Klonaj molekilè ak karakterizasyon byochimik nan yon nouvo koumarin glikosiltransferaz CtUGT1 ki soti nan Cistanche Tubulosa

pou plis enfòmasyon:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

REZIME

UDP-glycosyltransferases (UGTs) se yon fanmi enpòtan ak fonksyonèl divès nan anzim ki enplike nan byosentèz metabolit segondè. Koumarin se youn nan vye zo eskèlèt pwodwi natirèl ak aktivite famasi kandida yo. Sepandan, jiska dat, anpil rapòte GTs soti nan plant sitou rekonèt flavonoid kòm aseptè sik. Sèlman limite GTs te kapab catalyse glycosylation coumarins. Nan etid sa a, yo te klonaj yon nouvo UGTCistanche tubulosa, yon bonjan zèb tradisyonèl tonik Chinwa, ki se abondan ak glikozid divès tankou glikozid fenylethanoid, glikozid lignan, ak glikozid iridoid. Aliyman sekans ak analiz filogenetik te montre saCtUGT1se filogenetik ki lwen pi fò nan UGT yo flavonoid rapòte ak adjasan a UGTs phenylpropanoid. Vaste nan vitro nzim essais te twouve ke byenkeCtUGT1pa te patisipe nan byosentèz la nan glikozid byoaktif nanCistanche tubulosa, li te kapab katalize glucosylation koumarins umbelliferone 1, esculetin 2, ak hymecromone 3 nan sede konsiderab. Pwodwi glycosylated yo te idantifye pa konparezon ak estanda referans yo oswa espektroskopi NMR, ak rezilta yo te endike keCtUGT1ka katalize regio-espesifikman glikozilasyon hydroxyl coumarins nan pozisyon C7- OH. Résidus kle ki te detèmineCtUGT1aktivite yo te plis diskite ki baze sou modèl omoloji ak analiz molekilè debakadè. Konbine ak rezilta mutagenezis ki dirije sou sit, li te jwenn ke H19 te jwe yon wòl iranplasabl kòm baz kataliz enpòtan.CtUGT1ta ka itilize nan preparasyon anzimatik nan glikozid kumarin bioaktif.

Mo kle:Plant glikosiltransferaz, glikozid koumarin,Cistanche tubulosa, Modèl Omoloji, Mutajenèz ki dirije sou sit

Klike sou pwodwi cistanche ekstrè benefis yo

Entwodiksyon

Glycosylation se youn nan kalite modifikasyon estrikti ki pi komen nan pwodwi segondè natirèl. Glycosylation ta ka chanje estabilite ak/oswa solubility nan aglycon la, ak kontribye anpil nan divèsite nan pwodwi natirèl / anòmal akòz kalite yo konjigezon miltip. Nan plant yo, reyaksyon sa yo anjeneral fèt pa glikosiltransferaz (UGT) ki depann de uridin difosfat (UDP), yon kalite anzim ki katalize transfè a nan pati monosakarid soti nan sik nukleotid aktive nan yon molekil aseptè glikosil ki ka yon idrat kabòn, glikozid, oligosakarid. , oswa yon polisakarid [1,2]

Jiska dat, anpil jèn ki kode UGT yo te izole nan plizyè plant [3]. Glycosylation a sitou te rive nan gwoup hydroxyl oswa gwoup carboxyl nan yon pakèt pwodwi segondè, tankou flavonoid [4], phenylpropanoids [5], terpenoids [6], estewoyid [7], alkaloid [8], ak sou sa. Koumarin yo se metabolit fenilpropanoid ki lajman distribiye nan anpil espès plant. Koumarin ki rive natirèlman yo souvan egziste kòm glikokonjige, ak dérivés sa yo ekspoze yon gwo spectre nan aktivite famasi, ki gen ladan antioksidan [9], antiviral [10,11], epatoprotective [12], anti-enflamatwa [13], anti-kansè [14]. ], antimutagenic [15], ak kolinesteraz (ChE) & monoamine oksidaz (MAO) aktivite inhibition [14,15], elatriye Sepandan, jiska dat, an konparezon ak UGT yo flavonoid ki pi souvan rapòte ak anpil envestige, se sèlman UGT yo limite. rapòte ke yo te kapab transfere moso sik nan koumarins [16-18].

Plant ki rich nan glikozid divès ta ka sèvi kòm yon pisin jèn ideyal nan UGTs ak aktivite kataliz roman. Anplis de sa, yo te rapòte anpil UGT yo posede konsiderab akseptè promiskuite pou katalize glikozilasyon plizyè substrats, kèk nan yo menm pa te separe nan plant yo [19]. Nan atik sa a, yon glycosyltransferase romanCtUGT1te idantifye soti nanCistanche tubulosa, yon zèb tradisyonèl medsin ki abondan ak glikozid divès tankou glikozid phenylethanoid (PhGs), glikozid lignan, ak glikozid iridoid. Ekspresyon eterològ ak karakterizasyon fonksyon demontre ke byenke recombinantCtUGT1pa t patisipe nan byosentèz sa yo glikozid nanCistanche tubulosa, li ka katalize glucosylation hydroxyl coumarins, ak reyaksyon regiospecifically te rive sou 7- pozisyon OH coumarins umbelliferone 1, eskalade 2, ak hymecromone 3 pou pwodwi twa pharmacologically aktif konpoze ekreme (1a), cichoriin (2a) , ak 4-methylumbelliferyl glikozid (3a) ak sede konsiderab, respektivman. Anplis de sa, benzophenone substrate 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), isoflavon substrate genistein (5), ak anthraquinone substrate aloe-emodin (6) ta ka aksepte tou paCtUGT1. Pwopriyete yo katalitik ak résidus kle souliye kapasite nan kataliz nanCtUGT1yo te evalye tou ki baze sou modèl omoloji, analiz AutoDock, ak mutagenezis ki dirije sou sit.

