Peroksidasyon lipid lisosomal kontwole iminite timè yo

Anpèchman lisosomal pwovoke pa inibitè palmitoyl-pwoteyin thioesterase 1 (PPT1) tankou DC661 ka pwodwi lanmò selil, men mekanis pou sa a pa konprann konplètman. Chemen lanmò selil pwograme (otofaji, apoptoz, nekroptoz, ferroptoz, ak piroptoz) pa te oblije reyalize efè sitotoksik DC661. Anpèchman nan kathepsin, oswa fè oswa chelation kalsyòm, pa t 'sovtaj DC661-sitotoksisite pwovoke. Anpèchman PPT1 pwovoke peroksidasyon lipid lizozomal (LLP), ki te mennen nan pèrmeabilizasyon manbràn lizozomal ak lanmò selil ki ta ka ranvèse pa antioksidan N-acetylcysteine ​​(NAC) men pa lòt antioksidan peroksidasyon lipid. Transpò lisosomal cysteine ​​MFSD12 te obligatwa pou transpò intralysosomal NAC ak sekou LLP. PPT1 anpèchman pwodui iminojenisite selil-intrinsèk ak ekspresyon sifas calreticulin ki ta ka sèlman ranvèse ak NAC. Selil ki te trete ak DC661-prime selil T nayif yo ak amelyore toksisite selil T yo. Sourit ki te pran vaksen ak selil ki te trete DC661-yo te lakòz iminite adaptasyon ak rejè timè nan timè "iminitè cho" men pa nan timè "iminitè frèt". Konklizyon sa yo demontre ke LLP kondui lanmò selil lizozomal, yon fòm inik iminojèn lanmò selil, montre chemen an nan konbinezon rasyonèl nan imunoterapi ak anpèchman lizozomal ki ka teste nan esè klinik.

Benefis cistanche tubulosa-Antitumor

Entwodiksyon

Avèk aktivite ankourajan nan esè klinik ki enplike hydroxychloroquine inhibitor lysosomal (HCQ) (1), idantifikasyon palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) kòm sib molekilè nan dérivés chloroquine (2), ak lansman nouvo inibitè PPT1 nan klinik. esè (3, 4), gen yon bezwen konprann mekanis nan ki inibitè lizozomal pwovoke lanmò selil ak efè a nan anpèchman lizozomal sou iminite timè. Mekanis kanonik lanmò selil lizozomal ki dekri pou HCQ enplike pèmeabilizasyon manbràn lizozomal (LMP), flit nan kathepsin, ak aktivasyon apoptoz caspase-medyatè (5, 6). Nou te deja montre ke inibitè a lizozomal DC661 penetre selil nan mikroanvironman timè asid la ak lokalize nan lizozom nan pi efikas pase HCQ (2, 7). DC661 pwodui lanmò selil ki pisan atravè anpil liy selil kansè (2). DC661 mare ak inibit PPT1, dezidifye lizozom nan, ak inibit otofaji. DC661 tou pwovoke LMP ak ogmante nivo kaspase 3 (2, 7). Nan dènye ane yo, yo te defini nouvo mekanis lanmò selil ki gen konsekans imunojèn epi yo gen ladan nekroptoz, ferroptoz, ak piroptoz (8). Yo te montre otofaji lisozòm depandan yo degrade MHC klas I (9), osi byen ke eleman nan imunoproteasome a (10), sijere ke anpèchman otofaji ka amelyore pwosesis antijèn. Sepandan, efè iminojenik anpèchman lizozomal ak lanmò selil ki vin apre yo pa te konplètman karakterize. Pou abòde diferans konesans sa a, nou te envestige efè DC661 sou mekanis lanmò selil kanonik pou detèmine si lanmò selil lizozomal se fòm lanmò selil li oswa tou senpleman yon précurseur nan youn nan lòt mekanis etabli yo. Nou te jwenn ke HCQ ak DC661 pwovoke yon ogmantasyon siyifikatif nan sèlman yon ti kantite pwoteyin nan proteome melanom la ak pi fò nan sa yo te pwoteyin ki gen rapò ak otofaji ak apoptoz. Inibitè nan lanmò selil pwograme (apoptoz, nekroptoz, ferroptoz, ak piroptoz) pa t 'beye efè sitotoksik apre andikap lizozomal pa DC661. Peroksidasyon lipid lisosomal (LLP) se yon gwo chofè nan lanmò selil LMP-induit ki asosye ak ekspresyon calreticulin (CALR) sou sifas selil la. Fòm sa a nan lanmò selil ka ranvèse sèlman lè w itilize antioksidan N-acetylcysteine ​​(NAC). Aktivite NAC te gen pwoblèm pa anpèchman nan importateur sistein lizozomal MFSD12. LLP te pwovoke fenotip imunojèn ki te ankouraje touye selil T yo. Konklizyon sa yo demontre ke lanmò selil lizozomal se yon fòm potansyèlman inik nan lanmò selil imunojèn.

cistanche plant-ogmante sistèm iminitè

Rezilta yo

Anpèchman lisosomal pwovoke chanjman enpòtan nan pwoteòm ki asosye ak otofaji ak apoptoz. Pou etabli efè sitotoksik inibitè lizozomal yo, nou te evalye rantabilite melanom A375P, kansòm kolon RKO, ak liy selil kansè pankreyas MIA PaCa-2 trete ak vacuolar H+-ATPase inhibitor bafilomycin-A1 (1). 00 nM); PPT1 inhibiteurs DC661 (3 μM) oswa HCQ (10 μM oswa 30 μM); palmitate mimetik hexadecyl sulfonyl fliyò (HDSF; 60 μM); inibitè kathepsin pepstatin A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL), oswa PepA + E64; ak disruptor manbràn lizozomal Leu-Leu methyl ester hydrobromide (20 μM) pou 48 èdtan. Se sèlman bafilomycin-A1 ak DC661 ki te lakòz yon diminisyon enpòtan nan viabilite selil atravè liy selil kansè yo (Figi 1A ak Figi Siplemantè 1A; materyèl siplemantè ki disponib sou entènèt ak atik sa a; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), ak DC661 pwodwi yon rediksyon pi pwofon nan viabilite selil pase bafilomycin-A1. Baze sou done sa yo ak pwopriyete famasi tankou dwòg nan dérivés klowokin, nou konsantre etid nou an sou dérivés klowokin kòm zouti pou konprann lanmò selil lizozomal. Yo te aplike yon analiz proteome mondyal san patipri nan selil melanom A375P ki te trete ak DC661 (3 μM) oswa HCQ ki pi piti (10 μM oswa 30 μM) pou 24 èdtan. Nan 4,264 pwoteyin ki gen anpil konfyans, sèlman 87 ak 55 pwoteyin yo te siyifikativman ogmante ak DC661 (3 μM) ak HCQ (30 μM), respektivman; Anplis de sa, 14 ak 15 pwoteyin yo te siyifikativman diminye ak DC661 (3 μM) ak HCQ (30 μM), respektivman (chanjman pliye absoli ki gen plis pase 2; q <0.05) ak DC661 (3 μM) oswa HCQ (30 μM), respektivman. , lè yo konpare ak kontwòl machin. Dòz ki pi ba nan HCQ (10 μM) pa montre okenn chanjman pwoteyin enpòtan konpare ak kontwòl machin. Top 50 pwoteyin yo ki te ogmante siyifikativman apre tretman DC661 yo te sitou asosye ak otofaji ak apoptoz, ak chanjman ki sanble yo te obsève pou dòz ki pi wo nan HCQ (Figi 1B). Pou rezon sa yo, nou te chwazi konsantre plis etid sou DC661 ki pi pisan. Egzanp kèk nan pi gwo chanjman pwoteyin ki asosye ak otofaji ak apoptoz se te taks1-pwoteyin obligatwa 1 (TAX1BP1; ogmante 15-pliye); BCL2-pwoteyin entèraksyon 3 (BNIP3; ogmante 6-pliye); vwazen nan pwoteyin jèn 1 BRCA1 (NBR1; ogmante 12- pliye); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; ogmante 5-pliye); reseptè nikleyè coactivator 4 (NCOA4; ogmante 3-pliye); ak LC3B (MAP1LC3B; ogmante 3-pliye). Apolipoprotein B-100 (APOB; ogmante 66-pliye) te sòti nan serom ti towo bèf fetis la epi yo pa te etidye plis. Immunoblotting te konfime ke tretman ak DC661 oswa pi wo konsantrasyon nan HCQ pwodui ogmantasyon make nan ekspresyon reseptè kago otofaji NBR1, TAX1BP1, SQSTM1 / p62, ak NCOA4 nan yon fason ki depann de dòz ak tan (Figi Siplemantè 1, B ak C). CRISPR/Cas9 KO nan PPT1 nan selil A375P fenokopi efè DC661 sou pwoteyin sa yo lè yo konpare ak tokay WT yo (Figi Siplemantè 1D). Sepandan, ekspresyon reseptè kago otofaji yo ak ogmantasyon relatif yo pwovoke pa tretman DC661 yo te varyab atravè kansè nan kolon, kansè nan pankreyas, ak lòt liy selil melanom kote DC661 demontre sitotoksisite (Figi Siplemantè 1E). Sa a sigjere ke reseptè kago otofaji tèt yo, byenke ogmante nan nivo pwoteyin, pa gen anpil chans yo dwe responsab pou lanmò selil apre tretman DC661. Pou konfime sa a, nou konsantre sou reseptè kago otofaji TAX1BP1 ak BNIP3 paske yo te konnen efè proapoptotic nan selil kansè yo (Figi 1C). TAX1BP1 se yon adaptè kago otofaji (11) epi tou li kontwole apoptoz pwovoke pa inhibiteur sentèz pwoteyin oswa ajan ki domaje ADN nan selil kansè yo (12). Knockdown nan TAX1BP1 pa siRNA (Figi 1D) pa te afekte DC661-sitotoksisite pwovoke nan kout tèm (Figi 1E) ak analiz viabilite alontèm (Figi 1F). Rezilta sa yo montre ke TAX1BP1 pa jwe yon wòl esansyèl nan DC661-sitotoksisite medyatè. BNIP3 se yon pwoteyin proapoptotik ki afekte bioenèjik mitokondriyo ak kontwole mitofaji (13). Efektif kraze BNIP3 (Figi 1G) pa te afekte DC661-sitotoksisite (Figi 1, H, ak I). Rezilta sa yo te montre ke efè cytotoxik DC661 yo endepandan de ekspresyon BNIP3. Apre sa, nou etidye efè diminye selil jèn otofaji kanonik ki nesesè pou pwodiksyon otofagozom yo sou efikasite DC661 lè nou frape unc-51 tankou otofaji aktive kinaz 1 (ULK1) ak jèn ki gen rapò ak otofaji 7 (ATG7). Efektif kraze ULK1 oswa ATG7 (Figi Siplemantè 2, A ak B) anpeche flux otofajik (Figi Siplemantè 2C) men li pa afekte DC 661-sitotoksisite (Figi 1, J-M). Rezilta sa yo te montre ke absans machin otofaji debaz esansyèl la pa anile efè sitotoksik DC661. Anpèchman lizozomal pa DC661 pwovoke plizyè chemen lanmò selil pwograme. Pwen de vi kanonik la se ke lanmò selil lizozomal se akòz apoptoz (5). Immunoblotting te revele ke tretman DC661 te lakòz deklanchman kaspas -3, -7, ak -9 ak klivaj PARP-1, ki konfime ke DC661 aktive apoptoz (Figi 2A). Inibitè pan-caspase Z-VAD-FMK te anpeche deklanchman caspase pa DC661 men li pa t 'anpeche akimilasyon LC3B ak p62, ki demontre ke deklanchman apoptoz ak blokaj otofaji yo separe apre anpèchman lizozomal (Figi 2B). Bloke apoptoz ak ZVAD-FMK pa t 'amelyore oswa limite DC661 sitotoksisite, sijere ke apoptoz se dispansab pou lanmò selil lizozomal (Figi 2, C, ak D). Efè sitotoksik DC661 yo te menm jan an nan selil mwèl zo prensipal Bax/Bak doub-KO ki pa kapab sibi apoptoz ak selil WT (Figi 2E). Blokaj apoptoz pa t afekte DC661-sitotoksisite nan kansè nan kolon ak selil kansè nan pankreyas yo tou (Figi Siplemantè 2, D-F). Paske nou te jwenn ke apoptoz te dispansab pou lanmò selil DC661-pwovoke, nou te envestige si DC661 pwovoke necroptosis, yon lòt fòm lanmò selil pwograme ki reglemante pa reseptè kinaz pwoteyin kinaz (RIPK) ak pwoteyin kinase kinase ki sanble ak domèn melanje ( MLKL). Nivo fòm fosforile ak aktive RIPK ak MLKL yo te ogmante apre tretman DC661 soti nan 0.1-1 μM (Figi 2F). Nan 3 μM DC661 te gen yon absans fosforilasyon RIPK1 men ki pèsistan fosforilasyon MLKL, ki sijere ke, nan pi wo konsantrasyon sa a, lòt fòm lanmò selil yo ta ka angaje. Pretretman ak inibitè RIPK1 necrostatin-1 oswa necrostatin-1 oswa necrosulfonamide inibitè MLKL la anpeche fosforilasyon RIPK1 apre tretman DC661 (1 μM) nan selil melanom (Figi 2G), men li echwe pou pou sove DC{192. }} pwovoke sitotoksisite nan selil melanom (Figi 2H) oswa kansè nan kolon oswa selil kansè nan pankreyas (Figi Siplemantè 2G). Konklizyon sa yo sijere ke nekroptoz aktive men li pa dispansab pou lanmò selil DC661-medyatè.

