Selil timè yo pa prezante epitop ki limite MHC-II ki sòti nan onkojèn yo rive nan selil CD4+ T
Oct 09, 2023
Selil CD4+ T yo jwe yon wòl enpòtan nan iminite anti-tumeur atravè rekonesans antijèn peptide yo prezante sou MHC klas II (MHC-II). Malgre ke kèk kansè solid ka pwovoke eksprime MHC-II, nan ki pwen sa a pèmèt rekonesans dirèk pa timè-espesifik CD4+ selil T pa klè. Nou izole epi karakterize reseptè antijèn selil T yo (TCR) ki soti nan selil T CD4+ natirèlman ki an premye espesifik pou 2 onkoprotein, HPV-16 E6, ak mitasyon aktive KRASG12V, ki soti nan pasyan ki gen karsinom selil squamous nan tèt ak kou. ak pankreyas adenokarcinom ductal, respektivman, epi detèmine kapasite yo pou rekonèt otològ oswa imen leukocyte antijèn-matche antijèn ki eksprime selil timè. Nou te jwenn nan tou de ka yo ke TCR yo te kapab rekonèt selil sib ki chaje ak peptide ki eksprime selil MHC-II oswa selil B selil ki prezante antijèn (APCs) lè antijèn yo te eksprime andojèn epi dirije yo nan chemen endosomal la men yo pa t rekonèt timè. selil ki eksprime pwoteyin sous la menm apre endiksyon ekspresyon MHC-II sifas pa IFN- oswa transdiksyon ak CIITA. Rezilta sa yo sijere ke priming ak rekonesans fonksyonèl nan tou de yon nikleyè (E6) ak yon manbràn ki asosye (KRAS) onkoprotein yo se sitou limite nan kwa-prezante APCs olye ke atravè rekonesans dirèk nan selil timè pwovoke eksprime MHC-II.
Benefis cistanche tubulosa-Antitumor
Entwodiksyon
Transfòmasyon malfezan nan selil somatik inisye pa aksyon onkogen aktive ki disregulate chemen kwasans selil yo epi ki mennen nan pwopagasyon san kontwòl (1). Nan ka kansè ki asosye ak HPV, ekspresyon jèn HPV bonè E6 ak E7 kontribye nan onkogenèz lè yo anpeche jèn timè p53 ak Rb, respektivman (2). Altènativman, aktivasyon onkojèn konstititif ka rive atravè mitasyon somatik nan jèn ki kontwole kwasans selil ak wout pwopagasyon, tankou fanmi RAS. Vreman vre, aktive mitasyon KRAS tankou KRASG12V yo souvan jwenn nan pasyan ki gen kansè nan pankreyas, kolon, ak nan poumon (3). Malgre ke onkogen ankouraje maladi, yo ka bay tou sib pou sistèm iminitè lame a. Nan dènye ane yo, wòl sistèm iminitè a nan kontwole kansè ki asosye ak HPV te vin lajman rekonèt. CD8+ ak CD4+ selil T ki rekonèt HPV E6 ak E7, ansanm ak lòt pwoteyin HPV, yo te idantifye nan tou de san periferik la ak lenfosit ki enfiltre timè (TIL) nan pasyan ki gen HPV ki asosye. kansè (4-6). Imunoterapi ki vize antijèn sa yo, ki gen ladan vaksen kansè ki ka geri ak terapi selilè adoptif (ACT) ak TIL oswa selil T ki fèt ak TCR, se yon zòn aktif nan ankèt preklinik ak klinik (2). Repons T-selil kont mitasyon onkogenik yo te tou dekri lajman (7-9). Anplis de sa, gen prèv klinik dirèk ki montre ACT ak TIL ki vize mutan KRAS ka ankouraje repons objektif (10). Malgre ke selil CD8+ T yo rekonèt epitop ki sòti nan onkojèn yo medyatè sitotoksisite dirèk kont selil timè yo (11-13), wòl selil CD{4+ T yo nan iminite antitumoral yo mwens byen konprann. Etid resan yo te mete aksan sou yon ti gwoup CD4+ selil T ki eksprime makè sitotoksik, tankou granzyme B (GrzmB), nan kansè imen (14, 15). Espesifik antijèn selil sa yo, sepandan, ak kidonk potansyèl terapetik yo, rete lajman enkoni. Anplis de sa, pou selil T cytotoxik CD4+ sa yo rekonèt epi touye selil timè yo, nonsèlman selil timè a dwe eksprime MHC-II, men tou, antijèn ki enpòtan yo dwe dirije nan chemen prezantasyon ki apwopriye a. Nan etid sa a, nou te envestige kapasite CD4+ selil T espesifik pou onkoprotein HPV-16 E6 ak KRASG12V pou rekonèt selil timè ki eksprime antijèn yo. Malgre ke tou de TCR yo te kapab dirèkteman rekonèt endogenously trete ak prezante antijèn ki te dirije nan lòj la endosomal nan HLA-matche selil B, ni pa t 'kapab rekonèt antijèn ki eksprime selil timè ak ekspresyon pwovoke nan MHC-II. An jeneral, rezilta nou yo sijere ke sèlman sèten antijèn yo prezante dirèkteman sou selil timè MHC-II+, ki ka limite pisin selil CD4+ T ki kapab rekonèt ak elimine selil timè yo dirèkteman.
benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè
Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity
【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Rezilta yo
Idantifikasyon repons selil HPV-16 E6-espesifik CD{4+ ak CD{8+ T ki soti nan TIL nan kansòm selil squamous nan tèt ak kou. Nou te fè tès depistaj yon seri kilti endividyèl TIL izole nan fragman timè 2 a 4 mm nan yon pasyan (Hu-56) ak HPV-16+ tèt ak kou squamous cell carcinoma (HNSCC) (Tablo Siplemantè 1; materyèl siplemantè). disponib sou entènèt ak atik sa a; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) pa tès IFN-ELISPOT pou idantifye repons selil T ki dirije kont onkoprotein viral HPV-16 E6 ak E7, lè l sèvi avèk pisin peptide ki gen ladan l. sipèpoze 15-mers ki kouvri longè pwoteyin E6 ak E7 yo. Miyò, fragman TIL 12 ak 29 te jenere yon kantite konsiderab tach sou background nan lè yo te restimulate ak pisin peptide E6 epi yo te genyen tou de CD 4+ ak CD {8+ selil T (Figi 1A ak Figi Siplemantè 1A). Pou idantifye ti gwoup selil T ki enpòtan yo, nou analize kilti TIL sa yo lè l sèvi avèk yon tès sekresyon sitokin. Sa a te revele fragman TIL 29 (F29) te genyen E6-reyaktif CD8+ selil T, tandiske fragman 12 (F12) te genyen tou de CD4+ ak CD8+ selil T ki kapab rekonèt pisin peptide E6 (Figi 1B). Okenn nan selil T CD4+ yo pa pwodui IL-5 an repons a restimulasyon E6, ki valide yon fenotip Th{1-. Pou detèmine klonalite TCR nan E6-TIL espesifik yo, nou klase selil T CD4+ ki sekrete IFN sèl ki soti nan F12 ak CD8+ selil T ki soti nan F12 ak F29. Sekans TCR te revele yon sèl TCR ki eksprime pa IFN- - sekrete CD4+ selil T (n=31 nan 31 selil sekans), osi byen ke yon sèl script TCR pataje pa IFN- - sekrete CD{{53 }} Selil T ki soti nan tou de F12 ak F29 (n=40 nan 41 ak 37 nan 38 selil yo sekans, respektivman) (Tablo Siplemantè 2). Rezilta sa yo endike selil monoklonal CD4+ ak CD{8+ T ki reyaktif ak E6 yo prezan nan TIL pasyan sa a. HLA-A*02:01–selil T CD8+ restriksyon ki soti nan TIL yo rekonèt E6 prezante pa yon liy selil timè ki sòti nan pasyan an. TIL ki soti nan F29 te pwodui IFN- lè yo te restimule ak peptide E629-38, sa ki sijere ke F29 TCR a te rekonèt