Rejim Vaksinasyon Klamidya Trachomatis ki gen plizyè konpozan pou ogmante repons antikò ak selil T epi akselere eliminasyon enfeksyon nan yon modèl primat ki pa imen Ⅱ

Materyèl ak metòd

Antijèn vaksen ak adjuvant

Diferan antijèn ak adjuvant vaksen yo te itilize nan etid sa a: yo te administre antijèn vaksen CTH522, ki baze sou MOMP (11) atravè wout entramuskilè (IM) ak adjuvant CAF01 (42) oswa adjuvant idroksid aliminyòm (AlOH), oswa atravè wout intranasal ( IN) san adjuvant. Plasmid DNA vaksen, pcDNA3.1-MOMP, te fè pa klonaj konsansis MOMP nan vektè plasmid pcDNA3.1 (14) ak administre pa wout intra-dèmik (ID) ak elektwoporasyon (EP) nan do a. Vaksen Recombinant Adenovirus Imèn serotip 5 (rHuAd5) ki eksprime MOMP (HuAd5-MOMP) te fè pa homologously rekonbinen konsansis MOMP (AAC45154.1) nan yon E1 ak E2 efase HuAd5 plasmid pAL1112 vektè epi yo administre atravè wout miskilè (14) . Modifye vaksen Ankara-MOMP vaksen fèt parekonbine konsansis MOMP(AAC45154.1) nan plasmid p3186 ak vektè MVA atenue (14), epi yo administre atravèwout nan miskilè.

Klike La a Pou Jwenn Cistanche Pou Anti-enflamatwa

C. trachomatis serovar D stock

Chlamydia trachomatis serovar D (Ct SvD; UW{{0}}/Cx, ATCC® VR-885™) te jwenn nan American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) epi pwopaje nan HeLa{ {2}} selil yo, rekòlte, epi pirifye jan Caldwell et al. (43). Stock C. trachomatis SvD te estoke nan -80 degre nan 0.2 M sikwoz, 20 mM fosfat sodyòm (pH 7.4), ak 5 mM asid glutamik (SPG) ak konsantrasyon nan enklizyon fòme inite (IFUs) te detèmine nan Selil HeLa-229 ak selil McCoy.

Primat ki pa imen

Yo te enkli trant makak cynomolgus (Macaca fascicularis) ki peze 3 a 5 kg nan etid ki te okipe nan etablisman NHP nivo biosekirite 3 (ABSL3) IDMIT ("Modèl Maladi Enfektye ak Terapi Innovatif" nan CEA "Commissariat à l'Energie Atomique," Fontenay-aux-Roses, Frans; nimewo akreditasyon #D92- 032-02). Pwotokòl yo te apwouve pa komite etik enstitisyonèl "Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) anba deklarasyon nimewo A14-026. Etid la te otorize pa "Ministè Rechèch, Inovasyon, ak Edikasyon" anba nimewo anrejistreman APAFIS#720-201505281237660. Tout bèt yo te teste negatif pou SIV, SHIV, STLV (viris Tlymphotropic simian), viris èpès B, filoviris, SRV-1, SRV-2 anvan etid la epi yo te konfime ke yo te seronegatif pou enfeksyon Klamidya. Tout pwosedi eksperimantal yo te fèt dapre direktiv Ewopeyen an pou swen bèt ("Journal Officiel de l'Union Europé enne", direktiv 2010/63/ UE, 22 septanm 2010).

Pwotokòl vaksinasyon yo

Yo te divize 30 makak yo an 6 gwoup ak 5 bèt nan chak. Diferan rejim vaksinasyon premye ranfòsman pou 6 gwoup yo montre an detay nan Figi 1. Pandan tout vaksen yo, yo te sedated makak yo ak kloidrat ketamin (10 mg/kg pwa kò nan miskilè). CTH522 (85 µg pou chak bèt) te administre pa wout la nan miskilè (IM) ak swa CAF{{20}}1 adjuvant (625 µg/125 µg) oswa AlOH adjuvant (0.425 mg). ), jan yo montre nan Figi 1. Yo te fè vaksen IM nan 0.6 ml volim nan kwis dwat (M. quadriceps) bèt la. Vaksen CTH522 Entranazal (IN) (30 µg pou chak bèt) yo te fèt ak yon aparèy Vaxinator ki konekte ak yon sereng 1 ml ak de administrasyon siksesif 0.25 ml, youn nan chak twou nen. Vaksen ADN-MOMP te administre pa wout intradermal (ID) ak elektwoporasyon (EP) nan po a nan do a. Yo te enjekte 6 volim repete nan 0.1 ml ID (an total 1 mg) ki te swiv pa EP lè l sèvi avèk sistèm Nepagen™ a (anviwònman: 6 pulsasyon kare-ware nan 10 ms ak entèval 90 ms nan 110V, (300- 700mA)) . Yo te administre vaksen hAd5-MOMP IM ak yon dòz 1011 patikil viral nan 1 ml pou chak bèt. Yo te administre vaksen MVA-MOMP IM ak yon dòz 4 * 108 PFU pou chak bèt nan 0.5 ml volim **. Gwoup nayif la pa te bay okenn vaksen epi yo te konsidere kòm gwoup kontwòl la.