Figi 1. Anpèchman otofaji lisosomal pwovoke chanjman enpòtan nan pwoteyin apoptoz ak otofaji. (A)

Lizozom yo se youn nan sit prensipal yo depo pou fè. Metabolis fè intraselilè disregulated makonnen ak diminye kapasite rediksyon ka deklanche yon lanmò selil nonapoptotic ke yo rekonèt kòm ferroptoz. Yon mak nan ferroptosis se upregulation nan prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), kation transpò regilatè homolog 1 (CHAC1), ak cysteinyl-tRNA sentetaz (CARS) (14). Tout 3 nan makè ferroptoz sa yo te transkripsyon upregulated pa tretman DC661 (Figi 3A), sijere ke anpèchman lizozomal pwovoke ferroptoz. DC661 pwovoke yon chanjman fliyoresans nan C11-BODIPY-trete selil A375P, ki endike peroksidasyon lipid, karakteristik ferroptoz. Chanjman DC661-pwovoke sa a te ranvèse siyifikativman an prezans inibitè ferroptoz ferrostatin-1 oswa roxstatin lèv-1 yo te administre nan yon konsantrasyon efikas (Figi 3B ak Figi Siplemantè 3A), ki endike plis DC661. ferroptoz pwovoke. Sepandan, anpèchman ferroptoz pa t 'sove cytotoxicity ki asosye ak DC661 (Figi 3, C ak D). Kotretman nan selil kansè yo ak fè chelator deferoxamine (DFO) ak DC661 pa t 'sove cytotoxicity DC661 (Figi 3E). Tretman ak ferrostatin-1, roxstatin lèv-1, oswa DFO pa t 'sekou DC661 anpèchman nan viabilite a kout tèm oswa kwasans alontèm klonojèn nan melanom, kolon, ak selil kansè nan pankreyas (Figi Siplemantè 3, B). –E, ak Figi Siplemantè 4, A–D). Done sa yo montre ke ferroptoz aktive men li dispansab pou lanmò selil DC661-medyatè. Yon piroptoz se yon fòm lanmò selil pwograme ki asosye ak yon repons enflamatwa ki enplike nan deklanchman kaspas ki trete gastrin (GSDM), ki pèmèt fòmasyon pò sou manbràn plasma a ak lage ki vin apre nan modèl molekilè ki asosye ak domaj, tankou gwo mobilite. bwat gwoup 1 (HMGB1). Tretman DC661 nan plizyè liy selil melanom (A375P, A375, WM35, ak WM793) te lakòz deklanchman kaspase inisyatè-8 ak -9 ak kaspase bouro-7, tipik pou piroptoz, ak pwodui klivaj nan GSDME plen longè, menm jan an nan limit ak li te ye pyroptosis inducer PLX4720 ak PD0325901 (Siplemantè Figi 5A). DC661 pwodui yon pi fò lage ekstraselilè nan HMGB1 pase pwodiktè piroptoz li te ye a, BRAF, ak anpèchman MEK nan 1% FBS (15), ki reflete konsekans fonksyonèl nan piroptoz aktive. Apre sa, nou teste si anpèchman piroptoz pa GSDME KO ta amelyore efè sitotoksik DC661. Tretman DC661 pwovoke akimilasyon LC3II ak SQSTM1/p62 ak aktivasyon caspase, men lage HMGB1 te prèske konplètman anile nan selil imen GSDME-KO WM35, ki demontre ke konsekans fonksyonèl nan anpeche piroptoz te reyalize (Figi 3F). Sepandan, DC661 tretman pwodui egal cytotoxicity nan YUMM1.7 WT, vektè vid (EV), ak selil Gsdme KO1 ak KO2 nan tou de 10% ak 1% kondisyon FBS (Figi 3G ak Figi Siplemantè 5B). Yon rezilta komen nan plizyè fòm lanmò selil se liberasyon LDH. DC661 te pwodwi yon ogmantasyon siyifikatif nan lage LDH, e sa pa t 'kapab ranvèse pa apoptoz, nekroptoz, oswa anpèchman ferroptoz (Figi Siplemantè 5C). Rezilta sa yo te montre ke DC661 pwovoke plizyè mòd nan lanmò selil, ki gen ladan apoptoz ak piroptoz osi byen ke nekroptoz ak ferroptoz, men pa youn nan mòd lanmò selil sa yo ki nesesè pou DC 661-pwovoke lanmò selil. Anpèchman Cathepsin oswa chelation kalsyòm pa anpeche lanmò selil nan pèmeabilizasyon manbràn lizozomal. Lè nou te demontre ke deklanchman kaspase (ki obligatwa pou apoptoz ak piroptoz) se dispansab pou lanmò selil DC661-pwovoke, nou te sipoze ke liberasyon kathepsin nan lizozom ka lakòz lanmò selil ki depann de kaspas. Chimik (DC661) oswa jenetik (PPT1 siRNA [siPPT1]) anpèchman nan PPT1 pwodui permeabilizasyon manbràn lizozomal (LMP), pandan y ap HDSF, yon inibitè irevokabl mwens pisan nan PPT1 ki vin apovri rapidman nan kilti selil, pa t 'kapab pwovoke LMP, jan yo mezire. pa galectin-3-positive puncta (Figi 4A). LMP rezilta nan liberasyon kathepsin ak lòt kontni lizozomal nan sitoplasm la epi yo panse yo dwe yon karakteristik proximal kle nan lanmò selil ki baze sou lizozom. LMP pwovoke pa DC661 te asosye ak yon ogmantasyon siyifikatif nan aktivite cytoplasmic cathepsin-L, ki te siyifikativman bloke ak yon inibitè proteaz cysteine ​​E64 (Figi 4B). Rapò anvan yo te sijere ke lage kathepsin soti nan lizozòm fraktire ankouraje deklanchman kaspase, ki mennen nan lanmò selil apoptotik (16-18). Anpèchman kathepsin konplè pa t anpeche klivaj caspase (Figi 4C) epi li pa t sove sitotoksisite DC661-pwovoke nan tès viabilite a kout tèm ak alontèm nan melanom (Figi 4, D ak E), kansè nan kolon, ak pankreyas. selil kansè yo (Figi Siplemantè 6, A–C). Rezilta sa yo kontrekare pwennvi kanonik lanmò selil lizozomal kòm lanmò selil katepsin-medyatè. Anplis lage kathepsin nan lizozòm ki gen fuit, lage kalsyòm nan lizozòm yo te enplike nan malfonksyònman selilè lè PPT1 gen pwoblèm (19). Tretman DC661 te lakòz anpil lage kalsyòm, ki te anile pa pretretman kalsyòm pèmanan selil (Ca2+), BAPTA-AM. (Figi 4F). Miyò, BAPTA-AM pa t anpeche DC661-pwovoke LMP (Figi 4G) oswa klivaj caspase (Siplemantè Figi 6, D, ak E) epi, sa ki pi enpòtan, pa t sove DC661-sitotoksisite ( Figi 4H). Yo te obsève rezilta sa yo tou nan tou de liy selil RKO ak MIA PaCa-2, kote pa gen okenn diferans enpòtan nan valè IC50 yo te obsève ak BAPTA-AM ak DC661 (Figi Siplemantè 6F), ki sijere ke lanmò selil ki asosye ak LMP se pa depann sou kalsyòm oswa kathepsin.