epitop HLA-A * 02:01 ki te dekri deja (figi siplemantè 1B) (11). Sa a te konfime pa etid tetramer-obligatwa ki itilize E629-38/HLA-A*02:01 pou make selil J76 ki defisi TCR ki eksprime CD8 imen ak lè l sèvi avèk yon TCR espesifik E628-38 ki te dekri deja kòm yon pozitif. kontwòl (Figi 2A) (11). Tou de TCR yo te montre menm nivo avidite fonksyonèl, jan yo demontre nan ogmantasyon nan makè aktivasyon egi CD69 la sou J76 apre eksitasyon ak liy selil otològ B lenfoblastoid (B-LCLs) enpulsyonèl ak konsantrasyon titrate nan E629-38 peptide (Figi 2, B ak C). Done sa yo valide prezans yon script selil CD8+ T espesifik pou yon epitop li te ye nan E6 ak karakteristik fonksyonèl ki sanble ak yon TCR ki te teste nan yon anviwònman klinik (16). Apre sa, nou te chèche detèmine si E6-CD espesifik8+ TCR a te kapab rekonèt antijèn ki eksprime nan andojèn epi kidonk medyatè sitotoksisite antitumoral. Pou fè sa, nou te itilize yon liy timè HLA-A*02 ki byen karakterize:01+ HPV{-16+, CaSki, ansanm ak yon liy selil timè otològ, HNSCC-56, ki te pwodwi atravè repwogram selilè nan tisi timè prensipal jan yo dekri deja (17) pou tès sitotoksisite in vitro. Analiz RNA-Seq valide ekspresyon jèn HPV-16 bonè, ki gen ladan E6, pa echantiyon timè prensipal la ak liy selil otològ la (Figi Siplemantè 1C). Selil T prensipal imen CD8+ ki eksprime F29 TCR a kapab medyatè touye selil CaSki ak HNSCC-56 nan yon seri rapò efèktè-a-sib nan vitro (Figi 2, D, ak E). Ansanm, done sa yo valide ke F29 TCR rekonèt antijèn E6 eksprime andojèn. Idantifikasyon yon selil T ki gen restriksyon sou HLA-DQ, E6-espesifik CD4+ TIL yo. Pou elaji E6-TIL espesifik pou plis analiz fonksyonèl, nou te itilize pwotokòl kilti ekspansyon rapid ki te dekri deja a ak OKT-3 ak PBMC alojenik iradyasyon pou elaji TIL soti nan F12. Malgre ke kilti prensipal F12 la te genyen okòmansman tou de CD8+ ak CD{4+ selil T ak reyaksyon E6, pwodwi selil final la apre ekspansyon rapid la te genyen 99% selil T CD{4+, ladan yo apeprè 38,33. % demontre reyaksyon kont E6, jan yo demontre pa tach intraselilè cytokine pou IFN- (Figi 3A).
Chinwa zèb cistanche plant-Antitumor
Anplis de IFN-, TIL espesifik E6-espesifik CD4+ te kapab sekrete TNF- men se pa IL-2 (Figi Siplemantè 2A). Malgre ke frekans total selil GrzmB + yo pa t ogmante ak eksitasyon antijèn, gate sou selil ki sekrete TNF te revele ke E6-espesifik CD4+ TIL yo te genyen plis GrzmB ki estoke anndan selil pase TIL ki pa espesifik (Figi Siplemantè 2B). ). IFN--sekrete CD4+ TIL yo te eksprime tou makè koyenibitè a pwograme lanmò selil 1 (PD{-1), ki konsistan avèk siyati pibliye CD4+ TIL yo (Figi Siplemantè 2C) ( 18, 19). E6-CD espesifik4+ TIL yo te demontre yon gwo avid fonksyonèl paske selil sa yo te kapab sekrete cytokines nan konsantrasyon peptide mwens pase 1 ug/mL (Figi 3B). Pou detèmine espesifik kilti F12 TIL la, nou enpulsyonèl B-LCL otològ ak peptides endividyèl ki koresponn ak chak nan 37 peptides ki genyen nan pisin E6 orijinal la (Tablo Siplemantè 3). CD4+ TIL ki soti nan F12 sekrete IFN- lè yo ankouraje ak peptides E61-15 ak E{65-19, ki pataje yon sekans nwayo 11-asid amine (Figi Siplemantè 2D). Eksperyans Coculture nan prezans HLA-bloke Abs te revele siyifikativman diminye sekresyon IFN pa TILs lè B-LCL yo te bloke ak anti-HLA-DQ Abs men pa anti-HLA-DR oswa Abs kontwòl izotip (Figi 3C). Pou detèmine ki alèl HLA-DQ ki responsab prezantasyon epitop sa a, nou te enpulse B-LCL ki eksprime alèl HLA-DQ li te ye (Tablo Siplemantè 4) ak E61-15 epi nou te jwenn ke selil KAS011 ki eksprime HLA-DQA1*01. :02 ak DQB1 * 05:02, men se pa Hu-195 B-LCL ki eksprime DQA1 * 05:05 ak DQB1 * 03:01, te kapab prezante antijèn nan TIL yo nan yon fason ki konparab ak otològ Hu{{63} } B-LCLs (Figi 3D). Finalman, nou t'ap chache verifye ke sekans TCR te idantifye deja te tout bon responsab pou rekonesans E6. Ekspresyon F12 TCR nan selil CD4+ T donatè prensipal moun ki an sante yo te ase pou ankouraje rekonesans E61-15 peptide a, jan sa evidans regilasyon CD69 ak PD-1 (Figi 3E). ). Ansanm, rezilta sa yo demontre idantifikasyon yon epitop HLA-DQ-restriksyon nan E6 rekonèt pa TIL monoklonal CD4+. E6-selil T espesifik CD4+ yo pa rekonèt oswa touye selil timè otològ ki eksprime MHC-II. Etid resan yo te idantifye siyati jenetik CD4+ TILs nan kèk kansè imen (14, 15). Sepandan, yo pa konnen si selil T citotoksik CD4+ yo jwe yon wòl nan kansè HPV kondwi yo. Pou detèmine si E6-espesifik CD4+ selil T ki soti nan TIL yo ka rekonèt dirèkteman HNSCC-56, nou te premye envestige estati ekspresyon MHC-II li yo. Malgre ke selil timè yo pa eksprime okenn sifas detekte MHC-II nan kilti, tretman ak IFN-pou 72 èdtan te ase yo pwovoke upregulation nan MHC-II (Figi 4A). Apre sa, nou kiltive HNSCC-56 ak CD4+ F12 TIL. Sa ki enpòtan, selil timè MHC-II+ ki te prekondisyone ak IFN- pa t kapab ankouraje CD4+ TIL yo jan yo mezire pa sekresyon IFN- (Figi 4B).
Figi 1. Idantifikasyon E6-CD4+ ak CD8+ TIL ki soti nan HPV-16+ HNSCC. (A)
Figi 2. Karakteristik fonksyonèl yon HLA-A*02:01-restriksyon, E6-TCR espesifik soti nan Hu-56 TILs. (A)
Sepandan, IFN-trete liy selil timè enpulsyonèl ak E61-15 anvan adisyon nan TIL yo te kapab estimile yon repons selil T, ki endike ke ekspresyon sifas nan restriksyon HLA-DQ alèl yo nan yon liy selil ki eksprime andojèn. E6 pa t 'ase pou rekonesans timè men li te egzije chaj ekzojèn nan peptide sib la. Yo te obsève menm egzijans chaj peptide sib sib ak selil timè CIITA-transduced (HNSCC-56 CIITA), ki konstititivman eksprime nivo segondè nan sifas MHC-II (Figi 4B). Pou teste si CD4+ TIL yo te kapab rekonèt yon vèsyon andojèn trete epi prezante nan epitop E6 la sou yon APC, nou te transdui retroviral B-LCLs otològ ak yon konstriksyon ekspresyon ki kode 50 premye asid amine E6 yo kole ak MHC-. Domèn transmembrane I (E6-MITD), ki pwovoke lokalizasyon sekans asid amine kole nan manbràn plasma a epi li sipòte prezantasyon sou MHC-II atravè trafik endozomal (20). B-LCL ki eksprime konstriksyon E6-MITD a kapab ankouraje TIL espesifik E6-CD4+, sa ki endike ke epitop peptide rekonèt pa TIL sa yo ka trete natirèlman epi prezante sou MHC-II lè dirije nan chemen ki apwopriye a (Figi 4C).