2. Eksperimantal

2.1. Materyèl plant ak pwodwi chimik yo

Cistanche tubulosate itilize nan etid sa a te kolekte nan zòn dezè nan Hetian, Xinjiang rejyon otonòm. Pwofesè Pengfei Tu nan Peking University te konfime idantite botanik yo. Koumarin yo teste ak lòt substrats nan etid sa a yo te achte nan men Sigma-Aldrich (St Louis, USA), Chengdu Push Biotechnology Co, Ltd (Chengdu, Lachin), ak Chengdu Biopurify Phytochemicals Co, Ltd (Chengdu, Lachin). ) sof si yo di otreman. Estanda referans nan ekreme (1a) ak cichoriin (2a) yo te achte nan men Wuhan Chem Faces Biochemical Co, Ltd (Wuhan, Lachin).

2.2. Klonaj molekilè nan CtUGT1 soti nan Cistanche tubulosa

RNA total deCistanche tubulosate extrait nan tij charnèl la lè l sèvi avèk yon Twous RNA Plant OMEGA (GA, USA) epi li transkri nan cDNA ak PrimeScript™ RT Twous reyaktif (TaKaRa, Japon) swiv enstriksyon manifakti a. Yon Jadendanfan dejenere te fèt pou 3′RACE ki baze sou sekans asid amine nan PSPG (Plant Secondary Product Glycosyltransferases) -bwat glycosyltransferases plant yo. 3′-fen ak 5′-fen anplifikasyon nanCtUGT1yo te pote soti lè l sèvi avèk Smart RACE cDNA Anplifikasyon Twous (Clontech, USA) dapre pwotokòl manifakti a lè l sèvi avèk primè (Tablo S1). ADNc plen longè nanCtUGT1te anplifye pa PCR lè l sèvi avèk KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Japon) ak pè jadendantè espesifik jenetik (Tablo S1) nan kondisyon sa yo: yon premye etap denaturasyon nan 94 ◦C pou 2 minit, ki te swiv pa 35 sik denaturasyon nan 98 ◦C pou 15 s, recuit a 55 ◦C pou 30 s, ak ekstansyon a 68 ◦C pou 55 s, ak yon etap final ekstansyon nan 68 ◦C pou 7 min. Tout fragman ADN yo jwenn yo te klonaj nan yon vektè pEASY-Blunt (TransGen Biotech, Lachin) ak sekans.

2.3. Sekans aliyman ak analiz filogenetik

Sekans aliyman nanCtUGT1ak glycosyltransferases rapòte (Tablo S2) te fè lè l sèvi avèk DNAMAN 4. 0 pake lojisyèl (Lynnon Biosoft, Kanada). Motif yo ak domèn yo te analize lè l sèvi avèk yon zouti domèn konsève (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi). Pyebwa filogenetik la te konstwi pa bootstrapping MEGA 7.0.14 lojisyèl lè l sèvi avèk metòd vwazen-joining la ak 1000 kopi bootstrap [20]. Sekans nan pwoteyin tradui nanCtUGT1te aliyen ak glikosiltransferaz plant li te ye yo depoze nan baz done NCBI GenBank (Table S3) ak ClustalW.

2.4. Ekspresyon eterològ ak pirifikasyon pwoteyin nan CtUGT1 nan Escherichia coli

Rejyon an kodaj nanCtUGT1te anplifye ak BamH I ak Non I kòm sit restriksyon lè l sèvi avèk primè yo montre nan Tablo S1. Reyaksyon PCR yo te fèt lè l sèvi avèk KOD-Plus-Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Osaka, Japon). Sekans yo jwenn yo te verifye pa klonaj nan vektè pEASY-Blunt (TransGen Biotech, Lachin). Pwodwi a anplifikasyon konfime nanCtUGT1te answit dijere ak sub-klone nan vektè ekspresyon pET-28a(plus) (Novagen, USA). Lè sa a, konstwi verifye a te transfòme nan E. coli Transetta (DE3) pou jwenn souch la recombinant. Kilti souch recombinant lannwit lan te vaksinen nan mwayen Luria-Bertani (LB) ki gen 50 ug⋅mL− 1 kanamycin ak 40 ug⋅mL− 1 chloromycetin nan yon rapò 1:1{{ 19}}0. Kilti yo te grandi nan 37 ◦C, 200 rpm jiskaske valè OD600 la rive nan 0.4-0.6. Isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) te ajoute imedyatman nan yon konsantrasyon final nan 0.5 mM ak selil yo te grandi pou 16 èdtan nan 18 ◦C, 180 rpm. Lè sa a, granules selil yo te rekòlte pa santrifugasyon (7600 × g, 10 min, 4 ◦C), ak re-sispann nan 3 mL / g tanpon lysis frèt (Done Siplemantè Remak 1), ak deranje pa sonication sou glas. Yo te retire debri selil la pa santrifujasyon nan 7600 × g, 4 ◦C pou apeprè 30 min. Yo te itilize yon kolòn Histrap pre-ekilibre (GE Healthcare, Upsala, Syèd) pou kwomatografi afinite dapre enstriksyon manifakti a. Pwoteyin recombinant la te elimine pa 10 volim kolòn tanpon elisyon (Remak Done Siplemantè 1) ki gen 250 mM imidazol. Pwoteyin pite te analize pa 10 pousan SDS-PAGE. Pwoteyin pirifye a te konsantre pa yon tib ultrafiltrasyon 30 kDa (Sigma-Aldrich, USA) ak desalated lè l sèvi avèk yon kolòn PD-10 (GE Healthcare, Uppsala, Syèd) ak tanpon desalting (Done siplemantè Nòt 1). Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine pa metòd Bradford lè l sèvi avèk BSA kòm yon estanda.