Figi 2. DC661-pwovoke apoptoz ak nekroptoz. (A)

Figi 3. DC661-pwovoke ferroptoz ak piroptoz. (A)

LLP kondwi LMP. Lè w te etabli ke inibitè gwo chemen lanmò selil yo (apoptoz, nekroptoz, ferroptoz, ak piroptoz), katepsin (PepA ak E64), ak chelators ion (BAPTA-AM [Ca2+] ak DFO [Fe{{3}). }]) pa t anpeche lanmò selil pa DC661 epi jwenn prèv peroksidasyon lipid pa C-11-BODIPY, nou te fè yon analiz lipidòm mondyal nan 2 ak 4 èdtan apre tretman DC661. DC661 pwovoke byen bonè ak soutni 3- nan 10-pliye ogmantasyon nan chak klas lizofosfolipid (Figi 5A). Kontrèman, yo te wè chanjman minim oswa pa gen okenn chanjman nan klas fosfolipid, ki gen ladan fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinositol, fosfatidilglisewòl, ak asid fosfatidik (figi siplemantè 7A). Espès Lysophospholipid yo ka pwodwi pa ROS, ki oksidasyon chèn satire asid gra ki lè sa a koupe pa fosfolipas (20). Pou detèmine si antioksidan ta ka anpeche domaj lipid ROS-medyatè, nou envestige DC661-sitotoksisite pwovoke nan prezans pan-ROS scavenger N-acetylcysteine ​​(NAC) (21, 22) ak inibitè peroksidasyon lipid putativ Trolox (23). ) ak vitamin C (asid ascorbic) (24, 25). Kontrèman ak nenpòt nan lòt ajan yo teste jiska prezan, kotreatman ak NAC te sove DC661-sitotoksisite ki asosye atravè plizyè liy selil (Figi 5B ak Figi Siplemantè 7B). Egzamen CFU alontèm yo te montre ke NAC, kontrèman ak tout inibitè lanmò selil yo, chelatè iyon yo, ak inibitè kathepsin yo teste isit la, anpeche efè sitotoksik DC661 nan A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10, ak MC38 selil yo ( Figi 5C ak Figi Siplemantè 7C). Enteresan, Trolox ak vitamin C pa t 'sove DC661 cytotoxicity nan melanom imen, kansè kolorektal, selil kansè pankreyas ak melanom murin ak selil kansè kolorektal (Figi 5D ak Figi siplemantè 7, D-H). Diferans sa a te pouse nou teste si NAC, Trolox, ak vitamin C afekte LMP. Rezilta nou yo te montre ke NAC se sèl antioksidan ki te redwi anpil LMP DC661-(Figi 5E). Nou te fè ipotèz ke LLP kondui pwodiksyon LMP pa DC661, ki ka ranvèse pa NAC men pa Trolox ak vitamin C. Pou etidye pwosesis LLP nou te itilize sond fliyoresan FOAM-LPO (26), ki espesyalman lokalize nan lizozom nan epi pwodui. yon chanjman espèk soti nan 586 a 512 nm (wouj a vèt) lè yo ekspoze a oksijene lipid. Nou te jwenn ke DC661 pwovoke LLP konpare ak kontwòl (Figi 5F). NAC te redwi peroksidasyon lipid nan lizozòm selil melanom ki te trete ak DC661-, pandan Trolox ak vitamin C pa t rive redwi LLP (Figi 5F). NAC, Trolox, ak vitamin C poukont yo pa te gen okenn efè enpòtan sou peroksidasyon lipid. Knockdown nan PPT1 (Figi Siplemantè 8A), oswa tretman ak gwo konsantrasyon nan HCQ (Figi Siplemantè 8B) tou pwovoke LMP ki ta ka ranvèse pa NAC, tandiske anpèchman chimik nan ULK1 pa t 'pwovoke LMP (Figi Siplemantè 8C). Sa ki enpòtan, kraze siPPT1 te gen ladan tou LLP ki ta ka ranvèse ak NAC (Figi Siplemantè 8D) Rezilta sa yo te montre ke anpèchman PPT1 pwovoke LLP ki ka sove pa NAC epi li gen anpil chans kòz PPT 1- LMP anpèchman pwovoke. Anplis de sa, rezilta sa yo sijere ke LLP se kritik pou lanmò selil lizozomal.

Chinwa zèb cistanche plant-Antitumor

Enpòte sistein nan lizozòm pa MFSD12 diminye lanmò selil lizozomal. Nan 3 inibitè peroksidasyon lipid yo, sèlman NAC anpeche LLP. Yon rapò resan te montre ke domèn nan superfamily pi gwo fasilitatè ki gen 12 (MFSD12) se yon eleman esansyèl nan importateur a sistein pou lizozòm ak melanosom (27). Nou te rezone ke NAC, oswa sistein metabolit li yo, transpòte nan lizozom nan atravè MFSD12, kote sistein vin soksid nan disulfide li yo, sistein. Pou teste ipotèz sa a, nou te konpare kapasite NAC pou l sove cytotoxisite DC661 nan selil siNT ak siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Rezilta nou yo te montre ke NAC te sove DC661-LMP pwovoke nan selil siNT men li pa t sove LMP nan selil siMFSD12 (Figi 6A). NAC te redwi LLP selil siNT-A375P ki te trete ak DC661-men pa selil siMFSD12 yo. Selil siMFSD12 trete ak DMSO oswa NAC te ogmante LLP fondamantal (Figi 6B) konpare ak selil siNT. Pandan ke NAC te sove DC661 cytotoxisite nan selil siNT, kapasite NAC pou sove DC661 cytotoxicity te konplètman anile nan selil siMSFD12 (Figi 6C). Sa a te montre ke knockdown MFSD12 bloke efè cytoprotective NAC kont DC661. NAC se deacetylated pa acilase nan sitosol la (28). Pou detèmine si tretman NAC pwodui yon akimilasyon sisten oswa sistin nan lizozòm, nou te itilize teknik iminoprezipitasyon lizozomal (Lyso-IP) (29) pou pirifye lizozom nan DMSO ak selil A375P trete NAC (Figi 6D ak Figi Siplemantè 9A) metabolomik vize pou quantifier NAC ak metabolit ki gen rapò. Kòm espere, yo te detekte NAC nan lisat selil antye trete ak NAC ak fraksyon ki asosye yo. Nivo L-cysteine ​​yo te ogmante anpil nan lizozòm NAC-trete. L-cystine te sèlman detektab nan lizozòm NAC-trete. Sezisman, nou pa t 'jwenn yon ogmantasyon siyifikatif nan glutatyon (redwi) nan gwoup NAC-trete yo (Figi 6E); sa a te etone paske yo souvan kwè ke tretman NAC pwovoke ogmante pwodiksyon glutatyon, korije balans redox. Rezilta sa yo sijere ke sistein enpòte nan lizozòm atravè enpòtatè MFSD12 a enpòtan anpil pou sove LLP, LMP, ak lanmò selil lizozomal. LLP se iminojenik. Gen kèk fòm lanmò selil reglemante pwovoke pa DC661 (pyroptosis, necroptosis, ferroptosis) yo te idantifye kòm iminojenik. Précédemment, yo te dekri lanmò selil imunojèn pou dwòg chimyoterapi ki baze sou karakteristik karakteristik, ki gen ladan ekspozisyon modèl molekilè domaj ki asosye, ki gen ladan ekspresyon sifas selil CALR ak liberasyon pwoteyin HMGB1 ak trifosfat adenozin (ATP) (30). CALR aji kòm yon siyal "manje-m" lè ekspoze a sifas selil yo pandan estrès selilè. Liberasyon ekstraselilè HMGB1 ak ATP aji kòm yon siyal "jwenn mwen" rekonèt pa selil fagositik yo. Nou konpare de modèl: selil B16F10, ki nan modèl timè syngeneic yo prèske nèt san lenfosit timè-enfiltre, ak selil MC38, ki nan modèl timè syngeneic gen timè lenfosit enfiltre. Premyèman, nou demontre ke tretman DC661 oswa siPpt1 siyifikativman pwovoke ekspresyon CALR sifas ki ka konplètman anile ak NAC cotreatment nan selil MC38 (Figi 7, A, ak B). Yo te obsève rezilta ki sanble nan selil B16F10 (Figi 7C). Inibitè gwo chemen lanmò selil yo (apoptoz, nekroptoz, ferroptoz, ak piroptoz) echwe pou pou anpeche ekspresyon sifas CALR (Figi 7D). Pou detèmine si lanmò selil imunojèn ki pwovoke pa DC661 se akòz regilasyon MHC klas I, selil B16F10 ak MC38 yo te trete ak DC661 (3 μM) oswa DMSO pou 24 èdtan. Nou te jwenn ke tretman DC661 pa t ogmante ekspresyon MHC klas I ak regilasyon imunoproteasome (Figi 7E ak Figi Siplemantè 9, B ak C).