Figi 3. Karakteristik fonksyonèl TIL CD4+espesifik E6-espesifik ak HLA-DQ ki elaji nan fason klon. (A)
Apre sa, nou te chèche detèmine si TIL espesifik F12 E6-CD4+ yo te kapab sitotoksisite timè dirèk. Konfòm ak done ki soti nan tès rekonesans nou yo, E6-CD espesifik4+ TIL yo pa t kapab limite kwasans selil timè HNSCC-56, ki pa eksprime MHC-II (Figi 4D) . Anplis de sa, selil timè HNSCC-56 CIITA yo te grandi tou san anpèchman an prezans CD4+ TIL yo. Sepandan, kwasans selil timè HNSCC-56 CIITA enpulsyonèl ak peptide E61-15 te anpeche nan yon fason ki depann de dòz selil efektè yo. An jeneral, done sa yo sijere ke byenke HNSCC-56 ka prezante epitop E6 nan CD8+ selil T, E{6-espesifik CD4+ TIL yo pa kapab dirèkteman rekonèt ak liz MHC- II+ selil timè otològ. Jèn ki enplike nan prezantasyon antijèn yo souvan mitasyon nan kansè, sa ki ka anpeche rekonesans pa selil T (21). Pou detèmine si selil timè HNSCC-56 yo genyen nenpòt mitasyon somatik ki anpeche prezantasyon antijèn sou MHC-II, nou te fè sekans tout-ekzom selil timè yo ak PBMC ki soti nan Hu-56 kòm yon echantiyon referans. Nan 104 mitasyon somatik ki pa sinonim yo idantifye, pa te gen okenn mitasyon aparan nan eleman nan chemen prezantasyon MHC-II, ki gen ladan HLADMA, HLADMB, ak CD74 (Tablo Siplemantè 5). Idantifikasyon yon HLA-DRB5 * 01:01-restriksyon, KRASG12V-espesifik TCR ki soti nan san an nan yon pasyan ki gen adenokarcinom ductal pankreyas. Apre rezilta sa yo, nou te deside si enkapasite selil timè yo pou prezante antijèn sou MHC-II te vre pou lòt onkojèn. Etandone ke selil T sikile espesifik timè yo te idantifye nan pasyan imen ki gen kansè (8, 22), nou ankouraje PBMC nan yon pasyan (Hu-66) ki gen adenokarcinom ductal pankreyas (Tablo Siplemantè 1) ak yon pisin peptides. ki koresponn ak mitasyon onkojenik komen (Tablo Siplemantè 6) pou 14 jou anvan restimulasyon ak peptides endividyèl yo idantifye repons selil T ki enpòtan pa ELISPOT. Rezilta sa yo te endike prezans yon repons selil T ki te dirije kont KRASG12V, jan sa evidans yon ogmantasyon kantite tach IFN sou background nan an repons a asid amine KRASG12V 1-15 (Figi 5A). Pou idantifye TCR ki enpòtan ki asosye ak repons sa a, nou te itilize ankò tès sekresyon cytokine pou klase selil IFN---sekre. Egzamen sekresyon sitokin la te revele pwodiksyon espesifik IFN- pa selil T CD4+ an repons a restimulasyon ak KRASG12V (Figi 5B). Konpare chèn TCR ki soti nan selil IFN---sekre yo ak sa yo ki prezan nan PBMC ki pa elaji nan pasyan sa a te revele yon sèl klonotip TCR ki prezan nan pi gwo frekans nan mitan tou de popilasyon yo (Figi 5C ak Tablo Siplemantè 2). Rezilta sa yo endike ke frekans script selil T sa a te elaji nan debaz nan PBMC yo, sa ki sigjere yon repons natirèlman ki rive nan vivo olye ke priming in vitro nan kilti ekspansyon nou an. Pou verifye espesifik antijèn TCR sa a, nou te eksprime li nan selil T CD4+ imen prensipal yo pa transdiksyon retroviral epi nou kiltive selil sa yo ak B-LCL otològ enpulsyonèl ak swa mutan KRASG12V oswa peptide WT ki koresponn lan. Selil T Enjenieri sekrete IFN- lè yo ankouraje ak mutan an, men se pa WT, KRAS peptide, verifye ke TCR sa a espesifik pou KRASG12V (Figi 5D). Konfòm ak rezilta nou yo soti nan E6 TCR, selil T enjenyè ki eksprime TCR espesifik KRASG12V yo te kapab rekonèt tou B-LCL ki eksprime yon fragman KRASG12V, men se pa WT KRAS, ki te dirije nan endosome a pa enklizyon yon MITD, ki sijere ke sa a. TCR rekonèt endogenously trete ak prezante antijèn (Figi 5D).
Figi 4. Selil timè otològ yo pa prezante E61-15 andojèn sou MHC-II nan selil T CD4+. (A)
Figi 5. Idantifikasyon yon HLA-DRB5 * 01:01-restriksyon, KRASG12V-espesifik TCR ki soti nan san an nan yon pasyan ki gen adenokarcinom ductal pankreyas. (A)
Pou idantifye restriksyon HLA alèl la, nou repete eksperyans eksitasyon peptide sa yo lè l sèvi avèk B-LCL ki eksprime diferan konbinezon de jèn HLA. B-LCL ki eksprime aplotip HLA-B7-DR{15-DQ6 komen yo ta ka ankouraje selil T yo enjenyè, tandiske B-LCL san alèl sa yo pa t 'kapab (Figi 5E). Alafen, eksitasyon selil sa yo pa IHW03304 peptide-pulsed, yon liy selil DAP3 sourit transfekte ak HLA-DRB5 * 01:01 imen, verifye sa a kòm molekil HLA restriksyon (Figi 5F). Selil timè MHC-II+ NCI-H2444 ak DAN-G yo pa prezante epitop ki sòti nan KRASG12V nan selil T CD4+. Apre sa, nou te envestige kapasite selil timè yo pou yo prezante dirèkteman epitop ki sòti nan KRASG12V sou MHC-II. Pou jenere liy selil HLA-matche MHC-II + pou etid sa yo, nou transdui liy selil KRASG12V + NCI-H2444 ak DAN-G, ki sòti nan kansè nan poumon ak pankreyas imen, respektivman, ak CIITA ak yon konstwi kode HLA-DRB5 * 01: 01 ak yon jèn repòtè CD34 twonke (Figi 6A). Konfòm ak rezilta anvan nou yo, selil timè MHC-II + ki eksprime alèl HLA ki restriksyon yo pa t kapab ankouraje selil T ki fèt ak TCR sof si selil sib yo te premye enpulsyonèl ak peptide ekzojèn (Figi 6B). Sa ki enpòtan, pa te gen okenn mitasyon somatik ki nan lis nan jèn prezantasyon MHC-II (savwa, HLADMA, HLADMB, CD74) pou swa NCI-H2444 oswa DAN-G nan done sekans piblik ki disponib (23). Selil NCI-H2444 CIITA yo te grandi san anpèchman nan prezans TCR-enjenieri selil T, tandiske selil NCI-H2444 CIITA enpulsyonèl ak KRASG12V peptide ki gen eksperyans kwasans timè reta (Figi 6C). Konfòm ak rezilta yo te jwenn