2.5. Esay aktivite anzimatik ak espesifik substra nan CtUGT1

Pou mennen ankèt sou aktivite glikozilasyonCtUGT1, tès anzim yo te fèt nan yon melanj reyaksyon (150 μL) ki konpoze de 0.4 mM aglikon, 0.8 mM UDP-glikoz (UDPG), ak 50 ug nan pirifye.CtUGT1pwoteyin nan tanpon desaling la. Tout reyaksyon yo te enkube a 30 ◦C pou 12 èdtan epi yo te fini lè yo ajoute 300 μL metanol frèt. Melanj yo te santrifuje nan 15,000 × g pou 30 min pou kolekte supernatant pou analiz HPLC-UV/ESI-MS. Twa tès paralèl yo te fè regilyèman pou chak reyaksyon. HPLC (Agilent 1260, USA) te ekipe ak yon detektè etalaj dyod ak yon kolòn CAPCELL PAK C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm; Shiseido, Japon) nan yon vitès koule 1 mL⋅min− 1, ak tanperati kolòn nan. te kenbe nan 30 ◦C. Faz mobil la se A (sa vle di, 0.1 pousan asid fòmik solisyon akeuz) ak B (sa vle di, asetonitrile). Pwogram gradyan yo te bay lis nan Tablo S4. Done HRESI-MS te anrejistre sou yon sistèm LCMS-IT-TOF, ekipe ak yon koòdone ESI (Shimadzu, Kyoto, Japon) ak ultra-wo pite Li kòm gaz la kolizyon, ak N2 kòm gaz la nebulizing. Paramèt sous ESI optimize yo te jan sa a: pousantaj koule gaz djenn, 1.5 mL⋅min− 1; to koule gaz oksilyè, 1.5 mL⋅min− 1; vòltaj espre, 4.5 kV; tanperati kapilè, 200 ◦C. Spectre yo te anrejistre nan ranje 100-1500 m/z pou yon analiz MS eskanè konplè.

2.6. Efè tan reyaksyon, valè pH ak tanperati sou aktivite anzim, ak etid sinetik CtUGT1.

Efè tan reyaksyon, valè pH, ak tanperati sou aktivite anzim nanCtUGT1yo te teste lè l sèvi avèk UDPG kòm donatè sik la ak 3 kòm akseptè sik la nan kondisyon reyaksyon yo jan sa dekri pi wo a. Pou detèmine pH optimal, yo te konpare aktivite anzim nan nan 100 mM tanpon (asid sitrik-sidyòm sitrat) ak valè pH ki sòti nan 3.0 rive 6.{{ 14}}, 10{{20}} mM tanpon (KH2PO4-K2HPO4) ak valè pH ki sòti nan 6.0 rive 8.{{29} }, 100 mM tanpon (Tris-HCl) ak valè pH varye ant 7.0 ak 9.0, 100 mM tanpon (Na2CO3-NaHCO3) ak valè pH yo varye ant 9.0 ak 11.0. Pou fè tès pou tanperati reyaksyon optimal, reyaksyon yo te enkube nan divès tanperati ki sòti nan 0 a 65 ◦C. Kou tan reyaksyon an te evalye nan 12 pwen tan diferan ant 0 ak 24 èdtan. Tout eksperyans yo te fèt an triple. Melanj reyaksyon yo te analize pa HPLC-MS jan sa dekri pi wo a. Pou etid sinetik deCtUGT1, yo te fè tès anzimatik nan yon volim final 100 μL ki gen 100 mM KH2PO4-K2HPO4 tanpon (pH 8.0), 25 ug pirifye.CtUGT1, 3 mM nan UDPG, ak divès kalite konsantrasyon (50-3000 μM) nan 3. Reyaksyon yo te fèt nan 37 ◦C pou 30 min ak Lè sa a, sispann ak 100 μL glas-frèt metanol. Tout reyaksyon sa yo te fèt an triple, ak aktivite anzim yo te evalye atravè quantification de dérivés glucosylated korespondan yo. Paramèt sinetik, ki gen ladan konstan Michaelis-Menten (Km) ak Vmax, yo te kalkile pa analiz regresyon ki pa lineyè lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism 5.

2.7. Substra ak selektivite donatè sik nan CtUGT1

Pou eksplore preferans substrate yoCtUGT1, yo te teste yon total de 27 substrats ki fè pati diferan kalite estriktirèl lè l sèvi avèk UDPG kòm donatè a. Yo te bay enfòmasyon chimik yo nan Tablo S5, epi yo te montre estrikti yo nan Fig. S1 ak S2. Pou mennen ankèt sou selektivite donatè sik nanCtUGT1, tès yo te fèt lè l sèvi avèk umbelliferone (1), esculetin (2), hymecromone (3), 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), genistein (5), ak aloès-emodin (6) kòm substrats ak UDPG, UDP- N acetyl galactosamine, UDP-galaktoz, GDP-manoz, GDP-fucose, UDP galacturonic asid, UDP-rhamnose kòm donatè sik, respektivman. Tout eksperyans yo te fèt an triple. Melanj reyaksyon yo te analize pa HPLC-MS jan sa dekri pi wo a.

2.8. Preparasyon 4-methylumbelliferyl glikozid (konpoze 3a) pa CtUGT1

Melanj reyaksyon preparasyon an fèt nan {{0}}.034 mmol substra konpoze 3, 0.04 mmol UDPG, 5 mg pirifyeCtUGT1nan 50 mL tanpon reyaksyon. Reyaksyon yo te dousman ajite nan kondisyon yo pi gwo (100 mM KH2PO4-K2HPO4 ak pH 8.0; 37 ◦C). Apre enkubasyon nan 37 ◦C pou 24 èdtan, sipènatant reyaksyon an te separe pa kolòn chromatografi ak résine macroporous (MCI GEL CHP) apre santrifuje nan 12, 000 × g pou 30 min. Faz mobil lan se te yon elisyon gradyan nan 100 pousan dlo a 100 pousan metanol. Chak fraksyon te analize pa HPLC-UV. Fraksyon ki genyen sèlman pwodwi vize yo te evapore nan sechrès anba presyon redwi ak karakterize pa 1H nikleyè sonorite mayetik (NMR) spèktroskopi ak 13C NMR spèktroskopi.