Figi 4. Anpèchman Cathepsin oswa chelation kalsyòm pa anpeche DC661-pwovoke lanmò selil. (A)

Pou konprann efè yo nan anpèchman otofaji sou T selil priming, nou fè yon eksperyans in vitro priming ak kokilti lè l sèvi avèk C57BL6 / J splenosit jan yo dekri deja (31). Pou priming, nou ekspoze splenosit nan DC661- oswa selil B16F10 oswa MC38 trete DMSO. Apre sa, splenosit prime sa yo te kiltive ak selil B16F10 oswa MC38 vivan, epi yo te mezire sitotoksisite (Figi 8A). Splenosit ki te prime ak selil B16F10 trete DC661-pwodwi yon ogmantasyon siyifikatif nan IFN- konpare ak splenosit ekspoze a selil B16F10 trete DMSO. Tiye selil B16F10 ki pwopagann yo te ogmante anpil nan splenosit ki gen DC661-primed lè yo konpare ak splenosit DMSO yo (Figi 8, B ak C). Selil MC38 ki te trete ak DC661 yo te pwodwi menm plis IFN- ak premye cytotoxicity selil T lè yo konpare ak selil B16F10 (Figi 8, D, ak E). NAC cotreatment ak DC661 te kapab konplètman anile IFN- lage soti nan splenosit ak blunt primed T cell cytotoxicity (Figi 8, F, ak G). Knockdown nan calreticulin pa siCalr nan selil MC38 (Figi Siplemantè 9D) anile efikasite priming nan tretman DC661 ak siyifikativman redwi primed T-selil cytotoxicity (Figi 8, H, ak I). Ansanm, done sa yo sipòte yon wòl mekanistik nan LLP-asosye CALR upregulation nan fè pwomosyon selil antitumoral selil T iminite. Apre sa, nou te elaji rezilta in vitro sa yo nan yon etid in vivo vaksinasyon antitumoral nan modèl sourit imunokonpetan ak iminodefisyan. Pou tès sa a, yo te enjekte selil B16F10 oswa MC38 in vitro friz-degel oswa DC661-trete yo sou flan gòch la pou pwoteje sourit iminokonpetan C57BL/6 oswa NOD/SCID kont rechallenge ak selil timè vivan nan menm kalite a. 7 jou apre nan bò dwat la (Figi 9A). Selil B16F10 ki te trete DC661-echwe pou pou anpeche rejè timè malgre tès an vitro, ki sijere ke DC661 pwovoke lanmò selil iminojenik (Figi 9B ak Figi Siplemantè 9E). Kontrèman, vaksinasyon yon sèl flan ak selil MC38 trete DC 661- te ankouraje rejè konplè selil MC38 vivan ki te implanté sou flan opoze a (Figi 9C ak Figi Siplemantè 9F). Pou detèmine si iminite adaptasyon te kritik pou efè vaksen DC661 te sanble ak timè MC38, nou te repete eksperyans nan sourit NOD/SCID. Sezisman, nou te jwenn ke selil MC38 DC661-trete yo pa t 'pwovoke rejè timè rechallenge nan sourit NOD/SCID iminodefisyan (Figi 9D ak Figi Siplemantè 9G), ki endike ke iminite adaptasyon te obligatwa pou efè vaksen an obsève. Pou teste solidite rezilta sa a, nou te chwazi yon lòt liy selil kansè sourit imunojèn ki byen koni, CT26, epi nou te fè eksperyans vaksinasyon an jan pi wo a. Kòm espere, enplantasyon selil CT26 ki te trete ak DC661-nan yon sèl flan sourit la te pwodui yon efè ki sanble ak vaksen epi li te anpeche selil CT26 vivan yo te implante sou lòt flan an (Figi 9E ak Figi Siplemantè 9H). Konklizyon nou yo sijere ke DC661-pwovoke LLP enpòtan anpil pou lanmò selil imunojèn ki gen mwayen LMP, ki ranvèse pa enpòte sistein nan lizozom pa transpòtè lizozomal MFSD12 (Figi 9F).

Diskisyon

Anpèchman lisosomal parèt yon apwòch terapetik pwomèt nan etid preklinik, ak esè klinik HCQ yo te pwodwi rezilta ankourajan men melanje (1, 32). PPT1 se sib molekilè HCQ, ak pisan PPT1 inhibiteurs, tankou DC661 (2) ak GNS561 (3), pwovoke lanmò selil LMP-medyatè nan vitro. Mekanis egzak lanmò selil lizozomal ak wòl li nan iminojenisite timè pa te konplètman elisid. Iminite antitumoral amelyore lè anpèchman otofaji konbine avèk imunoterapi (9, 10, 31). Mekanis yo pwopoze pou iminojenisite selil-intrinsèk apre anpèchman otofaji gen ladan MHC klas I ak regilasyon imunoproteasome, ki tou de sipòte amelyore pwosesis antijèn ak prezantasyon. Anplis de sa, pèt pwoteyin otofaji oswa anpèchman otofaji pa chloroquine ogmante repons selil T CD8+ lè yo ogmante nivo sifas MHC klas I nan selil dendritik (33). Nou te deja montre ke anpèchman PPT1 sistemik ka repolarize macrophages soti nan yon fenotip M2 rive M1. Inibitè PPT1 ka amelyore nivo STING, ki mennen nan lage IFN ak ogmantasyon nan touye selil T medyatè nan modèl melanom (31). Isit la, nou demontre ke LLP tèt li pwodui yon selil timè-fòm imunojèn nan lanmò selil. Nou te jwenn ke anpèchman lizozomal pwovoke trè kèk chanjman pwoteyin nan selil kansè yo, ak pwoteyin ki pi siyifikativman elve enkli reseptè kago otofaji ak regilatè apoptoz. Apwòch nou an ki vize kèk nan jèn sa yo atravè fonksyon yo te demontre ke pwoteyin dwòg yo pa t gen anpil chans regilatè prensipal lanmò selil yo. Anpèchman jenetik nan ULK1 oswa ATG7 tou pa t 'sove DC661 cytotoxicity. Nou demontre ke anpèchman lizozomal aktive plizyè fòm lanmò selil pwograme, ki gen ladan apoptoz, nekroptoz, ferroptoz, ak piroptoz, men chak nan sa yo te dispansab pou sitotoksisite dwòg-induit. Nan nòt, mekanis lanmò selil pwograme ka sipèpoze ak cotargeting nan mekanis lanmò selil miltip ka bay cytoprotection kont lanmò selil apre pèmeabilizasyon manbràn lizozomal. Travay nou an te elimine mekanis kathepsin-ak kalsyòm-depandan pou lanmò selil lizozomal epi mete aksan sou enpòtans LLP kòm detèminan kritik lanmò selil. Nou te jwenn prèv LLP ki te revèsib pa yon antioksidan ki te transpòte nan lizozom nan, NAC e li te kritik pou pèmeabilizasyon manbràn lizozomal ak sitotoksisite. NAC te sèl ajan ki te kapab bese oswa ranvèse DC661-pwovoke lanmò selil, epi kapasite sa a te depann de prezans transpòtè sistein lizozomal MFSD12 la. Yon mank de pénétration lisosomal gen anpil chans poukisa lòt inibitè peroksidasyon lipid potatif, Trolox ak vitamin C, yo pa t 'kapab anpeche DC661 cytotoxicity. NAC konvèti nan sistein, ki se enpòte nan lizozòm yo ak oksidasyon nan fòm disulfide li yo, sistin. Cystine ekspòte nan cytosol pa yon lòt transpòtè lizozomal, cystinosis, kote li redwi a cysteine ​​ki remobilize sous eleman nitritif entèn yo, reaktive sib la nan konplèks rapamicin 1, ak ankouraje otofaji (34). Siklis oksidasyon-rediksyon sa a nan sistenin nan sistin (lizozom) ak tounen nan sistein (sitosol) ta ka yon mekanis sekou posib nan NAC kont sitotoksisite DC661 oswa plis jeneral aksidan lizozomal nan lòt kontèks maladi kote NAC te pwouve yo dwe itil terapetik (35) . NAC pa sèlman ranvèse DC661-pwovoke LLP ak LMP, men tou yon ekspresyon sifas nan makè lanmò selil iminojenik calreticulin la. Ekspresyon sifas selil yo nan pwoteyin CALR yo te obligatwa pou sitotoksisite ranfòse selil T ki te pwovoke pa splenosit DC661-prime, ki demontre ke anpèchman lizozomal pwodui yon fòm espesifik nan iminojenisite selil-intrinsèk.

