou pwoteyin, anzim, ak reseptè. Rekonesans sib se itilizasyon metòd chimik ak byolojik pou idantifye pwopriyete espesifik ak fonksyon biomolekil sa yo pou aplikasyon nan tretman maladi ak devlopman dwòg.

Iminite refere a kapasite kò a pou reziste envazyon patojèn etranje ak kwasans selil andojèn nòmal yo. Nwayo sistèm iminitè a se selil iminitè ak molekil, ki gen koneksyon sere ak entèraksyon ak objektif yo.

Nan tretman maladi ak devlopman dwòg, relasyon ki genyen ant idantifikasyon sib ak iminite trè enpòtan. Pou egzanp, mekanis nan aksyon nan anpil dwòg se atravè rekonesans sib, vize pwoteyin espesifik, anzim, reseptè, ak lòt molekil, ki afekte fonksyon yo, ak reglemante transduction siyal, reyalize efè terapetik. Selil ak molekil nan sistèm iminitè a kapab tou sib dwòg. Pou egzanp, dwòg antikansè reyalize efè terapetik lè yo afekte repons iminitè selil kansè yo ak reglemante apoptoz selil ak pwopagasyon.

Se poutèt sa, nan devlopman dwòg ak tretman klinik, konsiderasyon konplè sou idantifikasyon sib ak faktè iminite ka mennen nan devlopman dwòg pi efikas ak amelyore efè terapetik. Soti nan pwen de vi, nou bezwen amelyore iminite. Cistanche ka amelyore iminite. Cistanche se moun rich nan yon varyete de sibstans antioksidan, tankou vitamin C, vitamin C, karotenoid, elatriye engredyan sa yo ka retire radikal gratis, diminye estrès oksidatif, ak amelyore iminite. rezistans sistèm.

Klike sou poud extrait cistanche tubulosa

Analiz done ki baze sou aprantisaj machin yo te revele yon modèl ekspresyon KLRG1 ki idantifye inikman popilasyon selil T CD4 intratumoral yo ki asosye ak fado timè atravè modèl timè yo, epi yo pèdi nan timè ki sibi regresyon an repons a ICB. Menm jan an tou, yon Helios-KLRG1 plis sou-ansanm nan timè-enfiltre selil T regilasyon (Tregs) te asosye ak pwogresyon timè soti nan ekilib iminitè yo sove epi li te tou pèdi nan timè reponn a ICB.

Etid validation konfime siyati KLRG1 nan selil T CD4 imen ki enfiltre timè ki asosye ak pwogresyon maladi nan kansè nan ren. Konklizyon sa yo nonmen popilasyon selil KLRG1 plis CD4 T kòm sous-ankèt pou plis envestigasyon nan iminite kansè epi demontre itilite profilaj koule espektral longitudinal kòm yon motè biomarker dinamik ak / oswa dekouvèt sib.

Entwodiksyon

Iminoterapi se kounye a yon poto nan tretman kansè. Sepandan, repons a pifò ajan imunoterapi yo rete ra, limite a yon kantite limite nan kalite timè, epi li difisil pou predi (1). Amelyore pousantaj repons yo ak devlope byomarkè prediksyon repons yo se objektif santral nan domèn iminoloji timè a, men sa a rete difisil.

Yon foul moun nan konplèks entèraksyon milti-selilè ka gouvène rezilta a nan yon repons iminitè antitumoral nan nenpòt pasyan yo bay yo. Se poutèt sa, li komen ke byomarkè sèl - oswa modulasyon terapetik nan chemen sengilye - yo gen tandans gen sèvis piblik nan kèk, men se pa pifò pasyan kansè yo.

Pou egzanp, gen twa biomarkers ki gen rapò ak iminitè kounye a nan itilizasyon klinik toupatou; (i) chay mitasyon timè (TMB), jan yo mezire dirèkteman oswa dedwi atravè prezans mitasyon enfimite nan machin reparasyon ADN (2-4), (ii) ekspresyon PD-L1 pa imunoistochimi (IHC) (5), ak (iii) iminite pre-egziste jan yo mezire pa prezans nan selil T CD8 nan ak timè ki antoure, yo rele Immunoscore (6).

Pandan ke yo chak siyifikativman asosye ak repons a iminoterapi nan sèten kontèks, sansiblite a ak espesifik nan prediktè sa yo rete sub-optimal (7). Apwòch unimodal sa yo gen anpil chans pa pran totalman mekanis konplèks ki kache iminite antitumoral, ki gen ladan nati dinamik repons sa yo ki fèt atravè tisi yo ak sou tan.