2.9. Docking molekilè ak mutajenèz ki dirije sou sit nan CtUGT1

Modèl pwoteyin nanCtUGT1te etabli lè l sèvi avèk SWISS-MODEL [21-25]. Estrikti kristal Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) te chwazi kòm estrikti modèl [26]. Modèl etabli a te evalye pa VERIFY-3D [27,28]. Auto-Dock Vina te itilize pou etid molekilè debakadè [29]. Estrikti kristal UGT74F2 [30], yon glycosyltransferase ki soti nan Arabidopsis thaliana, nan konplèks ak ligand UDP ak asid salisilik (PDB ID 5U6M) te itilize kòm estrikti kontwòl pou pòch donatè sik ak analiz pòch akseptè sik, respektivman. . Yo te itilize Auto-Dock-Tools 1.5.6 ki soti nan MGLTools (Molecular Graphics Laboratory tools) pou prepare UDPG donatè sik ak substrate 1, 2 pou molekilè debakadè. Chenn bò kote rezidi alantou kavite aktif-sit la te fikse fleksib, epi lyezon yo wotasyon nan ligand yo te kite gratis Thorne. Poz nan tèt-klase jan yo jije pa modèl la debakadè Vina ak pi gwo afinite (kcat / mol) te sibi analiz vizyèl lè l sèvi avèk lojisyèl PyMOL 2.0.

Pou envestigasyon mutagenezis, sekans optimize jèn nanCtUGT1(Done siplemantè Remak 2) te sentèz ak teste kòm kalite sovaj la. Sit-dirije mutagenezis nanCtUGT1te fèt lè l sèvi avèk Fast Mutagenesis System (TransGen Biotech). Mutan yo te anplifye apati modèl jèn optimize a ki te konstwi nan pET-28yon vektè lè l sèvi avèk primè espesifik yo montre nan Tablo S1. Konstwi mutan yo te verifye pa PCR ak sekans anvan yo te transfòme nan E. coli (DE3) pou ekspresyon eterològ. Pirifikasyon pwoteyin ak reyaksyon anzim yo te fè ak analize jan sa dekri pi wo a.

3. Rezilta ak diskisyon

3.1. Full-length cDNA klonaj nan jèn nan CtUGT1 soti nanCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) se yon tradisyonèl zèb medsin Chinwa pwodwi yon gran varyete glikozid natirèl byoaktif. Ta dwe gen yon kantite konsiderab nouvo jèn glycosyltransferases ki te egziste nan genomic li yo. Pou chèche nouvo glikosiltransferaz ak aktivite kataliz enteresan, yo te fèt yon premye dejenere pou 3′-RACE ki baze sou motif PSPG konsève pou klonaj UGTs tolerans soti nan.Cistanche tubulosa. Yo te jwenn sekans nan fen 3′ plis analize pa eksplozyon NCBI ak Jadendanfan espesifik pou 5′-RACE te fèt ki baze sou sekans yo jwenn. Anplifye 5 'cDNA bout yo ak 3' cDNA bout yo te splised ak tout longè a nanCtUGT1sekans, ki gen ladan 1739 nukleotid, yo te jwenn (Fig. S3) ak ki nan lis nan done siplemantè Remak 3. Imedyatman, yon ankadreman lekti ouvè (ORF) nanCtUGT1Zouti NCBI ORF Finder te jwenn ak sekans kodaj 1482 bp yo te klonaj avèk siksè pa anplifikasyon RT-PCR lè l sèvi avèk primè espesifik nan Tablo S1. Yo te soumèt sekans cDNA CtUGT1 bay NCBI (asansyon nimewo MW629113).

3.2. Analiz sekans ak ekspresyon eterològ nan CtUGT1

LaCtUGT1jèn te espere kode yon pwoteyin nan 493 résidus asid amine ak yon mas molekilè estime nan 55.78 kDa. NCBI eksplozyon te revele ke sekans nan pwoteyin dedwi nanCtUGT1pataje idantite ki pi wo a (76.39 pousan) ak UGT86A1-tankou anzim yo. Fonksyon byochimik sa a kalite anzim pa te konplètman karakterize. Yo prevwa ke yo ka patisipe nan adaptasyon plant nan estrès abyotik. Figi S4 montre aliyman sekans asid amine CtUGT1 ak lòt glikosiltransferaz plant yo.

Trè konsève 44 résidus nan motif PSPG yo te jwenn nan C-tèminal la nanCtUGT1. Nan bwat PSPG la, yon sekans peptide HCGWNS te lokalize nan 373rd asid amine, ki te detekte nan 95 pousan nan tout glycosyltransferases [31]. Rezid final la nan motif PSPG te glutamin, ki endike ke anzim sa a gen tandans sèvi ak UDPG kòm donatè sik li yo [32] (Fig. S4). Pye bwa a filojenetik te konstwi baze sou sekans polypeptide prevwa aCtUGT1ak diferan kalite glikosiltransferaz orijin plant ki te enplike nan byosentèz divès metabolit segondè. Jiskaprezan, pi fò nan glikosiltransferaz yo rapòte nan plant yo rekonèt flavonoid kòm substrats yo, tankou flavon 7-O-glycosyltransferases, flavonoid 3-O-glucosyltransferases, izoflavon 7-O-glycosyltransferases, ak chalcone glycosyltransferases. Rezilta analiz filogenetik te montre saCtUGT1pa te gwoupe nan clade nan flavonoid GTs. Olye de sa, li sitiye adjasan a UGT74T1 ak UGT74S1 (lignan glycosyltransferases soti nan Linum usitatissimum) ak NtGT2 (yon koumarin glycosyltransferase soti nan Nicotiana tabacum), ki endike keCtUGT1ka gen kèk aktivite kataliz roman nan direksyon substrats phenylpropanoid (figi 1), espesyalman konsidere ke sèlman manm limite yo te idantifye fonksyonèl ki fè pati sa yo clades.