pou HNSCC-56, CD{8+ selil T ki eksprime yon HLA-A*03:01– restriksyon, KRASG12V-espesifik TCR (24) te kapab rekonèt selil NCI-H2444 men se pa Selil CaSki, ki eksprime HLA-A * 03:01 men se pa KRASG12V (Figi 6D). Rezilta sa yo demontre ke selil timè MHC-II + pa ka prezante yon onkojèn diferan nan sitosol la malgre yo te prezante efektivman sou MHC-I. Ekspresyon nan ligand koenibitè tankou pwograme selil lanmò ligand 1 (PD-L1) pa selil timè limite siyal TCR nan selil T (25). Pou detèmine si mekanis sa a ka anpeche selil timè MHC-II+ yo rekonèt pa selil CD4+ T, nou kiltive selil CD4+ T ki eksprime TCR espesifik KRASG12V nou an oswa E6-espesifik. F12 TCR ak NCI-H2444 CIITA ak HNSCC-56 CIITA, respektivman, avèk oswa san anti-PD-L1-bloke Abs. Bloke entèraksyon PD-L1/PD-1 pa t ase pou ankouraje rekonesans selil timè yo (Figi Siplemantè 3). Menm jan an tou, adisyon anti-CD28 agonist Ab pa t 'modile rekonesans selil timè yo. Rezilta sa yo sijere ke yon mank de prezantasyon antijèn, olye ke prezans oswa absans siyal coinhibitory oswa costimulatory, respektivman, ki responsab pou fenotip sa a. Gen kèk etid sijere ke pwoteyin andojèn entènalize nan manbràn plasma a preferansyèlman chaje sou MHC-II pou prezantasyon, konpare ak lòt konpatiman subselilè (26). Malgre ke pwoteyin KRAS yo souvan asosye ak manbràn atravè modifikasyon lipid, yo pa eksprime yon domèn transmembrane, ak entèraksyon sa yo pa estab (3, 27). Se poutèt sa, nou te rezone ke ancrage fragman iminojenik KRASG12V nan manbràn plasma selil timè yo ka pèmèt selil T CD4+ yo rekonèt antijèn dirèk yo. Sepandan, selil timè ki eksprime konstriksyon KRASG12V-MITD a, jan sa montre pa ekspresyon yon repòtè EGFP ki lye ak P2A yo, yo pa t kapab ankouraje selil T CD4+ TCR ki fèt ak TCR (Figi Siplemantè 4). Rezilta sa yo sijere ke lokalizasyon onkogen subselilè se pa sèl detèminan prezantasyon dirèk MHC-II pa selil timè yo. Anplis de sa, rezilta sa yo sijere ke ekspresyon antijèn pa ase pou ankouraje prezantasyon MHC-II. Rezilta nou yo jiskaprezan sijere ke selil CD4+ T ki espesifik pou timè yo ka gen plis chans pou yo rekonèt antijèn APC yo prezante pase pa selil timè yo tèt yo. Se poutèt sa, nou te evalye kapasite HLADRB5*01:01+ DC pou prezante antijèn ki sòti nan pwoteyin ekzojèn yo. DC ki matche ak HLA ki te pwodwi in vitro yo te kapab ankouraje selil T CD4+ TCR ki te eksprime TCR espesifik KRASG12V a lè DC ki pa matirite yo te swa enpulsyonèl ak peptide KRASG12V 20-mer oswa nouri KRASG12V antye pwoteyin men pa KRAS WT pwoteyin (Figi 6E). Rezilta sa yo sijere ke byenke TCR a pa ka rekonèt antijèn andojèn prezante pa selil timè, li ka rekonèt kwa prezante antijèn ekzojèn nan yon kontèks DCs.
cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè
Diskisyon
Objektif etid sa a se te detèmine si TCR yo izole nan selil T natirèlman prime yo jwenn nan pasyan ki gen kansè yo te kapab rekonèt selil timè ki eksprime onkogen. Konsènan klas I (HLA-A*02:01)–restriksyon, HPV-16 E{629-38 TCR yo te jwenn nan HNSCC TIL, rekonesans te afime, petèt san sipriz, pou tou de yon liy selil timè otològ. ak yon selil timè ki byen karakterize HLA-matche ak E6-eksprime, CaSki (enpòtan, gade Figi 2). Menm TIL yo (Figi 1) te genyen tou yon kantite siyifikatif selil T ki bay IFN--pwodwi E6-espesifik CD4+ (Figi 3), ki, kontrèman, pa t rekonèt E6- eksprime selil timè yo, menm lè yo te pwovoke yo eksprime ase sifas MHC klas II nan alèl prezantasyon kòrèk la (DQA1 * 01:02 / DQB1 * 05:02) pa tretman IFN oswa CIITA transduction (Figi 4). Ekspresyon CIITA pwovoke pa sèlman ekspresyon sifas MHC-II pwoteyin, men tou HLA-DM ak molekil chèn invariant, ki nesesè pou pwosesis antijèn ak prezantasyon (28). Kontrèman, selil B ki matche ak HLA yo te rekonèt pa TCR sa a lè yo te dirije antijèn nan chemen MHC-II la. Yon sitiyasyon menm jan an te obsève nan ka a nan yon KRASG12V-espesifik, HLA-DRB5 * 01:01-restriksyon TCR, ki te kapab rekonèt HLA-matche selil B, men se pa MHC-II-eksprime selil timè, lè antijèn te dirije nan la. chemen prezantasyon MHC-II. Tou de TCR yo te genyen ase avidite fonksyonèl pou medyatè rekonesans antijèn ki eksprime andojèn nan kondisyon ki dekri pi wo a, epi tou de te kapab medyatè sitotoksisite selil sib ki chaje ak peptides. Dènye obsèvasyon sa a reflete sikonstans yo prezante nan plizyè rapò sou selil T citotoksik CD4+, byenke done nou yo pwolonje kontèks obsèvasyon sa a lè yo montre ekspresyon andojèn antijèn sous la ak endiksyon MHC-II pa IFN- pa fasil. bay yon sib fizyolojik sou selil timè ki sòti epitelyal pou TCR kont antijèn nikleyè oswa manbràn ki asosye. Dènye etid sou kansè nan blad pipi imen ak melanom te idantifye siyati jenetik ki koresponn ak selil T cytotoksik CD4+ nan mitan TIL yo (14, 15). Fonksyonèlman, CD4+ TIL sitotoksik sa yo kapab rekonesans timè MHC-II dirèk depandan, finalman mennen nan liz sib pa granzym nan yon fason ki sanble ak tokay CD8+ yo. Sepandan, tradiksyon terapetik rezilta sa yo ka limite pa lefèt ke kèk timè solid eksprime MHC-II. Vreman vre, rezilta nan 2 etid endepandan sijere ke sèlman apeprè yon tyè nan pasyan ki gen melanom gen nenpòt selil timè MHC-II +, ak frekans nan selil sa yo nan timè a se souvan mwens pase 10% (15, 29). Olye de sa, sous selil prensipal MHC-II nan mikroanvironman timè a parèt enfiltre lekosit (26).