Pandan ke etid anvan yo te demontre ke anpèchman lizozomal ka amelyore aktivite antitumoral nan anpèchman iminitè pòs nan timè flan etabli (9, 31), etid nou an se premye moun ki konnen nou yo demontre yon efè vaksen ki tankou pou timè MC38 men pa timè B16 nan selil timè yo pretrete ak DC661 anvan enplantasyon. Sa a demontre ke lanmò selil lizozomal ka pwovoke iminojenisite selil-intrinsèk, men chanjman sa yo poukont yo pa gen anpil chans pou ranvèse yon microenvironment timè "iminitè frèt" nan yon mikroenvironment timè "iminitè cho". Etid anvan nou yo nan "iminitè frèt" timè mikwo-anviwònman modèl B16 ak BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 jenetikman enjenyè modèl sourit (31) te demontre ke anpèchman lizozomal sistemik pwodui efè sou makrofaj ki asosye ak timè yo ak selil myeloid ki soti nan selil suppressor ki te ase pou amelyore. efikasite nan imunoterapi. Li kapab ke iminojenisite selil-intrinsèk tou jwe yon wòl nan timè frèt iminitè sa yo ki vin pi reponn a ICD apre anpèchman lizozomal. Efè ki sanble ak vaksen anpèchman lizozomal yo obsève nan yon anviwònman laboratwa kontwole ka oswa pa ka tradwi nan klinik la, men li ka eksplike poukisa kèk pasyan ki te trete ak dabrafenib, trametinib, ak HCQ nan melanom mutan BRAF te trete deja te gen yon gwo twou san fon ak dirab. repons rejim sa a (32). Plis etid nesesè pou konprann ki jan anpèchman PPT1 pwodui ROS lizozomal ak peroksidasyon lipid. Règleman PPT1-depandan V-ATPase a ak asidifikasyon lizozomal se pa yon eksplikasyon ase paske bafilomicin inibit asidifikasyon lizozomal men li pa pwodui LMP (done yo pa montre). Enplikasyon rezilta sa yo sijere ke inibitè lizozomal ki amelyore iminojenisite selil timè-intrinsèk yo ka konbine rasyonèlman ak terapi ki amelyore aktivasyon selil T, oswa enfiltrasyon nan mikroanvironman timè a, ki kapab bay efè sinèrjik.

Figi 5. N-asetil sistein anpeche DC661-pwovoke lanmò selil. (A)

Metòd

Kilti selilè. Imèn A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL{- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185), ak sourit B16F10 (CRL-6475) yo te achte nan ATCC. Moun A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793, ak sourit YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, ak Gsdme KO1 ak KO2) yo te jwenn nan kay la. Sourit MC38 ak CT26 selil yo te bay pa Andy Minn, University of Pennsylvania. FL5.12 ak IL-3-depandan Bax-/-Bak-/- (Bax/Bak DKO) selil mwèl zo prensipal yo te jwenn nan Kathryn E. Wellen, University of Pennsylvania. Ben Z. Stanger, University of Pennsylvania, te bay liy selil Panc-1 imen an (CRL-1469, ATCC). Liy selilè sourit YUMMER 1.7 la te jwenn nan Xiaowei (George) Xu, University of Pennsylvania. Tout liy selilè yo te teste pou Mycoplasma chak ane pa University of Pennsylvania Core enstalasyon yo epi otantifye lè l sèvi avèk kout-tandem repete anprent pa Wistar Institute Genomics core. A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12, ak liy selil Bax/Bak DKO yo te kiltive nan RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10, ak liy selil MC38 yo te kiltive nan DMEM (Invitrogen, 11995); ak selil YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV, ak Gsdme KO1 ak KO2) (15) yo te kiltive nan DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Medya kilti yo te complétée ak 10% serom fetal bovine (12306C, MilliporeSigma) ak 1 × solisyon antimycotic antibyotik (Gibco, 15140-122). FL5.12 ak liy selil Bax/Bak DKO yo te konsève nan medya RPMI konplè ki konplete ak 50 μM -mercaptoethanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma), ak 0.35 ng/mL ak 3.5 ng. /mL IL-3, respektivman. YUMMER1.7 ak YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, ak Gsdme KO) liy selil yo te konsève nan medya konplè konplete ak 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Selil WM35 ak WM793 yo te kiltive nan medya MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), ki gen 10% FBS nan 1 × Leibovitz L-15 mwayen (Corning, 10-045-CV), 7.5% w / v bikabonat sodyòm ( Corning, 25-035-CI), 1 × solisyon antibyotik antimikotik (Gibco, 15140-122), ak 5 ug/mL ensilin (MilliporeSigma, I0516). Selil yo te grandi nan 37 degre nan prezans 5% CO2. Pwodwi chimik ak reyaktif. Pwodwi chimik yo achte enkli HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) ak DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) te itilize pou tache selil yo pou kalsyòm dapre enstriksyon manifakti a. Yo bay yon lis antikò ak inibitè nan Tablo Siplemantè 1 ak Tablo Siplemantè 2.

Figi 6. NAC ranvèse LLP nan yon fason ki depann de MFSD12-. (A–C)