Pou plis revele aktivite catalyse li, laCtUGT1sekans te eksprime anba kontwòl pwomotè T7 lac nan selil E. coli Transetta (DE3) kòm pwoteyin fizyon ki make His6-. Rekonbinan ki make li aCtUGT1te pirifye avèk efikasite nan omojeneite pa Ni-NTA kwomatografi afinite. Pwa molekilè CtUGT1 recombinant pirifye a te apeprè 55 kDa (figi S5), ki konsistan avèk mas molekilè prevwa a.

3.3. Espesifik substra aseptè nan vitro CtUGT1

Pou teste aktivite glikozilasyon anCtUGT1, an vitro tès anzimatik yo te fèt. UDPG te itilize kòm donatè sik la. Akseptè sik yo te chwazi ki baze sou enkyetid diferan. Premyerman, laCtUGT1jèn te klonaj soti nanCistanche tubulosaki gen prensipal eleman chimik yo se PhG. Pou verifye siCtUGT1ki enplike nan biosentèz PhGs, aglycones komen PhGs nanCistanche tubulosatankou tyrosol (NP1, Fig. S2) ak salidroside (NP2, Fig. S2) yo te premyèman chwazi kòm substrats. Malerezman, analiz HPLC ak HRÈSI-MS pa t 'jwenn okenn pwodwi glycosylated, ki endike keCtUGT1pa ka patisipe nan byosentèz PhG yo.

Dezyèmman, ki baze sou aliyman an sekans ak rezilta analiz filogenetik (figi 1),CtUGT1te gen rapò filogenetik ak lignanoid ak koumarin glycosyltransferases, ki sijere keCtUGT1se pwobableman yon phenylpropanoid glycosyltransferase. Pou verifye prediksyon sa a, yo te teste twa substrats koumarin 1, 2, ak 3 ansanm ak yon sèl substrate lignanoid magnolol NP17 kòm aseptè sik, respektivman. Chalè-inaktive anzim (100 ◦C, 10 min) yo te itilize kòm yon kontwòl negatif. HPLC-HRESI-MS analiz de reyaksyon lè l sèvi avèk NP17 kòm substra pa t jwenn okenn pwodwi. Kontrèman,CtUGT1te montre evidan glucosylation kapasite kont substrats koumarin yo teste (1,2,3). Sèvi ak substra 1 kòm yon egzanp, jan yo montre nan Fig. 2A, yon nouvo pik (1a) ak yon tan retansyon diminye (11.46 min) konpare ak sa yo ki nan substra 1 (19.75 min) te pwodwi paCtUGT1nan yon sede de 37.78 pousan. Spectre absòpsyon UV li koresponn ak 1. Spectre HRESI-MS te montre ke pik 1a te montre yon [M plis H] plis nan m/z 325.1029, ak yon [M plis Na] plis nan m/z 347.0710 (kalkid. 347.0737 pou C15H16O8Na). ) ak fòmil la prevwa nan C15H16O8, ki te 162 amu pi gran pase sa yo ki nan 1 ak ki konsistan avèk fòmil la teyorik nan yon pwodwi glucosylated (Fig. 2A). Menm jan an tou, pwodwi glucosylated nan substra 2 (14.21 min, Fig. 2B) ak 3 (21.92 min, Fig. 2C) te jwenn tou nan tan an retansyon nan 10.85 min ak 13.80 min, ak pousantaj la konvèsyon nan 22.03 pousan ak 68.67 pousan. , respektivman. Mas la molekilè nan pwodwi yo matche ak mas la kalkile nan pwodwi glucosylated egzakteman, ki konfime saCtUGT1kapab katalize glikozilasyon konpoze koumarin 1-3 (Tablo 1).

Imedyatman, lè nou konsidere ke pi fò nan anzim yo te rapòte dènyèman te montre promiskuite kataliz nan vitro, pou plis eksplore spectre substra a.CtUGT1, tès anzim awogan yo te fèt nan direksyon pou divès konpoze ki fè pati diferan kalite pwodwi natirèl, ki gen ladan flavonoid, konpoze fenolik, koumarin, stilbene, anthraquinones, benzophenone, naftalèn, ak iridoid (figi S1-S2), lè l sèvi avèk UDPG kòm donatè sik la. Li te jwenn ke benzophenone substrate 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), isoflavon substrate genistein (5), ak anthraquinone substrate aloe-emodin (6) te kapab tou katalize paCtUGT1pou fòme korespondan pwodwi glucosylated 4a, 5a, 6a ak pi wo polarite (figi 3). Analiz HRESI-MS te montre ke pik ion yo nan pwodwi yo te tout 162 amu pi gran pase sa yo ki nan substrats yo, sijere keCtUGT1ta ka katalize glikosilation konpoze sa yo pou fòme pwodwi mono glucoside korespondan yo. Pousantaj konvèsyon 4, 5 ak 6 yo te 4.12 pousan, 14.14 pousan ak 23.33 pousan, respektivman (Tablo 1).

Selektif donatè sik la nanCtUGT1te eksplore tou. Anplis UDPG, yo te teste sis lòt donatè, ki gen ladan UDP-N-acetyl galactosamine, UDP galaktoz, GDP-manoz, GDP-fucose, UDP-galacturonic asid, ak UDP rhamnose, yo te teste lè l sèvi avèk substrats 1-6 kòm akseptè. Rezilta yo te montre saCtUGT1sèlman chwazi UDPG kòm donatè sik la. Pa gen okenn pwodwi obsève lè lòt sik aktive yo te teste (done yo pa montre).