Kòm sa yo, aplikasyon an nan trè multiplexed sèl-selil pwofil iminitè apwòch nan deteksyon biomarker ak dekouvèt sib nan yon fason kwa-tisi, longitudinal ka bay fenotip iminitè nuans ak pi gwo sèvis piblik prediksyon ak tradiksyon.

Pou sa ka fèt, nou te devlope yon 34-panèl sitometri flux espektral paramèt ak gwo dimansyon analiz done tiyo pou entèwoje fenotip iminitè nivo pwoteyin ki asosye ak diferan faz nan sik iminitè kansè a, ki gen ladan chape iminitè ak devlopman timè, ak pòs iminitè. repons blokaj (ICB) atravè modèl preklinik yo.

Nou profil NPK-C1 ak ICB-trete modèl MC38 yo, analize tisi miltip (timè, drenaj kont gangliyon lenfatik ki pa drenaj, ak san) sou ak alantou pwen enfleksyon kle nan pwogresyon timè. Sa a te fasilite karakterizasyon an gwo twou san fon nan dinamik ki kache natirèl ak ICB-induit regression timè, tranzisyon nan ekilib iminitè, ak tranzisyon ki vin apre soti nan ekilib nan chape timè san kontwòl. Etid validation nan seri done moun sèl selil kansè nan ren konfime enpòtans tradiksyon rezilta sa yo.

Materyèl ak Metòd

Sourit. Sourit gason ak fi C57BL/6J (5-6 semèn fin vye granmoun) yo te achte nan laboratwa Jackson (Bar Harbor, ME). Sourit yo te gen 6-8 semèn nan moman yo te itilize yo. Tout bèt yo te loje an akò strik ak règleman NIH ak Asosyasyon Ameriken pou Swen Animal Laboratwa. Tout eksperyans ak pwosedi pou etid sa a te apwouve pa Columbia University Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Liy selilè. Doktè Cory AbateShen nan Columbia University te bay liy selil NPK-C1 (orijinèlman LM7304). Gade referans anvan pou plis detay (8,9). Selil NPK-C1 yo te kenbe nan R10, ki gen ladann RPMI mwayen (Corning; Corning, NY) siplemantè ak 10 pousan FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/mL penisilin, ak 100 mg/mL streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD). Selil kansè nan kolon MC38 yo te achte nan men Kerafast ak kiltive nan D10 ki gen ladann DMEM (Corning; Corning, NY) complétée ak 10 pousan FBS, 100 U/mL penisilin, ak 100 mg/mL streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD).

Defi timè ak piki terapi. Selil NPK-C1 nan 70-90 pousan konfluyans oswa selil MC38 nan 50-75 pousan konfluans yo te rekòlte ak 0.05 pousan tripsin (Gibco, Gaithersburg, MD), lave ak PBS, konte, epi resuspend nan 10x106 selil/mL nan glas PBS frèt. Nan jou 0, sourit ki gen 6-8 semèn yo te enplante sou flan dwat la ak selil 1x106 NPK-C1 oswa MC38. Mezi timè yo te anrejistre nan dimansyon X, Y, ak Z (pi gwo dyamèt, pi piti dyamèt, ak pi gwo wotè, respektivman) chak 2-3 jou pa kalib dijital ak volim timè yo te kalkile pa miltipliye X * Y * Z. Anti-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) oswa Rat IgG2a izotip antikò (Bio X Cell; Liban, NH) te dilye nan PBS esteril epi yo te administre pa piki intraperitoneal (IP) nan 200 ug/ mL pou chak sourit nan jou 3, 6, 9, ak 12 apre enplantasyon MC38.

Rekòlte tisi. Apre etanazi sourit, ~200 ul san yo te izole atravè pike kadyak lè l sèvi avèk yon zegwi sereng 0.2 pousan (StemCell Technologies; Vancouver, BC) kouvwi epi yo te mete yo sou glas nan tib ki gen 10 ul 0.5M. EDTA (Corning; Corning, NY). Ganglion lenfatik inguinal ki drenaj timè ak ki pa drenaj yo te diseke epi yo mete yo nan plak 48-byen ki gen 150 ul R10 medya sou glas.