Pwoteyin ekstraksyon ak dijesyon pou likid chromatografi-tandem mas spectrometri analiz pou proteomik. {{0}}.7 × 106 selil melanom A375P yo te kiltive nan asyèt kilti 6{0 mm. Selil yo te trete ak DMSO (kontwòl), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM), oswa HCQ (3{{70}} μM) pou 24 èdtan nan apeprè 5{{ 112}}% konfluans. Granules selil jele yo te lysed ak 50 mM Tris pH 7.4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatin, ak 1 ug/mL leupeptin. Lisat klarifye (10 ug chak) yo te electrophoresed 0.5 cm nan yon jèl bis-tris ki te swiv pa fikse ak tach ak koloidal Coomassie. Chak liy jèl 0.5 cm yo te retire, detache, redwi ak tris (2-carboxyethyl) fosfin, alkylated ak iodoacetamide, ak dijere ak tripsin jan sa dekri deja (36). Dijere (1 ug) yo te analize pa likid chromatografi-tandem mas spèktrometri (LC-MS/MS) sou yon Q-Exactive Plus mas spectrometer (Thermo Fisher Scientific) nan liy ak yon nanoAQUITY UPLC (Waters). Separasyon analitik te fèt sou yon kolòn 1.7 μm × 250 mm Peptide BEH C18 (Waters, 186003546) lè l sèvi avèk yon gradyan 245-minit ak 0.1% asid fòmik nan dlo (mobil faz A) ak asetonitrile (mobil faz B) jan sa a. : 5%–30% B sou 225 minit, 30%–80% B sou 5 minit, 15-minit kenbe nan 80% B, epi retounen nan kondisyon inisyal yo. Tout spectre MS yo te akeri nan rezolisyon 70,000, ak yon seri eskanè 400-2,000 m/z, yon sib kontwòl otomatik pwogrè nan 3 × 106 iyon, ak yon tan maksimòm piki nan 50 milisgond. Done-depandan MS2 spectre yo te akeri pou tèt 20 iyon ki pi abondan nan rezolisyon 17,500, ak yon lajè izolasyon 1.5 m / z, sib otomatik kontwòl genyen nan 5 × 104 iyon, ak tan piki maksimòm de 50 milisgond. Match peptide yo te mete nan pi pito, epi yo te rejte iyon ki pa asiyen ak yon sèl chaje (37). Done MS kri yo te analize lè l sèvi avèk MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) ak yon baz done sekans imen Uniprot (aksè sou 10 oktòb 2019) ak yon baz done kontaminan komen, ki gen ladan tripsin, keratin, pwoteyin bovine, ak mycoplasma (38). Tryptic peptide espesifik ak yon maksimòm de 2 klivaj rate, modifikasyon fiks sou sistein (carbamidomethylation), ak varyab oksidasyon methionine oswa N-tèminal asetilasyon yo te itilize nan rechèch la (39). Yo te itilize yon koupe 1% FDR pou peptides ak pwoteyin. Match ant kouri yo te pèmèt; pwoteyin yo te quantifye lè l sèvi avèk kantite etikèt-gratis (40). Analiz estatistik te fèt lè l sèvi avèk Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42). Pwoteyin yo te oblije idantifye pa omwen 3 peptides inik epi yo gen 3 valè valab (ki pa zewo kantite) nan yon gwoup echantiyon, ak kontaminan ak pwoteyin ranvèse yo te filtre nan seri done a. Valè ki manke yo te imputer nan yon distribisyon nòmal. Yo te fè konparezon pa pè ant kondisyon yo nan nivo pwoteyin lè l sèvi avèk yon 2-tès t Student a ke ak FDR ki baze sou pèmitasyon ak randomizasyon s0=0.1 ak 250. Chanjman enpòtan yo te defini kòm FDR ki mwens pase 5% ak yon chanjman pli absoli ki pi gran pase 1.5 oswa 2.0, jan sa espesifye. Lyso-IP. Selil A375P yo te enfekte ak pLJC5-Tmem{192-3xHA lentivirus epi yo te chwazi yo lè l sèvi avèk 1 mg/mL puromicin (MilliporeSigma, P4512). Apeprè 3 × 106 selil A375P ki make HA yo te trete ak swa 10 mM NAC oswa kontwòl machin dlo pou 24 èdtan nan kondisyon kilti yo dekri deja. Apre tretman an, selil yo te lave nan PBS, rekòlte nan 0.5 mL KPBS frèt, epi dousman omojeneize lè l sèvi avèk 20 kou nan yon omojèn Dounce 2 mL. Apeprè 2.5% omojene a te rezève pou analiz lysate selil antye, epi rès la te santrifuje nan 3,000g pou 2 minit nan 4 degre pou retire debri manbràn selilè. Lè sa a, sipènatant omojèn te transfere nan yon tib pwòp 1.5 mL epi enkube ak 50 μL pèl anti-HA (Pierce, 88836) oswa pèl anti-DDK/Flag (OriGene, TA150042) pou 15 minit nan 4 degre. Lè sa a, echantiyon yo te presipite lè yo mete tib sou DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) epi balanse dousman pou 2 minit nan tanperati chanm. Sipènatant la te rezève pou analiz fraksyon non. IP te lave 3 fwa ak KPBS ki gen 8 mM CaCl2. Lyso-IP la te ekstrè nan 80% MeOH pou analiz metabolomik. Ekstraksyon lipid ak analiz lè l sèvi avèk LC-MS / MS pou lipidòm mondyal. Melanoma A375P selil yo te simen nan asyèt 60 mm nan 0.7 × 106 selil pou chak plat. Lè selil yo te nan apeprè 50% konfluans, yo te trete ak DMSO (kontwòl), DC661 (3 μM), oswa HCQ (30 μM) pou 24 èdtan. Selil yo te lave 2 fwa ak HBSS, grate nan metanol glas frèt, epi transfere nan tib an vè pou fè ekstraksyon lipid ak klowofòm / metanol / 0.88% NaCl (2:1:1) ki gen yon estanda lipid entèn EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Echantiyon yo te vortexed ak Lè sa a, beny dlo sonike pou 5 minit sou glas. Apre santrifujasyon nan 500g pou 15 minit nan 40 degre, faz ki pi ba a te transfere nan yon lòt tib an vè. Faz anwo a te retire lè l sèvi avèk yon faz pi ba sentetik. Apre sonication ak santrifujasyon, faz ki pi ba a te konbine avèk premye koleksyon faz ki pi ba yo. Echantiyon yo te cheche anba nitwojèn, resuspend nan 10% klowofòm / 90% metanol, epi transfere nan flakon LTQ vè. Echantiyon lipid yo te analize sou yon espektromèt mas Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X ak sistèm Vanquish Horizon UHPLC. Separasyon analitik la te itilize yon kolòn Accucore C30 (2.1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) ak 50:50 acetonitrile/dlo ak 88:10:2 isopropanol/acetonitrile/dlo, chak ki gen 5 mM fòma amonyòm ak 0.1% asid fòmik. Done LC-MS/MS yo te akeri separeman nan polarite pozitif ak negatif ak paramèt enstriman sa yo: MS1 eskanè 120, 000 rezolisyon; MS2 ki depann de done sou 20 iyon ki pi abondan nan 15,000 rezolisyon; 0.4 m / z izolasyon lajè; ak yon etap nòmal enèji kolizyon nan 20:30:40 (43).

Figi 7. N-acetyl cysteine ​​anpeche DC661-ekspresyon sifas calreticulin pwovoke. (A–D)

Lipid yo te idantifye ak kantite lè l sèvi avèk LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Espès lipid idantifye yo te filtre pa aduk yo te espere ak klas idantifikasyon ki baze sou klas la. Zòn pik yo te nòmalize nan estanda EquiSPLASH yo pou klas ki sipòte yo epi yo te nòmalize plis dapre zòn total pou chak echantiyon pou korije varyasyon nan nimewo selil yo. Analiz estatistik yo te fèt sou done ki te transfòme lè l sèvi avèk Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Ekstraksyon metabolit ak analiz lè l sèvi avèk LC-MS / MS pou metabalon. Metabolit polè yo te ekstrè nan selil antye, fraksyon Lyso-IP ki pa lye, ak echantiyon Lyso-IP ki te mare lè l sèvi avèk 80% metanol epi yo te estoke nan -8{{30}} degre anvan chromatografi likid. – analiz espektrometri mas (LC-MS). Ekstrè yo te analize pa LC-MS lè l sèvi avèk yon espektwomèt mas Thermo Scientific Q-Exactive HF-X ak yon pwofonde HESI II nan liy ak yon sistèm Thermo Vanquish Horizon UHPLC. Separasyon LC te fèt lè l sèvi avèk yon kolòn ZIC-HILIC (2.1 mm × 150 mm, 5 μm gwosè patikil, EMD Millipore) ak yon kolòn gad ZIC-HILIC (2.1 mm × 20 mm, EMD Millipore) ki te fèt nan 45 degre ak yon pousantaj koule. nan 0.2 mL / min. Chromatografi yo te fèt nan kondisyon asid pou diminye reyaksyon gwoup thiol yo. Faz mobil A te dlo ak B te asetonitrile, tou de ki gen 0.1% asid fòmik. Gradyan LC a te 85% B pou 2 minit, 85% B a 20% B sou 15 minit, 20% B a 85% B sou 0.1 minit, ak 85% B pou 8.9 minit. Autosampler la te fèt nan 4 degre, epi yo te enjekte 4 μL nan chak echantiyon pou chak analiz. Yo te itilize paramèt MS sa yo: to koule gaz djenn, 40 AU; to koule gaz oksilyè, 10 AU; vitès koule gaz bale, 2 AU; tanperati aparèy chofaj gaz oksilyè, 350 degre; vòltaj espre, 3.75 kV pou mòd pozitif ak 3.5 kV pou mòd negatif; tanperati kapilè, 375 degre; ak nivo RF antonwa, 40%. Tout echantiyon yo te analize pa plen MS ak switch polarite. Yo te akeri analiz konplè MS soti nan 65 a 975 m/z nan 120,000 rezolisyon ak yon sib kontwòl otomatik pwogrè nan 1 × 106 iyon ak yon tan maksimòm piki nan 100 milisgond. Done kri yo te analize lè l sèvi avèk TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Metabolit vize yo te idantifye pa mas egzat ak tan retansyon nan polarite pi pito yo ki baze sou estanda analyse. Deteksyon pik te itilize algorithm ICIS la ak yon atenuasyon 1. Quantification relatif te fèt lè l sèvi avèk yon zòn pik entegre, ak valè sa yo te korije nan kantite total pou chak echantiyon (defini kòm zòn nan pik total). PPT1-CRISPR/Cas9 koreksyon. A375P PPT1-ki pa sib ak selil KO yo te prepare jan sa te dekri deja (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) se te yon kado Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139). Gid RNA oligos (IDT) yo te rkwit, fosforilate, ak Lè sa a, ligated nan plasmid pX459 BbsI dijere ak dephosphorilate swiv pwotokòl laboratwa Zhang, ki disponib atravè Addgene. Plasmid ligated yo te transfòme nan selil Stbl3 (Invitrogen). Sekans nan preparasyon plasmid konfime prezans nan sekans RNA gid yo vle. Selil A375P yo te transfekte lè l sèvi avèk Lipofectamine 3 000 (Invitrogen, L3000015), ki te swiv pa seleksyon puromicin. Test Surveyor konfime koreksyon jèn PPT1 pa CRISPR/Cas9, e PPT1 knockdown te konfime pa Western blotting ak antikò PPT1 (Origene). Sekans pou gid RNA oligos yo jan sa a: nontarget gid RNA pi devan (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), nontarget gid RNA ranvèse (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), moun PPT1 gid RNA 1 pi devan (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), moun PPT1 gid RNA 1 ranvèse), moun PPT1 gid RNA 1 ranvèse, moun pi devan (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), ak moun PPT1 gid RNA 3 ranvèse (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Klon yo grandi nan selil sèl yo itilize nan papye sa a gen ladan sa ki annapre yo: klonaj C8 se gid imen 1 ak klonaj B5 se gid imen 3. Immunoblotting. Yon milyon selil yo te plake nan yon plat 10 cm, ak tretman yo te bay jou kap vini an; selil yo te kolekte pa grate. Lysates tout selil yo te prepare lè l sèvi avèk tanpon liz SDS. Konsantrasyon pwoteyin yo te mezire lè l sèvi avèk yon Twous Test Pwoteyin Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30-50 ug pwoteyin yo te itilize pou SDS-PAGE epi yo te transfere sou yon manbràn PVDF (Bio-Rad, 1620177). Manbràn an te bloke lè l sèvi avèk 5% BSA oswa 5% lèt ekreme, dapre kondisyon optimize, epi enkube ak antikò prensipal lannwit lan nan 4 degre. Manbràn PVDF yo te lave ak 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) epi yo te enkube pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak antikò segondè konjige HRP-espès espesifik. Apre sa, yo te lave manbràn yo epi devlope yo lè l sèvi avèk substra Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) ak fim otoradiografi (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Pou etid pyroptosis, lysates pwoteyin yo te separe pa SDS-PAGE ak transfere nan manbràn PVDF. Apre bloke nan 5% BSA, manbràn PVDF yo te enkube ak antikò prensipal yo endike lannwit lan nan 4 degre, lave nan PBS/Tween, epi yo te enkube ak peroksidaz-kouple antikò segondè. Iminoreaktivite te detekte lè l sèvi avèk HRP-konjige antikò segondè (CalBioTech), yon substra chemiluminescence (Thermo Fisher Scientific), ak yon sistèm D ChemicDoc MP (Bio-Rad). Pou eksperyans ki enplike supernatant, selil yo te kiltive nan yon mwayen FBS-gratis pou evite distòsyon nan SDS-PAGE. Supernatant selil yo te rekòlte ak santrifuje pou 10 minit nan 500g nan 4 degre yo retire debri selil yo. Supernatant yo te konsantre 10 × lè l sèvi avèk Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) pa santrifujasyon pou 30 minit nan 4,500g nan 4 degre. Konsantre yo te melanje ak echantiyon tanpon ak analize atravè Western blotting jan sa dekri pi wo a. Yo te fè tach jèl pwoteyin lè l sèvi avèk tach wouj Ponceau. LMP ak tès aktivite cathepsin L. Plasmid pEGFP-hGal3 imen se te yon kado Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmid, 73080) e li te itilize pou kreye liy A375P-Galectin-3. Yo te achte zo rèl do vektè plasmid kontwòl pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Plasmid yo te transfekte (1 ug/mL) nan selil A375P lè l sèvi avèk Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) dapre pwotokòl manifakti a; selil transfekte yo te chwazi stab lè l sèvi avèk G418 (Gibco, 10131035). Pou LMP, yo te konte yon total de 25 A375P-galectin-3 selil pwen-pozitif nan plizyè jaden imaj. Pousantaj selil pwen-pozitif yo te kalkile nan chak jaden separeman, epi yo te kalkile yon pousantaj mwayèn pou chak gwoup. Twous tès Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) te itilize dapre pwotokòl manifakti a. Selil yo te imajine anba yon mikwoskòp envèse Zeiss Axio Observer 7. Magic Red kri entegre entansite te kalkile lè l sèvi avèk Fiji - ImageJ lojisyèl (NIH). MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromur) tès viabilite selil. 2,000 selil yo te plake an triple nan chak pi nan yon plak 96-byen, ak 3-test MTT jou yo te fè lè l sèvi avèk Twous viabilite selil (Roche, 11465007001) dapre pwotokòl manifakti a. Yo te bay pretretman inibitè pou 1 èdtan, ki te swiv pa cotreatment nan selil yo ak inibitè avèk oswa san DC661. Yo te itilize metòd regresyon ki pa lineyè (anfòm koub) pou kalkile IC50.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Esè fòmasyon koloni. 2,000 selil pou chak pui yo te simen nan yon plak 6-pou yo epi yo te trete nan demen; selil yo te kenbe anba tretman an pou yon total de 8 jou. Koloni ki te fòme nan chak pi yo te lave ak PBS, fikse ak metanol frèt nan -20 degre pou 20 minit, epi tache ak Crystal violet 0.5% solisyon akeuz (V5265; MilliporeSigma).