3.4. Pwopriyete byochimik ak paramèt sinetik nan CtUGT1

Pwopriyete byochimik nanCtUGT1yo te envestige lè l sèvi avèk 3 kòm akseptè sik la ak UDPG kòm donatè sik la jan sa endike nan Fig. 4. Aktivite kataliz.CtUGT1te teste nan yon seri tanperati nan 4-6 0 ◦C, aktivite optimal la te detekte nan 37 ◦C (Fig. 4A). Analiz aktivite anzim ant pH 3.0 ak 9.0 te montre ke valè pH optimal la te obsève nan pH 8.0 (100 mM tanpon KH2PO4-K2HPO4, Fig. 4C). Sede pwodwi glucosylation 3a a te ogmante lineyè nan 1 h ak to kwasans lan te nivelman apre 5 h (figi 4B). Valè Km aparan nanCtUGT1pou 3 te 218.7 ± 7.176 μM, ak Vmax te 0.{02255 ± 0.0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. Preparasyon anzimatik ak idantifikasyon estriktirèl nan pwodwi glucosylated

Dapre rezilta tès anzim yo,CtUGT1gen tandans pou yon glucosyltransferase espesifik ki te kapab catalyse glucosylation diferan kalite pwodwi natirèl. Enfòmasyon HPLC-HR-MS sou pwodwi yo te rezime nan tablo 1. Pami yo, substrats coumarins te montre yon pousantaj konvèsyon konsiderab. Aktivite anzim kont koumarin yo te analize pi lwen. Li ta dwe remake ke tout twa substra koumarin teste aksepte paCtUGT1gen yon gwoup idroksil nan pozisyon C-7, pandan y ap eskletin (2) gen yon gwoup idwoksil siplemantè nan pozisyon C-6. Pwofil HPLC nan pwodwi glucosylated nan esculetin montre nan Fig. 2. Yo te obsève sèlman yon sèl pwodwi, sijere ke reyaksyon an glikosilation regiospecifically te rive nan pozisyon C-6 oswa C-7. Pou konfime sit la glikozilasyon, yo te idantifye pwodwi 2a pa konparezon ak glikozid natif natal yo pa analiz HPLC-UV/HRESI-MS. Lè yo ajoute cichoriin glukozid natif natal (glucosylated sou pozisyon 7-OH nan 2) nan sistèm reyaksyon an, pik la sipèpoze ak 2a, pwofil ko-HPLC plis konfime ke pwodwi glycosylated nan 2 katalize paCtUGT1se cichoriin [33], ki te pwouve ke yo te espesyalman transfere glucosyl nan pozisyon C7-OH. Pwodwi 1a te idantifye tou pa konparezon ak estanda referans la. Spectre UV-HPLC ansanm ak analiz ko-HPLC (figi 2) te revele ke estrikti chimik 1a te atribiye kòm ekreme [34], ki se pwodwi glucosylated 1 sou pozisyon C7-OH.

Pwodwi 3a te prepare nan yon reyaksyon echèl-up ak estriktirèl karakterize pa HRESI-MS, 1H NMR, ak 13C NMR espektroskopi (figi S13, S14, ak Nòt 4). Nan siyal 1H RMN a, konpare ak substra 3, yon siyal idroksil fenolik nan pozisyon C{{10}} te disparèt, epi siyal kabòn C-7 te deplase δ 1.{{25} } ppm nan jaden segondè a, pandan y ap siyal C{-6 ak C{-8 deplase nan jaden ki ba a nan 13C RMN. Konklizyon sa yo te konfime ke rezidi glucopyranosyl la te tache ak gwoup idroksil fenolik nan pozisyon C-7 3 [35]. Anplis, spectre 1H RMN te montre siyal proton anomerik nan δH 5.00 (1H, d, J=7.0 Hz); eleman sik la te endike yo dwe -D-glucopyranose. Rezilta sa a demontreCtUGT1se yon O-glucosyltransferase koumarin ki katalize glikozilasyon hydroxyl kumarin nan pozisyon 7-OH.

3.6. Modèl omoloji, debakadè molekilè, ak mutagenezis ki dirije sou sit nan pwoteyin CtUGT1

Reyaksyon anzim vaste devwale saCtUGT1te kapab katalize glikozilasyon twa koumarin nan pwodwi glikozile korespondan yo, epi pozisyon glikozile a te rive espesyalman nan pozisyon 7- OH. Pou idantifye résidus kle ki te detèmine aktivite catalyse deCtUGT1, modélisation omoloji, molekilè debakadè, ak sit-dirije envestigasyon mutagenesis nan CtUGT1 yo te fèt. Modèl molekilè omològ pou CtUGT1 te etabli lè l sèvi avèk SWISS-MODEL [21-25]. Estrikti kristal Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), detèmine nan yon rezolisyon 2.1 Å, te montre pi gwo nòt total ak omoloji sekans maksimòm ak yon valè E ki ba, yo te chwazi kòm estrikti modèl [26]. Evalyasyon rationalité modèl etabli a te montre nan Ramachandran trase (Fig. S6), 88.5 pousan de résidus nan modèl etabli yo nan rejyon ki pi favorize. Modèl omoloji CtUGT1 konsiste de de menm jan an Rossmann-kalite pliye motif nan N- ak C-tèminal, respektivman (Fig. 5A). Domèn N-tèminal la gen sèt fèy fèy paralèl ki ozalantou pa dis elis. Domèn C-tèminal la gen sis fèy ki antoure pa nèf elis (figi 5A, S7).