Figi 6. Selil timè MHC-II+ KRASG12V+ yo pa prezante epitop ki sòti nan KRASG12V nan selil T CD4+. (A)
Malgre ke kèk selil timè solid eksprime MHC-II konstititif oswa enduzib, rezilta nou yo endike ke malgre prezans selil T CD4+ espesifik pou onkojèn pami TIL yo ak PBMC yo, selil sa yo pa ka rekonèt dirèkteman ak lize antijèn ki eksprime. Selil timè MHC-II+, alòske epitop ki soti nan menm pwoteyin yo ka byen prezante bay selil T CD8+ sou MHC-I (13). Sa a sijere ke senpleman eksprime yon antijèn sib ka pa ase pou bay rekonesans pa CD4+ selil T pou ti gwoup timè ki eksprime MHC-II. Anplis de sa, rezilta sa yo sanble yo konsistan atravè plizyè kalite timè, paske liy selil yo kesyone nan etid sa a gen ladan sa ki sòti nan HNSCC, adenokarcinom nan poumon, ak kansè nan pankreyas. Rekonesans dirèk CD4+ selil T nan liy selil melanom ki eksprime MHC-II natirèlman oswa apre transdiksyon CIITA yo te rapòte nan 2 etid (30, 31). Sepandan, nan tou de etid sa yo, yon fraksyon enpòtan nan TCR yo teste pa t 'rekonèt selil timè dirèkteman. Li pa klè si TCR sa yo reprezante klonotip "observateur" ki pa rekonèt antijèn timè oswa TCR espesifik timè ki pa kapab rekonèt antijèn parèy yo akòz defisyans prezantasyon antijèn tankou sa yo make nan etid sa a. Oliveira et al. (31) te demontre ke rekonesans dirèk pa selil CD4+ T yo te limite a 2 melanom ak fado mitasyon timè ekstrèmman wo, sijere ke fenotip sa a ka bay lòt chanjman ki nesesè ki pèmèt MHC-II prezantasyon antijèn timè yo. Malgre ke atache yon MITD nan fragman iminojenik KRASG12V la pa t 'gen rezilta nan rekonesans dirèk nan selil timè pa CD4+ selil T, etid yo te dekri yon patipri pou peptides andojèn ki sòti nan pwoteyin manbràn ki soti nan MHC-II, prezimableman. akòz resiklaj manbràn (26, 32). Antijèn melanom Trp1 la egziste nan manbràn plasma a, ki ka fasilite prezantasyon dirèk nan selil T CD4+ pa selil timè B16 (33). Selil timè yo prezante yon lòt antijèn melanom ki asosye ak gp100 nan selil T CD4+ nan yon fason ki depann de domèn transmembran gp100 a (34). Nan dènye travay ki te mennen ankèt sou wòl selil T CD4+ neoantigen espesifik yo nan yon modèl sarkòm murin, epitop ki sòti nan yon subinite integrin mitasyon, tou yon pwoteyin ki mare nan manbràn, yo te elimine nan MHC-II sou timè CIITA-transduced. selil (35). Rezilta nou yo sijere ke byenke pwoteyin manbràn-bound yo ka preferans trafik nan endosomes pou prezantasyon dirèk sou MHC-II, prezans nan yon pwoteyin manbràn imunojèn pou kont li pa ase pou ankouraje prezantasyon sa a. Gen lòt chemen prezantasyon ki pa klasik yo dekri ki ka pèmèt pwoteyin sitosol oswa nikleyè aksè a MHC-II, tankou prezantasyon otofaji ki asosye nan pwoteyin intraselilè ak transpòtè ki asosye ak pwosesis antijèn - prezantasyon depandan nan CD4+ selil T, kidonk antijenik. peptides yo prezimableman transfere soti nan MHC-I nan MHC-II pandan resiklaj manbràn (36, 37). Yo te rapòte rekonesans dirèk MHC-II-depandan nan selil timè otològ pa CD4+ selil T espesifik pou epitop E7 (38, 39); sepandan, etid sa yo tou de konsène pwoteyin E7 ki eksprime pa soutip HPV onkogenik ki pa gen anpil (sètadi, HPV-33 ak HPV{-59) prezante pa selil kansè nan matris sou molekil HLA-DR. Se poutèt sa, li posib ke subtip HPV, istoloji timè, ak restriksyon alèl HLA kapab tou faktè enpòtan nan prezantasyon diferans lan nan antijèn HPV nikleyè sou selil timè MHC-II +. Malgre ke done nou yo sijere ke sitotoksisite timè dirèk se pa yon mekanis ki gen anpil chans nan E6- ak KRASG12V-espesifik CD4+ selil T, yo te dekri lòt mekanis antitumoral nan CD4+ selil T, ak transfè adoptif nan selil T CD4+ espesifik timè yo nan pasyan ki gen kansè yo te demontre aktivite antitumoral (7, 40, 41). Se poutèt sa, TCR ki gen restriksyon sou MHC-II tankou sa yo idantifye nan etid sa a ka itil pou ACT nan pasyan imen, yo bay TCR sa yo vize epitop ki sòti nan onkoprotein chofè ki limite a aplotip HLA yo estime a 1.27% ak 16.10% nan US White. popilasyon, respektivman, pou HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 ak HLA-DRB5*01:01 (42). Miyò, CD4+ selil T ede nan priming nan timè-espesifik CD8+ selil T yo lè yo bay lisans DC ki gen antijèn nan yon fason ki depann de CD40L (43-45). Nou demontre ke KRASG12V-espesifik TCR idantifye nan etid sa a rekonèt antijèn kwaze prezante nan kontèks DCs, sijere ke selil sa yo ka kapab kontribye nan iminite antitumoral atravè fonksyon sa a. Selil CD4+ T yo ka bay èd lokal tou pou selil CD8+ T ki nan timè yo lè yo sekrete sitokin tankou IL{-2 ak IFN- , ki sipòte siviv CD{8+ T selil yo ak rekritman nan timè a (46). Anplis de sa, CD4+ TIL yo ka rekonèt antijèn nan mikroanvironman timè a sou selil myeloid tankou makrofaj. Vreman vre, etid preklinik yo te demontre ke nan absans MHC-II sou selil timè yo, selil T Trp1 CD {4+ T ki te transfere adoptif yo toujou ka egzèse iminite antitumoral ki depann de IFN- ak korelasyon ak aktivite sitotoksik ogmante nan macrophages (47). Sepandan, fenomèn sa a parèt yo dwe depann sou sekresyon antijèn timè, ki nou ta tou espekile se minim nan ka a nan pifò onkogen. An jeneral, etid nou an mete aksan sou selektivite nan prezantasyon dirèk nan antijèn andojèn pa selil timè MHC-II + epi li demontre ke ni ekspresyon CIITA ni prezans nan yon antijèn ki mare manbràn se ase poukont li ankouraje rekonesans dirèk nan selil timè pa CD{{115} } Selil T. Gen plis etid ki nesesè pou karakterize ki antijèn selil timè MHC-II+ yo kapab prezante dirèkteman nan ki kondisyon pou konprann konplètman wòl selil CD4+ T ki depann de kontèks yo nan kansè.