Trypan ble koloran esklizyon tès. Yo te prepare melanj reyaksyon pou tès Trypan ble lè w melanje 1 pati 0.4% Trypan ble (25- 900-CI, Corning) ak 1 pati echantiyon selil ki dilye. Yo te enkube melanj lan pou 1 minit, epi yo te konte selil yo sou Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Figi 8. DC661-ekspresyon sifas calreticulin pwovoke prime selil T yo kont selil timè yo. (A)

Figi 9. Vaksinasyon selil DC661-trete yo pwodui rejè timè nan yon kontèks espesifik. (A)

FOAM-LPO. LLP te etidye lè l sèvi avèk yon sond fliyoresan, FOAMLPO. FOAM-LPO te sentèz jan yo dekri deja (26). Selil yo te kiltive sou yon 8 Well μSlide (ibid, 80807) epi yo te trete ak inibitè ak avèk oswa san DC661. Selil yo te enkube ak medya ki gen FOAM-LPO (1 M) nan yon atmosfè 5% CO2 ak 95% lè pou 5 minit nan 37 degre. Selil yo te lave de fwa ak medya, ak Lè sa a, selil yo te obsève anba mikwoskòp la (Zeiss Axio Observer 7 mikwoskòp envèse) pou detekte fliyoresans deplase soti nan 586 a 512 nm an repons a LLP. qRT-PCR ak primè. Selil A375P (3 × 105) yo te kiltive nan asyèt 60 mm epi yo te trete ak DMSO oswa DC661 (3 μM) pou 24 èdtan. Yo te izole RNA total ak yon twous izolasyon RNA (QIAGEN, 74134) dapre pwotokòl manifakti a. cDNA te sentèz lè l sèvi avèk yon twous iScript Reverse Transcriptase ak 500 ng RNA pirifye dapre pwotokòl manifakti a (Thermo Scientific, K1642). Reyaksyon qPCR la te mete kanpe lè l sèvi avèk SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) ki gen 1 μL cDNA. Tout mezi yo te fèt an triple, epi yo te itilize BACTIN kòm yon estanda entèn pou kalkil ΔCT. Analiz ekspresyon jèn yo te fè lè l sèvi avèk primè sa yo: PTGS2/COX-2 pi devan (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 ranvèse (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS pou pi devan (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS ranvèse (GACCAGTGATGTCAACAG), CHAKAGGCATGTCAACAG. (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 ranvèse (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN devan (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT), ak BACTIN ranvèse (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

transfeksyon siRNA. Etid jenetik knockdown pou moun ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1, ak MFSD12 yo te fèt nan liy selil A375P. Etid anpèchman jenetik pou sourit Ppt1 ak Calreticulin yo te fèt nan selil MC38. Non target siRNA (sc{{10}}), imen ULK1 (sc{-44182), ATG7 (sc{-41447), TAX1BP1/T6BP (sc{-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc{-97888), sourit Ppt1/Cln1 (sc-142398) ak Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNA yo te achte nan men Santa Cruz Biotechnology. SiRNA sa yo konpoze de pisin ki gen 3-5 siRNA sib espesifik. Sitometri koule. Endiksyon Ferroptoz te mezire lè l sèvi avèk C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Selil A375P yo te simen nan yon plak 6-byen epi yo te trete ak DMSO, ferrostatin{{40}} (10 μM), roxstatin lèv-1 (2 μM), elastin (5 μM). ), DC661 (3 μM), oswa yon konbinezon pou 24 èdtan. Selil yo te rekòlte pa santrifuje nan 300 g pou 5 minit. Selil yo te resuspend nan 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) ki gen 1 μM C{11-BODIPY ak enkubasyon nan 37 degre pou 15 minit. Selil yo te granules ak resuspend nan 500 μL 1X HBSS, epi yo te mezire entansite fliyoresans sou yon sitomèt BD LSRII lè l sèvi avèk 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Kantite ekspresyon sifas selil calreticulin pou lanmò selil imunojèn te fèt jan sa te dekri deja (45) pa sikometri koule. Selil B16F10 oswa MC38 yo te kiltive ak trete ak NAC (10 mM) oswa DC661 (3 μM) pou 24 èdtan. Selil MC38 yo te trete ak siPpt1 oswa siNT pou 48 èdtan nan prezans oswa absans 10 mM NAC pou 24 èdtan. Selil yo te tache ak antikò CALR (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 kabrit anti-lapen dezyèm antikò (Invitrogen), ak propidium yodide (PI) (Biolegend, 421301). Echantiyon tache yo te akeri sou yon sitomèt koule BD LSRII lè l sèvi avèk 710/50 Blue ak 670/30 Wouj pou pran PI ak CALR fliyoresans, respektivman (University of Pennsylvania Flow Core etablisman), epi analiz yo te limite a CALR-pozitif ak PI-negatif selil. pou evite evènman fo pozitif. Priming selil T ak pousantaj sitotoksisite. Selil timè B16 oswa MC38 (5 × 104) yo te kiltive ak trete ak NAC (10 mM) oswa DC661 (1 μM oswa 3 μM), respektivman pou 24 èdtan. Pou anpèchman jenetik Calr, selil MC38 yo te trete ak Calr siRNA oswa nontarget siRNA (siNT) pou 48 èdtan, ki te swiv pa tretman ak swa DMSO oswa 3 μM DC661 pou 24 èdtan. Apre sa, yo te kiltive splenosit ak DC661 avèk oswa san selil B16 oswa MC38 nan prezans IL-2 (5 IU/mL) epi yo te kiltive ansanm pou 72 èdtan. Priming te konfime pa IFN-ELISA (Biolegend, 430815) nan supernatant la. Lè sa a, primed splenosit yo te kocultured ak frèch kiltive selil B16 oswa MC38 ak sib-a-efektè (B16 oswa MC38 nan splenosit) rapò nan 1:20 ak 1:50 pou selil B16 ak MC38, respektivman. B16 oswa MC38 selil lanmò-asosye LDH lage ak Lè sa a, pousantaj sitotoksisite te mezire dapre pwotokòl manifakti a (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Egzamen vaksinasyon antitumoral ak etid chimyoterapi ak modèl kansè etabli. Sourit WT C57BL/6 fi sis a uit semèn, NOD/SCID, ak BALB/c sourit yo te jwenn nan laboratwa Jackson. Pou eksperyans vaksinasyon antitumoral, selil WT B16F10, MC38, ak CT26 yo te trete ak DC661 (3 μM) pou 36 èdtan nan flakon 175 cm2. Lè sa a, supernatant ak selil detache yo te kolekte nan yon tib Falcon 50 mL. Selil yo te santrifuje epi lave ak PBS glas frèt. Pou pran vaksen an, yo te enjekte 150 μL sispansyon selilè sc nan bò gòch sourit C57BL / 6 imunokonpetan, sourit iminodefisyan NOD / SCID (1.8 × 104 selil B16F10, 1.5 × 106 selil MC38 pou chak sourit), oswa syngeneic mi (BAL3B / SCID). × 106 selil CT26 pou chak sourit). Selil friz ki dekonjle yo ki te resispann nan PBS yo te sou fòm piki kòm yon kontwòl negatif. Yon semèn apre, selil kansè vivan nan menm kalite yo (3 × 104 selil B16F10, 2 × 105 selil MC38, oswa 5 × 105 selil CT26 pou chak sourit) ak yon volim egal Matrigel (Corning, 354248) yo te enjekte nan bò dwat la. sourit pran vaksen an. Timè yo te mezire lè l sèvi avèk konpa elektwonik, epi yo te kalkile volim kòm L × W2 × 0.5. Yo te kontwole kwasans timè regilyèman pou jou sa yo, epi absans timè yo te konsidere kòm yon endikasyon efikas vaksinasyon antitumoral. Etid vaksen DC661-MC38 yo te repete nan sourit NOD/SCID. Estatistik. Siyifikasyon estatistik yo te detèmine lè w itilize tès t ki pa pè, 2-Student la lè w konpare 2 gwoup. 1-Fason tès ANOVA yo te itilize lè yo te konpare plis pase 2 gwoup. Yon ipotèz nil te siyifikativman rejte si valè P la te mwens pase 0.05. Done yo montre kòm mwayen an ± SEM. Apwobasyon etid. Tout eksperyans bèt yo te fèt an akò ak pwotokòl yo apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal nan University of Pennsylvania.