Pou plis klarifye pòch aktif nanCtUGT1, molekilè debakadè te fèt. Depi UGT85H2 sèlman gen estrikti nan fòm apo, yon lòt homolog UGT74F2 ak tou de UDP ak asid salisilik kòm de ligand yo te chwazi kòm modèl la kontwòl. UDPG la te prepare kòm donatè sik la. De substra koumarin 1 ak 2 yo te prepare kòm akseptè sik yo respektivman. Sit obligatwa donatè ak akseptè glycosyl yo te kalkile epi anbake separeman jan yo montre nan Fig. 5. Rezilta yo te endike ke tou de de pòch obligatwa yo sitiye andedan fann nan gwo twou san fon nan zòn nan entèraksyon nan domèn nan N-tèminal byen chaje ak C. -tèminal domèn nanCtUGT1ak espasyal pre youn ak lòt (Fig. 5A). C-tèminal la nanCtUGT1se sitou patisipe nan kontak ak donatè a glycosyl jan sa dekri nan UGTs lòt plant ', ak pi fò nan résidus ki antoure yo se idrofil ak trè konsève. Tankou tipik PSPG-bwat la, rezidi W377 nan motif sa a ta ka fòme lyezon idwojèn ak gwoup glikoz nan UDPG (Fig. 5B); N378 ak S379 nan motif sa a te kapab fòme lyezon idwojèn ak gwoup difosfat UDPG (figi 5B). Anplis de sa, dapre rezilta debakadè yo, résidus W356 ak Q359 ka kominike avèk gwoup uridine atravè entèraksyon kosyon idwojèn pou estabilize donatè a nan pòch aktif la. Pou verifye fonksyon sa yo prevwa résidus kle yo, yo te chwazi yon total de 16 sit epi yo te sibi mutajenèz analiz alanin. Aktivite kataliz mutan sa yo te teste lè l sèvi avèk tout sis substrats pozitif mansyone pi wo a. Analiz HPLC te montre ke, lè résidus G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397, ak D398 te mitasyon nan alanin, aktivite nan glikosilation nan pwoteyin. totalman pèdi nan direksyon pou tout substrats teste yo. Rezilta sa yo sigjere ke 16 résidus ki pi wo yo se résidus kle ki detèmine obligatwa donatè UDPG la ak aktivite glikozilasyon an.CtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 pousan) tankou V14, V132, E153, T212, ak I209 (Fig. S8). Li prevwa ke sa yo résidus idrofob ki antoure bag la aromat ta ka fòme van der Waals entèraksyon ak substra a nan pòch la obligatwa.

4. Diskisyon

Glikozilasyon se youn nan etap modifikasyon ki pi enpòtan nan chemen biosentèz anpil metabolit segondè yo. Glycosylation ta ka ogmante byodisponibilite nan pwodwi natirèl pa amelyore solubility dlo yo ak diminye toksisite yo. Koumarin konsidere kòm fòm ki pi senp nan yon gwo klas de sibstans fenolik natirèl ki fèt ak yon bag -pyrone fusion ak yon bag benzèn. Tou de konpoze ki baze sou koumarin natirèl ak sentetik te atire anpil atansyon nan men famasi medsin ak syantis konsepsyon dwòg kòm yon konsekans divès kalite farmakolojik ak byolojik pwopriyete yo [36]. Pli lwen glycosylated modifikasyon nan koumarins ta ka ede anrichi divèsite estriktirèl nan konpoze sa yo epi tou amelyore solubility yo ak byodisponibilite. Nan plant, tankou yon pwosesis glikozilasyon katalize pa UDP-glycosyltransferase. Malgre ke plizyè UGT yo te idantifye nan diferan plant, nan dat, pi fò nan UGT yo rapòte yo te patisipe nan modifikasyon glikozile nan flavonoid. Sèlman limite UGT yo te rapòte pou kapab aksepte coumarins kòm substrats. Nan etid sa a, yon nouvo jèn glycosyltransferaseCtUGT1te klonaj soti nan zèb tradisyonèl Chinwa aCistanche tubulosa. Aliyman sekans ak rezilta analiz filogenetik te montre saCtUGT1se filogenetik ki lwen pi fò nan UGT yo flavonoid rapòte, ak anpil pre UGTs phenylpropanoid. Egzamen anzim anpil te revele ke CtUGT1 pa t 'kapab katalize glycosylation nan konpoze phenyl etanòl yo fòme PhGs, ki se eleman chimik prensipal la nan.Cistanche tubulosa. Olye de sa, li te kapab rekonèt koumarins kòm substrats li yo, epi fè reyaksyon an glikozilasyon. Elucidation èstrikti pwodwi yo te montre ke sit glycosylation catalysée paCtUGT1regiospecifically te rive nan pozisyon C7-OH nan koumarins. Lè l sèvi avèk CtUGT1, twa glikozid koumarin ki gen ladan ekreme (1a), cichoriin (2a), ak 4-methylumbelliferyl glikozid (3a) te anzimatik sentèz ak estriktirèl idantifye. Tout twa konpoze sa yo te rapòte kòm molekil pharmaceutique aktif. Pou egzanp, 1a te konsidere kòm posede divès kalite aktivite famasi, ki gen ladan aktivite renoprotective, anti-enflamatwa, anti-kansè, ak pwopriyete anti amoebic [37]. 2a te montre gwo aktivite anti-bakteri kont kèk bakteri Gram-pozitif tankou Bacillus cereus ak Staphylococcus aureus [38]. 3a ka ede plant yo amelyore kapasite repons yo nan pwodui chimik ak toksin [39].

Anplis de koumarins, anpil tès anzim te jwenn saCtUGT1te montre tou aktivite glucosylation obsèvab nan direksyon benzophenone substrate 4, izoflavon substrate 5, ak anthraquinone substrate 6, ki endike ke CtUGT1 gen sèten tolerans substrate. Poutan,CtUGT1pa t 'kapab katalize byosentèz la nan konpozan glikozid nanCistanche tubulosatankou glikozid phenylethanoid (PhGs), glikozid lignanoid, ak glikozid iridoid. Anplis de sa, dapre envestigasyon anvan yo, pa gen okenn glikozid kumarin ki te izole nanCistanche tubulosa. Se konsa, fonksyon an vivo nanCtUGT1toujou bezwen plis eksplore. Aktivite glucosylation nan CtUGT1 nan direksyon pou substrats koumarin fè anzim sa a yon zouti itil pou modifikasyon nan glycosylation anzimatik nan koumarin ak tou endike ke ke plant segondè anzim metabolik te kapab fè aktivite enestimab kataliz ki byen lwen pi lwen pase fonksyon natif natal yo.

Deklarasyon enterè konpetisyon

Otè yo deklare ke pa gen okenn konfli enterè.