Timè yo te rekòlte, mased, epi jiska 50 mg timè yo te koupe ak mete yo nan X-Vivo 15 medya (Lonza; Basel, Swis) nan 5mL tib Eppendorf sou glas. DNase (40 ul nan 20 mg / mL solisyon; Roche; Bâle, Swis) ak Collagenase D (125 ul nan 40 mg / mL solisyon; Roche; Bâle, Swis) yo te ajoute nan echantiyon timè anvan enkubasyon sou yon shaker nan 37o C pou 30 minit. Reyaksyon dijere yo te etenn pa vortexing (30 segonn) epi ajoute 5mL medya R10. Dijere timè yo te filtre nan filtè 70 μm (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) ak granules. Echantiyon san yo te RBC lysed ak de siksesif 2-enkubasyon minit nan 2mL ACK tanpon (Quality Biological; Gaithersburg, MD) ak trempe nan R10 anvan granules. Nœuds lenfatik yo te divize fizikman ak yon piston sereng 1mL nan plak 48-byen an, epi sispansyon yo te filtre nan filtè 40-um. Tout echantiyon yo te plase nan plak U-anba 96-byen pou tach.

Sitometri koule. Yo te lave echantiyon yo avèk PBS. Selil mouri yo te tache pa resuspension nan 100 ul PBS plis Live/Dead Fixable Blue lank (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Sa a ak tout etap plis tach oswa fiksasyon yo te fèt pou 30 minit nan tanperati chanm sou yon plak Shaker, pwoteje kont limyè. Echantiyon yo te lave 2x ak PBS, Lè sa a, yo te resuspend nan FACS (PBS plis 3 pousan FBS plis 1mM EDTA plis 10mM HEPES) complétée ak TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) ak TruStain Monocyte Blocker (1:20; BioLegend; San Diego, CA) epi yo mete sou glas.

Antikò sifas yo te prepare nan dilusyon optimal (gade Tablo Siplemantè S1) nan FACS complétée ak tanpon Brilliant Stain Plus (BD; Franklin Lakes, NJ), Lè sa a, yo te ajoute nan echantiyon nan yon solisyon bloke. Apre tach, echantiyon yo te lave 2x ak tanpon FACS epi yo te fikse nan 100 ul nan tanpon FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit (eBioscience; San Diego, CA). Echantiyon yo te lave de fwa ak 1X tanpon pèmeabilizasyon (1X PW) ak Lè sa a, tache nan 1X PW plis antikò entraselilè. Lè sa a, echantiyon yo te lave de fwa nan 1X PW Lè sa a, fiks nan 100 ul nan tanpon FluoroFix (BioLegend: San Diego, CA), lave de fwa ak FACS, Lè sa a, resuspend nan 200 ul FACS ak sele nan 96 ul plak yo pou akizisyon jou apre a sou yon Cytek Aurora 5-sitomèt lazè.

Ansanm tache echantiyon splenosit yo te itilize pou kontwòl sèl tach. Analiz ak Estatistik. Eksperyans Profiling Longitudinal yo te fèt yon fwa chak pou modèl MC38 ak NPK-C1. Yo te evalye yon total n=10-25 sourit pou chak pwen tan. Done sitometri Flow yo te analize nan FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ), epi yo te telechaje algorithm plugin UMAP ak FlowSOM ki gen gwo dimansyon nan FlowJo Exchange. Jiska 30k CD45 vivan plis selil ki enfiltre timè yo ak jiska 15k CD45 vivan plis selil san oswa LN ki sòti nan chak echantiyon yo te konkatenasyon pou analiz dimansyon wo.

Tout rediksyon dimansyon ak gwoupman yo te fèt nan FlowJo. Analiz estatistik yo te fèt nan GraphPad Prism v9.3.1. Yo te itilize Pearson Korelasyon pou jenere koyefisyan korelasyon, epi yo te itilize T-tès Elèv ki pa pè ak koreksyon Welch pou konpare frekans gwoup ant gwoup yo. Metòd analyse sèl selil yo deja dekri (10,11).

Regulon KLRG1 a te extrait nan konsansis metaVIPER KLRG1 regulon nan Obradovic, et al (11). Pou kalkile siyati regulon KLRG1 la, nou anfòm yon modèl regresyon forè o aza ak jèn regulon kòm karakteristik ak KLRG1 kòm yon sib, Lè sa a, kalkile nòt Gini enpòtans jèn regulon pou detèmine enpak yo sou ekspresyon KLRG1. Nòt regulon KLRG1 nan chak selil yo te bay nan sòm pondéré mezi ekspresyon tout jèn regulon nan selil la ak nòt enpòtans kòm pwa.

For more information:1950477648nn@gmail.com