cistanche plant-ogmante sistèm iminitè
Metòd
Kilti selilè. TIL yo te rekòlte ak kiltive jan sa dekri deja (48). Yon ti tan, yo te diseke tisi timè prensipal yo an fragman 2-3 mm, yo te mete yo nan yon 24-plak byen epi yo te kiltive nan RPMI-1640 siplemantè ak 1{{102}}% serom AB imen, penisilin-streptomisin, HEPES, gentamicin, ak 6,000 IU/mL IL-2. TIL ekstravase yo te kiltive pa ranplasman mwatye medya chak 2-3 jou. Selil T imen prensipal ki soti nan san periferik yo te kiltive nan yon mwayen 50:50 ki gen ladan 50% AIM V plis 50% RPMI-1640 ak 10% serom AB imen, penisilin-streptomycin (100 U/). mL chak; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IU/mL IL-2, 5 ng/mL IL-7, ak 5 ng/mL IL-15. Pasyan ki sòti liy selil timè yo te pwodwi ak kiltive jan yo dekri deja (17). Yon ti tan, yo te koupe tisi timè prensipal yo an fragman ki pi piti pase 2 mm epi yo te disosye lè l sèvi avèk yon GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Selil timè yo te resuspend nan F-Media ki gen 5 μM Rho kinaz inhibitor ak plake sou yon kabann nan fibroblasts 3T3 iradyasyon (30 Gy). Apre kilti inisyal la, selil timè yo te pwopaje nan yon melanj 3:1 nan medyòm 3T3-kondisyone ak F-Media ki gen 5 μM Rho kinaz inhibitor. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L, ak B-LCL yo te konsève nan mwayen RPMI ki te konplete ak l-glutamin ak HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 mM piruvat sodyòm (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM asid amine ki pa esansyèl (Gibco, Thermo Fisher Scientific), ak penisilin-streptomycin (100 U/). mL chak; Gibco). Nou kenbe 293GP (ATCC) nan sipleman mwayen DMEM ak 10% FBS ak penisilin-streptomycin (100 U / mL chak; Gibco, Thermo Fisher Scientific). Selil IHW03304, GM3107, KAS011, D8, ak D66 yo te kado Alessandro Sette (La Jolla Institute for Immunology). ELISPOT esè. TIL oswa PBMC yo te plake nan 100,000 selil pou chak pi nan plak ELISPOT kouvwi ak antiIFN-Abs ({1-D1K, Mabtech). Selil yo te restimule ak HPV-16 E6 ak E7 PepMix (JPT) pisin peptide, pisin peptide ki reprezante mitasyon onkojenik chwazi, oswa ki endike peptides endividyèl nan 5 ug/mL pou pisin oswa 10 ug/mL pou peptides pou 22 èdtan anvan yo devlope. Plak ELISPOT dapre enstriksyon manifakti a (Mabtech). Pou yon kontwòl pozitif, yo te itilize 5 ug/mL phytohemagglutinin-L. Ex vivo ekspansyon kilti. PBMC yo te plake ak yon pisin peptide ki reprezante mitasyon onkojenik chwazi nan 5 ug/mL. Yo te ajoute nouvo mwayen ki gen 10 IU/mL IL-2 nan jou 4, 7, ak 10. Nan jou 14, yo te restimule PBMC yo pou yo itilize swa ELISPOT oswa tès sekresyon cytokine. TCR sekans. Yo te restimule TIL oswa PBMC yo ak 5 ug/mL HPV-16 E6 PepMix (JPT) oswa KRASG12V peptide, epi selil ki sekrete IFN yo te make fluorescent lè l sèvi avèk twous tès IFN-Sekresyon Imèn nan dapre enstriksyon manifakti a (Miltenyi Biotec) . Selil IFN- + sèl yo te klase nan yon plak 96-byen lè l sèvi avèk yon FACSAria (BD Biosciences) epi yo te fè RNA-Seq lè l sèvi avèk yon Illumina Miseq pou idantifye pè TCR ak chenn. Pou idantifikasyon E6-espesifik CD4+ TCR script, selil IFN--sekre yo te klase jan pi wo a epi sekans TCR ak TCR yo te anplifye pa PCR enbrike, multiplexed, jan sa te dekri deja (49). Pwodwi PCR yo te soumèt pou sekans Sanger (ETON Biosciences). Pou analiz frekans TCR, yo te voye PBMC anvan ak apre 14-jou eks vivo ekspansyon ak peptides endike yo bay Adaptive Biotechnologies. Analiz ekspresyon HPV. RNA yo te izole nan Hu-56 selil timè prensipal yo ak liy selil timè yo epi li te soumèt pou RNA-Seq an gwo. Lekti sekans nan fen pè yo te trase lè l sèvi avèk BWA (v0.7.12) (50) nan genòm HPV konplè (GenBank aksè non. NC_001526.2) ak transcriptome korespondan li yo. Fichye kat jeyografik aliyman sekans ki te lakòz yo te konvèti nan yon kat jeyografik aliyman binè ki klase epi li te endèks, ki te swiv pa konte lekti kat lè l sèvi avèk SAMtools (v1.2) (50). Sekans antye-egzom. Yo te fè sekans antye-egzom ak RNA-Seq nan Enstiti La Jolla pou Nwayo Sekans Imunoloji lè l sèvi avèk kaptire tout-ekzom Agilent ak twous Illumina, respektivman. Moores Cancer Center te distribye biospecimens FFPE bay Tempus pou pwochen jenerasyon sekans ansanm ak ADN referans matche lè l sèvi avèk echantiyon san periferik. Sekans lekti ki soti nan sekans exome nan timè a ak echantiyon nòmal yo te aliyen ak jenom referans GRCh38 lè l sèvi avèk SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Variant Exome yo te idantifye lè l sèvi avèk SpeedSeq Somatic, ak variants yo te anote lè l sèvi avèk SNPeff (v4.3i) (52). Done sekans RNA-Seq ak tout-ekzom pou maniskri sa a yo te telechaje sou NCBI BioProject, nimewo aksè PRJNA924789. Transdiksyon retroviral selil T. Sekans nukleotid TCR yo te sentèz ak klonaj nan zo rèl do retrovirus MSGV1 lè l sèvi avèk yon BioXP 3200 (Codex). Se sekans la te optimize kodon pou ekspresyon nan selil imen yo. Rejyon konstan TCR imen yo te echanje pou rejyon konstan TCR sourit ak sibstitisyon pou amelyore ekspresyon sifas yo ak ankouraje pè preferansyèl (53, 54). PBMC imen yo te izole nan manto buffy. Selil T CD4+ oswa CD{8+ yo te retire pa seleksyon mayetik, epi yo te kiltive fraksyon negatif ki genyen tout lenfosit ki rete yo nan yon mwayen selil T ak 50 ng/mL anti-CD3 Ab (OKT3) pou 2. jou.
Benefis cistanche tubulosa-Antitumor
TCR retroviral supernatant yo te pwodwi pa kotransfeksyon nan selil 293GP ak vektè MSGV1 ki gen sekans TCR ki enpòtan ak plasmid RD113. De jou apre transfeksyon, supernatant retroviral yo te rekòlte epi yo te itilize yo fre oswa nan frizè nan -80 degre. Transdiksyon yo te fèt sou plak ki kouvri ak RetroNectin (Takara), jan sa te dekri deja (5). Ekspresyon rejyon konstan TCR Murine te evalye pa sikometri koule pou detèmine efikasite transdiksyon. TCR-enjenieri selil T yo te itilize pa pi bonè pase jou 7 apre premye eksitasyon. Test fonksyonèl selil T. Nou fè ko-kilti 5 × 104 TIL, selil T transduit, oswa selil J76 Jurkat ak 1 × 105 B-LCL enpulsyonèl lannwit lan ak konsantrasyon endike nan peptide oswa 5 × 103 selil timè simen jou anvan an nan {{16} }byen U-anba oswa plat-anba plak, respektivman. Kote sa endike yo, yo te ajoute Abs anti-CD28 (klonaj CD28.2, BioLegend) oswa anti-PD-L1 (klonaj 29E.2A3, BioLegend) nan kokilti selil T ak timè nan 5 ak 10 ug/mL, respektivman. Pou cytokine ak tès makè aktivasyon, 1 × Cell Activation Cocktail (BioLegend) ki gen PMA ak ionomycin te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Pou etid bloke HLA, yo te ajoute 20 ug/mL Abs sa yo nan B-LCL ki enpulse peptide omwen 2 èdtan anvan adisyon selil T yo: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR. (L243, BioLegend), oswa kontwòl izotip IgG2a sourit (MOPC-173, BioLegend). Kote yo endike yo, selil timè yo te kiltive pou 72 èdtan ak 10 ng/mL IFN recombinant- anvan adisyon selil T yo. Supernatant yo te rekòlte apre 18-24 èdtan, IFN- te mezire pa ELISA (Thermo Fisher Scientific), ak granules selil yo te tache