Rekonesans

Travay sa a te finansyèman sipòte pa Beijing Syans Natirèl Fondasyon (Grant No. 7192112); Pwogram parennaj Young Elite Scientists pa CAST (sibvansyon No. CACM− 2018− QNRC1− 02); Fondasyon Nasyonal Syans Natirèl Lachin (Grant No 81402809); Lachin Bousdetid Konsèy Eta Bousdetid Fon (sibvansyon No. 201906555010) ak Fondasyon Syans pou Elit Young Scholars nan Beijing University of Chinese Medicine (sibvansyon No. 2018-JYB-XJQ006).

Anèks A. Done siplemantè

Ou ka jwenn done siplemantè nan atik sa a sou entènèt nan https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

Soti nan: ' Molekilè klonaj ak karakterizasyon byochimik nan yon nouvo koumarin glikosiltransferazCtUGT1soti nanCistanche tubulosa'paXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

Referans

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Filogenetic analiz de UDPglycosyltransferase multigene fanmi Arabidopsis thaliana, J. Biol. Chem. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: mutant glycosidases for oligosaccharide sentèz, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Biosentèz sik etranj ak glikodiversifikasyon pwodwi natirèl, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Avans sou glikozilasyon nan vivo ak in vitro nan flavonoid, Appl. Microbiol. Biotechnol. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Molekilè klonaj ak karakterizasyon UDP-glikoz: temèt benzenoid / phenylpropanoid glucosyltransferase nan flè petunia, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases soti nan plant, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Eksplore siyifikasyon fonksyonèl sterol glycosyltransferase anzim, Prog. Res lipid. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, Glukosyltransferase alkaloid esteroyid prensipal la nan pòmdetè, Fitochimi. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Aktivite antioksidan nan limonoid Citrus, flavonoid, ak koumarin, J. Agric. Manje Chem. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, aktivite antiviral angelisin kont gammaherpesvirus, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, Dérivés ki baze sou Koumarin ak aktivite ki pisan anti-VIH, Fitoterapia. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Aktivite antioksidan ak potansyèl hepatoprotective Cedrelopsis grevei sou sipèmetrin pwovoke estrès oksidatif ak domaj nan fwa nan sourit gason, BMC Konpleman. altènatif. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Coumarin: a potential nucleus for anti-inflammatory molecules, Med. Chem. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, Dérivés Coumarin kòm ajan antikanse pou terapi kansè nan poumon: yon revizyon, Anti Cancer Agents Med. Chem. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Koumarin: yon echafodaj natirèl, privilejye ak versatile pou konpoze bioaktif, Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/molecules23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, klonaj ak karakterizasyon yon glucosyltransferase ki reyaji sou 7-group hydroxyl nan flavonol ak 3-hydroxyl gwoup kumarin soti nan selil tabak, Arch. Byochim. Biophys. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Biosentèz glikozid koumarin pa rasin cheve transjenik Polygonum multiflorum, Biosci. Biotechnol. Byochim. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Molekilè klonaj ak karakterizasyon koumarin glucosyltransferase nan rasin cheve nan Pharbitis nil (Ipomoea nil), Plant Tisi Cult. Lett. 31 (2014) 21-28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, karakterizasyon molekilè ak estriktirèl nan yon Cglycosyltransferase promiscuous soti nan Trollius Chinensis, Angew. Chem. Ent. Ed. Eng. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: molekilè analiz jenetik evolisyonè vèsyon 7.0 pou pi gwo datasets, Mol. Biol. Evol. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, SWISS-MODEL: modèl omoloji nan estrikti pwoteyin ak konplèks, Nucleic Acids Res. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Otomatik konparatif pwoteyin estrikti modèl ak SWISS-MODEL ak Swis-Pdb visualiseur: yon pèspektiv istorik, Electrophoresis 30 (2009) S162-S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, The SWISS-MODEL repository-new features and functionality, Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo-distans kontrent aplike sou estimasyon kalite modèl, Bioinformatics. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, Modeling pwoteyin estrikti kwatènè nan homo- ak hetero-oligomers pi lwen pase entèraksyon binè pa omoloji, Sci. Rep. 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, estrikti Crystal nan Medicago truncatula UGT85H2-aperçu sou baz estriktirèl yon (izo)flavonoid miltifonksyonèl. glycosyltransferase, J. Mol. Biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Evalyasyon modèl pwoteyin ak pwofil ki genyen twa dimansyon, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: a program to check stereochemical quality of protein structures, J. Appl. Crystallogr. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: amelyore vitès ak presizyon nan debakadè ak yon nouvo fonksyon nòt, optimize efikas, ak multithreading, J. Comput. Chem. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Diferans nan konjigezon glikoz asid salisilik pa UGT74F1 ak UGT74F2 soti nan Arabidopsis thaliana, Sci. Rep. 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases in plant natural product sentèz: karakterizasyon yon fanmi supergene, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Chanjman espesifik donatè sik nan plant glycosyltransferases pa yon sèl mitasyon pwen, Arch. Byochim. Biophys. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glucosylation nan konpoze fenolik pa Pharbitis nil rasin cheve: I. Glucosylation nan koumarin ak dérivés flavon, Biosci. Biotechnol. Byochim. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hydrolysis of toksik glikozid natirèl katalize pa cyclodextrin dicyanohydrins, Eur. J. Org. Chem. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Biotransformation de dérivés hydroxycoumarin pa kiltive selil sispansyon Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467-471, https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Recent advancements of coumarin-based anticancer agents: an up-to-date review, Bioorg. Chem. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Efè yon derive koumarin, 4-methylumbelliferone, sou jèminasyon grenn ak etablisman plantules nan Arabidopsis, J. Chem. Ekol. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, Uit nouvo eudesmane- ak eremophilane-type sesquiterpenoids soti nan Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. Li, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Detèminasyon ak pharmacokinetic etid nan ekreme pa UHPLC-MS / MS nan plasma rat, J. Pharm . Biomed. Anal. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.