Chinwa zèb cistanche plant-Antitumor

Referans

1. Zeh HJ, et al. Yon etid owaza faz II preoperasyon nan anpèchman otofaji ak gwo dòz idwoksiklorokin ak gemcitabine / Nab-paclitaxel nan pasyan kansè nan pankreyas. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW, et al. PPT1 ankouraje kwasans timè epi li se sib molekilè dérivés chloroquine nan kansè. Diskou kansè. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, et al. GNS561, yon nouvo inibitè otofaji aktif kont selil souch kansè nan kansòm epatoselilè ak metastaz epatik ki soti nan kansè kolorektal. J Kansè. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, et al. GNS561, yon inibitè PPT1 nan etap klinik, efikas kont karsinom epatoselilè atravè modulasyon fonksyon lizozomal. Otofaji. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, et al. Pèmeabilizasyon manbràn lizozomal ak lage kathepsin se yon evènman anplifikasyon apoptoz ki depann de Bax/Bak nan fibroblast ak monosit. Lanmò selil diferan. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Permeabilization manbràn lisosomal nan lanmò selil. Onkogene. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW, et al. Yon apwòch inifye pou vize wòl siyal degradasyon ak kwasans lizozom yo. Diskou kansè. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R, et al. Ferroptoz, nekroptoz, ak piroptoz nan iminite antikansè. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K, et al. Autophagy ankouraje evazyon iminitè kansè nan pankreyas nan degrade MHCI. Lanati. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, et al. Anpèchman ULK1 simonte prezantasyon antijèn konpwomèt epi retabli iminite antitumoral nan kansè nan poumon mutan LKB1. Nat Kansè. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, et al. Ubiquitin kinase PINK1 rekrite reseptè otofaji pou pwovoke mitofaji. Lanati. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB, et al. TAX1BP1 restrenn apoptoz viris pwovoke pa fasilite degradasyon gratèl-medyatè nan adaptè mitokondriyo MAVS la. Mol selil Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S, et al. Bnip3 afekte byoenergetik mitokondriyo ak stimul woulman mitokondriyo. Lanmò selil diferan. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, et al. Baz mekanistik pou ferroptoz andikape nan selil ki eksprime variant S47 Afriken an nan p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, et al. Inibitè BRAF ak MEK mutan kontwole mikro-anviwònman iminitè timè a atravè piroptoz. Diskou kansè. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Permeabilization manbràn lisosomal nan lanmò selil: nouvo prèv ak enplikasyon pou sante ak maladi. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, et al. Quinacrine-induit otofaji nan kansè nan ovè deklannche cathepsin-L medyatè lisosomal / mitokondriyo pèmeabilizasyon manbràn ak lanmò selil. Kansè (Basel). 2021;13(9):2004.

18. Michaellet MC, et al. Cathepsin-depandan apoptoz deklanche pa aktivasyon supraoptimal nan lenfosit T: yon mekanis posib nan tolerans dòz segondè. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A, et al. Defisi Ppt1-defisyans lizozomal Ca++ omeyostaz kontribye nan patojèn nan yon modèl sourit nan maladi CLN1. J Eritye Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, et al. Fosfolipas ak espès oksijèn reyaktif sòti biomarkers lipid nan moun ak bèt ki an sante ak malad - yon konsantre sou lisofosfatidilkolin. Devan Physiol. 2021;12:732319.

21. Fu R, et al. Efikasite N-acetylcysteine ​​nan fenotip repwesyon nan modèl sourit nan maladi Niemann-Pick, kalite C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, et al. N-acetylcysteine ​​anpeche estrès oksidatif olanzapine pwovoke nan newòn ipotalamik mHypoA-59. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S, et al. ASS1 ak ASL siprime kwasans nan selil ren selil klè atravè metabolis nitwojèn ki chanje. Kansè Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A, et al. Konparezon efè pwoteksyon asid ascorbic sou entèraksyon sistèm redox ak endocannabinoid nan vitro kiltive fibroblast po moun ekspoze a radyasyon UV ak oksijene idwojèn. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, et al. Eksplwate frajilite selil kansè yo pou devlope yon terapi konbinezon pou timè ras-kondwi. Selil kansè. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, et al. Siveyans peroksidasyon lipid nan selil kim pa sond lizozom-sib ak ratiometrik. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, et al. Analiz ki baze sou bioenfòmatik revele MFSD12 ki wo kòm yon pwomotè kle nan pwopagasyon selil ak yon potansyèl sib terapetik nan melanom. Onkogene. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, et al. N-Acetylcysteine ​​kòm yon antioksidan ak ajan kraze disulfid: rezon ki fè yo. Gratis Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Metabolomik lizozomal revele V-ATPase- ak mTOR-depandan règleman nan eflux asid amine soti nan lizozòm. Syans. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, et al. Lanmò selil iminojenik nan terapi kansè: Pwodiksyon prezan ak émergentes. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et al. Anpèchman PPT1 amelyore aktivite anti-tumè anti-PD-1 nan melanom. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM, et al. BAMM (BRAF otofaji ak anpèchman MEK nan melanom): yon esè faz I/II nan dabrafenib, trametinib, ak idroksiklorokin nan avanse BRAFV600-melanom mutan. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. Pwoteyin makrootofaji kontwole nivo MHC klas I sou selil dendritik yo epi fòme repons selil T CD8(+) anti-viral yo. Rep. selil 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, et al. Mobilizasyon sistein lisosomal fòme repons TORC1 ak kwasans tisi nan jèn. Syans. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-acetylcysteine: yon revizyon nan itilite klinik (yon ansyen dwòg ak nouvo ke trik nouvèl). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.

36. Byè LA, et al. Dekouvèt sistematik nan biomarkers serom gwosès ektopik lè l sèvi avèk 3-D pwoteyin pwofil makonnen ak kantite etikèt-gratis. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. Efè prensipal la sou proteom nan ARID1A-mutasyon karsinom selil klè nan òvèj se downregulation nan chemen mevalonate la nan nivo pòs-transcriptional. Mol Cell Proteomics. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant pèmèt to idantifikasyon peptide segondè, presizyon mas endividyalize ppb-ranje, ak quantifikasyon pwoteyin nan tout pwoteòm. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, et al. Andromeda: yon motè rechèch peptide entegre nan anviwònman MaxQuant. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, et al. Kantifikasyon egzat pwoteomè-lajè san etikèt pa nòmalizasyon reta ak ekstraksyon maksimòm rapò peptide, ki rele MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, et al. Platfòm enfòmatik Perseus la pou analiz konplè done (prote)omik. Metòd Nat. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: yon platfòm byoenfòmatik pou analiz entegre done proteomik nan rechèch kansè. Metòd Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM, et al. Chanjman nan metabolis lipid fibroblast ki gen laj pwovoke rezistans selil melanom ki depann de laj nan terapi vize atravè transpòtè asid gra FATP2. Diskou kansè. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA, et al. Jeni genòm lè l sèvi avèk sistèm CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, et al. Kantite ekspozisyon calreticulin ki asosye ak lanmò selil imunojèn. Metòd Enzymol. 2020;632:1–13.