pou sikometri koule. Yo te fè tès sitotoksisite pa kokilti selil T ak selil timè yo nan rapò efèktè-a-sib ki endike yo. Yon ti tan, 5 × 103 selil timè yo te simen ak kiltive lannwit lan anvan yo ajoute selil T nan rapò ki endike yo. Liz selil sib yo te detèmine lè l sèvi avèk xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences), ki te evalye enpedans elektrik akòz aderans selilè chak 30 minit jouk nan fen eksperyans la. Done yo te analize lè l sèvi avèk pake lojisyèl xCELLigence RTCA, ak rezilta yo te rapòte kòm endèks selil nòmalize a 1 nan moman an lè selil T yo te ajoute. Tès prezantasyon MHC-II. Konstriksyon ADN sentetik ki kode sa ki annapre yo te pwodwi ak klonaj nan MSGV1 lè l sèvi avèk yon BioXP 3200 (Codex): N-terminal 25 asid amine nan jèn HLA-B imen an, ki te swiv pa 50 premye asid amine HPV-16 E6. oswa 25 asid amine nan KRASG12V kole ak 55 asid amine C-terminal nan HLA-B imen, yon eleman T2A oto-klivaj, ak sekans kodaj EGFP. Supernatant viral yo te pwodwi jan sa dekri pi wo a, ak B-LCL otològ yo te transdui sou plak RetroNectin-kouvwi apre eksitasyon lannwit lan sou yon kabann nan iradyasyon (0.5 Gy) selil 3T3 eksprime CD40L imen (3T3-CD40L). Efikasite transdiksyon te evalye pa kantite sikometri koule nan ekspresyon EGFP. Transduced B-LCL yo te ankouraje ak 3T3-CD40L nan prezans 200 IU/mL recombinant IL moun-4 (PeproTech) pou 2 jij siksesif 2-3 jou anvan kokilti ak TIL otològ. Jenerasyon DCs pou tès prezantasyon antijèn. DC yo te pwodwi lè l sèvi avèk metòd aderans plastik la. Yo te dekonjle PBMC ki nan frizè epi yo te plake yo nan mwayen DC (RPMI-1640 ak l-glutamin, 5% serom AB imen ki inaktive ak chalè, ak 100 U/mL chak penisilin-streptomisin) pou 2 èdtan nan 37 degre. Selil ki pa aderan yo te retire lè yo lave ak PBS cho, epi yo te kiltive selil ki aderan yo nan mwayen DC ak 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) ak 500 U/mL IL-4 (PeproTech) pou 6 jou. . Nou te ajoute 1 ug/mL KRASG12V peptide oswa 20 ug/mL KRASG12V oswa WT KRAS pwoteyin (Abcam) dirèkteman nan DCs frelikè lannwit lan. Nan denmen, DC yo te rekòlte ak cocultured ak TCR-enjenieri selil T nan yon rapò 1: 1 lannwit lan anvan yo evalye CD137 upregulation pa sikometri koule. Transdiksyon retroviral nan selil timè yo. Sekans kodaj CIITA imen an te sentèz (Teknoloji ADN entegre) ak klonaj nan MSGV1 pa Gibson Asanble. Sekans kodaj HLADRB5 * 01:01 ak chenn ki separe pa yon sekans P2A yo te sentèz (Teknoloji ADN entegre) epi yo te klonaj nan yon vektè lentiviral pHAGE modifye en nan yon sekans T2A ki te swiv pa yon sekans repòtè CD34 tronke pa Gibson Asanble. Supernatant retroviral yo te pwodwi ak MSGV1, jan sa dekri pi wo a. Supernatant lentiviral yo te pwodwi pa kotransfeksyon nan selil 293T ak plasmid pHAGE, tat, rev, gag/pol, ak vsv-g. Supernatant viral yo te kolekte 24 èdtan pita epi konsantre pa santrifugasyon nan tib Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). Selil timè yo te plake epi, 1 jou apre, yo te ranplase mwayen an ak supernatant retroviral oswa lentiviral ki te konplete ak 10 ug/mL polybrene. Kat èdtan apre, sipènatant ki gen viris la te aspire epi ranplase ak yon mwayen kilti. Selil timè MHC-II+ ak CD34+ yo te klase lè l sèvi avèk yon seri selil FACS Fusion (BD Biosciences). Sitometri koule. Selil yo te make ak fluorochrome-konjige monoklonal Abs nan antijèn sa yo: anti-moun CD3-PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC (Hit8a, Tonbo). , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend), ak anti-sourit TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Selil ki mouri yo te tache ak swa DAPI oswa LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–PE tetramer te rasanble epi make pa NIH Tetramer Core Facility. Selil yo te tache ak 1 ug/mL tetramer pou 1 èdtan sou glas. Ab tach pou antijèn sifas yo te fèt pou 15 minit sou glas. Pou tach intraselilè cytokine (ICS), selil T yo te cocultured ak peptide-pulsed APCs pou 4-6 èdtan nan prezans Brefeldin A. Selil yo te pèmeabilize ak tache pou cytokines intraselilè ak Twous Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) apre sifas tach. , dapre enstriksyon manifakti a. Yo te itilize Abs fluorochrome-konjige sa yo pou tach cytokine: IFN--APC (4S.B3, BioLegend), IL-2-FITC (MQ{1- 17H12, BioLegend), TNF--BV785 (Mab11). , BioLegend), ak Granzyme B-PE (QA16A02, BioLegend). Done yo te akeri ak yon sitomèt koule FACSCelesta (BD Biosciences) epi analize ak lojisyèl FlowJo v10.7. Estatistik. Analiz estatistik yo te fèt ak Prism 8 (GraphPad Software). Pou konparezon ICS, yo te itilize yon 2-tès t ki pa pè. Pou konpare HLA bloke Ab-Ab-medyatè repwesyon nan siyal selil T, yo te itilize yon 2-fason ANOVA. P <0.05 te konsidere kòm estatistik enpòtan. Apwobasyon etid. Yo te jwenn echantiyon imen ki idantifye yo itilize nan etid sa a anba konsantman enfòme atravè pwotokòl UCSD IRB 101391CX, "Tumor Environment Phenotype and Cell Isolation." Konsantman enfòme alekri te bay pa moun ki nan etid la.
Referans
1. Hanahan D, Weinberg RA. Karakteristik kansè: pwochen jenerasyon an. Selil. 2011;144(5):646–674.
2. Shamseddine AA, et al. Iminite timè ak imunoterapi pou kansè ki gen rapò ak HPV. Diskou kansè. 2021;11(8):1896–1912.
3. Simanshu DK, et al. Leading Edge revizyon RAS pwoteyin ak regilatè yo nan maladi imen. Selil. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. Yon repètwa poliklonal san atann nan selil T espesifik HPV yo pare pou aksyon nan pasyan ki gen kansè nan matris. Kansè Res. 2010;70(7):2707–2717.
5. Stevanović S, et al. Peyizaj nan antijèn timè imunojèn nan imunoterapi siksè nan kansè epitelyal viralman pwovoke. Syans. 2017;356(6334):200–205.
6. Bhatt KH, et al. Profile repons espesifik HPV-16-selil T yo revele gwo reyaksyon antijèn nan pasyan kansè orofarinj yo. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.
7. Veatch JR, et al. Selil T ki enfiltre timè BRAF V600E-espesifik CD4 + ki gen rapò ak repons klinik konplè nan melanom. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.
8. Veatch JR, et al. Selil T CD4+ andojèn yo rekonèt neoantigens nan pasyan kansè nan poumon, ki gen ladan mitasyon onkojenik frekan KRAS ak ERBB2 (Her2). Kansè Immunol Res. 2019;2(13):910–922.
9. Cafri G, et al. Selil T memwa ki vize mitasyon onkojenik yo detekte nan san periferik pasyan kansè epitelyal yo. Nat Commun. 2019;10(1):449.
10. Tran E, et al. Terapi transfè selil T ki vize mutan KRAS nan kansè. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.
11. Draper LM, et al. Sible selil kansè epitelyal HPV-16+ pa selil T ki fèt ak jèn TCR ki dirije kont E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.
12. Jin BY, et al. Selil T Enjenieri ki vize E7 medyatè regresyon nan kansè papillomavirus imen nan yon modèl murin. JCI Insight. 2018;3(8):e99488.
13. Bear AS, et al. Karakterizasyon byochimik ak fonksyonèl nan epitop KRAS mutan valide onkoprotein sa a pou vize iminolojik. Nat Commun. 2021;12(1):4365.
14. Oh DY, et al. Selil T intratumoral CD4+ medyatè anti-timè sitotoksisite nan kansè nan blad pipi imen. Selil. 2020;181(7):1612–1625.
15. Cachot A, et al. Selil T CD4 cytolytic ki espesifik pou timè yo se medyatè iminite pwoteksyon kont kansè imen. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.
16. Doran SL, et al. Terapi jèn reseptè T-selil pou kansè epitelyal ki asosye ak papillomavirus imen: yon etid premye nan imen, faz I/II. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.
17. Liu X, et al. Repwogram kondisyonèl ak ekspansyon alontèm nan selil nòmal ak timè ki soti nan biospecimens imen. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.
18. Veatch JR, et al. Neoantigen-espesifik CD4+ selil T nan melanom imen yo gen diferan eta diferan ak korelasyon ak CD8+ selil T, makrofaj, ak fonksyon selil B yo. Selil kansè. 2022;40(4):393–409.
19. Lowery FJ, et al. Siyati molekilè nan selil T antitumor neoantigen-reyaktif ki soti nan kansè imen metastatik. Syans. 2022;375(6583):877–884.
20. Kreiter S, et al. Ogmante efikasite prezantasyon antijèn nan kouple antijèn ak siyal trafik MHC klas I. J Immunol. 2008;180(1):309–318.
21. Zaretsky JM, et al. Mitasyon ki asosye ak rezistans akeri nan blokaj PD-1 nan melanom. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.
22. Gros A, et al. Rekonesans neoantigen kansè gastwoentestinal imen pa sikile lenfosit PD-1+. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.
23. Scholtalbers J, et al. TCLP: yon katalòg liy selil kansè sou entènèt ki entegre kalite HLA, neo-epitop prevwa, viris, ak ekspresyon jèn. Genomic Med. 2015;7(1):118.
24. Juneja V, Choi J, envantè; BioNTech US Inc., reprezantan. Reseptè selil T konstwi ak itilizasyon li. Patant US No US202103040215A1. 4 novanm 2021.
25. Sharpe AH, Pauken KE. Fonksyon yo divès nan chemen an inhibition PD1. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.
26. Abelin JG, et al. Defini pwosesis ligand HLA-II ak règ obligatwa ak espektrometri mas amelyore prediksyon epitop kansè. Iminite. 2019;51(4):766–779.
27. Silvius JR, et al. K-ras4B ak pwoteyin prenyl ki manke "dezyèm siyal" asosye dinamikman ak manbràn selilè. Mol Biol selil. 2006;17(1):192–202.
28. Chang CH, Flavell RA. Klas II transactivator kontwole ekspresyon plizyè jèn ki enplike nan prezantasyon antijèn. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.
29. Rodig SJ, et al. Pwoteyin MHC yo bay yon sansibilite diferans nan blokaj CTLA-4 ak PD-1 nan melanom metastatik ki pa trete. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.
30. Ahmadzadeh M, et al. Selil T regilasyon CD4+ imen ki enfiltre timè yo montre yon repètwa TCR diferan epi montre reyaksyon timè ak neoantigen. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.
31. Oliveira G, et al. Peyizaj la nan asistan ak regilasyon selil T CD4+ T nan melanom. Lanati. 2022;605(7910):532–538.
32. Rock KL, et al. Prezante tèt ou! Pa MHC klas I ak MHC klas II molekil. Tandans Immunol. 2016;37(11):724–737.
33. Takechi Y, et al. Yon pwoteyin manbràn melanosomal se yon sib sifas selil pou terapi melanom. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.
34. Lepage S, Lapointe R. Melanosomal vize sekans soti nan gp100 yo esansyèl pou MHC klas II-restriksyon prezantasyon epitop andojèn ak mobilizasyon nan konpatiman endosomal. Kansè Res. 2006;66(4):2423–2432.
35. Alspach E, et al. MHC-II neoantigens fòme iminite timè ak repons a imunoterapi. Lanati. 2019;574(7780):696–701.
36. Dengjel J, et al. Autophagy fè pwomosyon MHC klas II prezantasyon peptides ki soti nan pwoteyin sous intraselilè. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.
37. Matsuzaki J, et al. Yo egzije chemen pwosesis antijèn ki pa klasik yo pou rekonesans timè dirèk MHC klas II ki limite pa selil T espesifik NY-ESO-1- CD4+ yo. Kansè Immunol Res. 2009;2(4):341–350.
38. Höhn H, et al. CD4+ lenfosit ki enfiltre timè nan kansè nan matris yo rekonèt peptides HLA-DR ki gen restriksyon nan papillomavirus imen-E7. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.
39. Höhn H, et al. Papillomavirus imen tip 33 E7 peptides prezante pa HLA-DR * 0402 nan timè-enfiltre selil T nan kansè nan matris. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.
40. Lu YC, et al. Tretman pasyan ki gen kansè metastatik lè l sèvi avèk yon gwo konplèks istokonpatibilite klas II-restriksyon reseptè selil T ki vize antijèn jèm kansè MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.
41. Tran E, et al. Imunoterapi kansè ki baze sou selil T CD4+ ki espesifik pou mitasyon nan yon pasyan ki gen kansè epitelyal. Syans. 2014;344(6184):641–645.
42. Gonzalez-Galarza FF, et al. Mizajou 2020 baz done frekans alèl (AFND): klasifikasyon done estanda lò, done jenotip aksè ouvè, ak nouvo zouti rechèch. Asid nikleik Res. 2020;48(d1): D783–D788.
43. Schoenberger SP, et al. Èd selil T pou lenfosit T sitotoksik yo se medyatè pa entèraksyon CD40-CD40L. Lanati. 1998;393(6684):480–483.
44. Ahrends T, et al. Selil T CD4+ yo ede bay yon pwogram efèktè selil T citotoksik ki gen ladan reseptè reseptè koenibitè ak ogmante anvayi tisi yo. Iminite. 2017;47(5):848–861.
45. Ferris ST, et al. cDC1 prime epi selil T CD4+ yo gen lisans pou pwovoke iminite anti-timè. Lanati. 2020;584(7822):624–629.
46. Bos R, Sherman LA. CD4+ T-selil èd nan milye timè a nesesè pou rekritman ak fonksyon sitolitik CD8+ T lenfosit yo. Kansè Res. 2010;70(21):8368–8377.
47. Haabeth OAW, et al. CD4+ Selil T—medyatè rejè selil timè MHC II-pozitif yo depann de sekresyon antijèn ak prezantasyon endirèk sou APC lame yo. Kansè Res. 2018;78(16):4573–4585.
48. Dudley ME, et al. Jenerasyon kilti lenfosit ki enfiltre timè pou itilize nan terapi transfè adoptif pou pasyan melanom. J Immunother. 2003;26(4):332–342.
49. Dash P, et al. Analiz sèl-selil repètwa reseptè T-selil. Metòd Mol Biol. 2015;1343:181–197.
50. Li H, et al. Fòma aliyman/kat sekans ak zouti SAM. Bioenfòmatik. 2009;25(16):2078–2079.
51. Chiang C, et al. SpeedSeq: analiz ak entèpretasyon genomic pèsonèl ultra-rapid. Metòd Nat. 2015;12(10):966–968.
52. Cingolani P, et al. Yon pwogram pou annote ak predi efè polimorfism nukleotid sèl, SnpEff: SNPs nan genòm nan Drosophila melanogaster souch w1118; iso-2; iso-3. Vole (Austin). 2012;6(2):80–92.
53. Haga-Friedman A, et al. Enkòporasyon nan transmembrane mitasyon idrofob nan TCR a amelyore ekspresyon sifas li yo ak avidity fonksyonèl selil T. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.
54. Cohen CJ, et al. Aktivite antitumoral amelyore nan selil T ki fèt pou eksprime reseptè selil T ak yon dezyèm lyezon disulfid. Kansè Res. 2007;67(8):3898–3903.