Koleksyon echantiyon

Pandan tout pwosedi pran echantiyon yo, yo te sedated makak yo ak ketamin kloidrat (10 mg/kg pwa kò IM). Yo te kolekte san atravè ponksyon venin femoral nan semèn 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. Yo te kolekte likid nan kòl matris pou deteksyon antikò ak Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL). , USA) nan semèn 4, 8, 16, 18, 20, 22 ak 24. Echantiyon kòl matris pou deteksyon chaj klamidyal yo te kolekte ak prelèvman flatlock regilye (Mat Diagnostic - ref.: 552C/ 10). Apre kontak ak mukoza vajen-kòl matris la, yo te mete prelèvman an nan yon flakon ki gen mwayen UTM-RT (Mat Diagnostic - ref.: 330C/6) epi kenbe sou glas.

Enfeksyon defi nan vajen ak 5 * 107 IFU nan C. trachomatis SvD

Bèt yo te sedated ak ketamin chlorhydrate (10 mg/kg IM), mete yo nan vantral kouche ak ranch yo elve ak 1 ml nan inoculum la te twomatik aplike dirèkteman nan mukoza nan vajen nan tranzisyon an vajen-kòl matris lè l sèvi avèk yon sereng 1 ml. Yo te bay chak bèt yon dòz 5 * 107 IFU. Yo te pèmèt bèt la rete nan koumbe vantral ak ranch yo elve pou yon ti tan apre inokulasyon an.

Esè imunosorban ki lye ak anzim

CTH522antikò espesifiknan echantiyon serom ak prelèvman yo te detekte ak yon ELISA endirèk. Plak Maxisorp® (NUNC A/S, Roskilde, Denmark) yo te kouvwi ak CTH522 (0.5 µg/ml) lannwit lan nan 4 degre. Izotip IgG ak IgA yo te detekte ak antikò HRP konjige espesifik kont IgG primat ki pa imen (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, USA, 1:75.{{10} }}) ak IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, USA, 1:50.000). Reyaksyon yo te vizyalize ak substra TMB PLUS (KemEnTec, Taastrup, Denmark) epi yo te sispann ak 0.5 M asid silfirik. Plak yo te li sou yon lektè ELISA nan 450 nm ak koreksyon nan 650 nm. Yo te itilize yon kontwòl pozitif (serom ki soti nan yon etid anvan) kòm yon estanda entèn pou korije varyasyon plak-a-plak. De pwi yo te kouri san substra kòm yon kontwòl negatif sou chak plak. Titer antikò yo te kalkile kòm resipwòk nan dilution ki pi wo a ak yon valè dansite optik (OD) ki pi wo pase koupe a. Koupe a te detèmine soti nan jou 0 mwayèn echantiyon an plis 2 * SD.

Peptide etalaj ak analiz

Etalaj peptide CTH522 la te fèt ak triple peptides 15mer imobilize ki sipèpoze pa 14 asid amine ki te enprime sou glisad an vè fonksyonalize ak enkubasyon ak echantiyon serom pa JPT Peptide Technologies, Bèlen. Yon ti tan, yo te enkube etalaj la ak echantiyon serom yo kolekte nan semèn 24 ak konplèks peptides IgG yo te vizyalize lè l sèvi avèk IgG kabrit anti-makak biotinilate ak Alexa Fluor® 647 Streptavidin. Slides yo te tcheke ak yon eskanè segondè-rezolisyon nan 635 nm ak done yo te rapòte kòm inite fliyoresans abitrè. Yo te detèmine mwayèn valè triplike, si koyefisyan varyasyon an te pi gwo pase 0.5, se sèlman 2 valè ki pi pre yo te itilize. 10 pousan nan siyal entansite maksimòm (65,535) te itilize kòm yon koupe pou yonrepons pozitif, ak siyal vle di anba papòt sa a yo te asiyen yon valè ki koresponn ak mwatye valè papòt la (3277).

In vitro netralizasyon tès

Yo te fè tès netralizasyon an vitro pou teste kapasite antikò serik pwovoke vaksen yo pou netralize enfeksyon Klamidya nan selil HaK nan vitro. Egzamen an te swiv prensipalman pwotokòl ki te dekri anvan an (44). Premyèman, echantiyon serom ki soti nan bèt endividyèl yo te enkube nan 56 degre pou 30 minit pou inaktive konpleman an. Estok klamidya (SvD, SvE, ak SvF) te melanje ak enkubasyon ak dilusyon seri serom inaktive ki soti nan chak bèt ki te pran vaksen an pou 30 minit epi answit te vaksinen sou yon monokouch selil HaK nan 96-plak ki byen plat nan kopi. Apre 30 èdtan nan enkubasyon, selil, ak enklizyon yo te fikse ak vizyalize ak serom poliklonal lapen anti-Ct043 ak antikò segondè ki make fluoresans (Alexa Flour 488, kabrit-anti-lapen IgG, A11008, Life Technologies) nan dilution 1:500. . Konte enklizyon yo te fèt manyèlman nan 20 chan de vi nan 40x agrandisman (Olympus IX71 mikwoskòp fliyoresan inverse). Netralizasyon te kalkile kòm pousantaj rediksyon nan kantite mwayèn IFUs konpare ak yon pisin nan sera soti nan bèt gwoup kontwòl (nayif).

Entraselilè PBMC cytokine tach ak sitometri parèy

Yo te izole PBMC yo epi yo ({{0}} x 106) yo te resispann nan 150 µl mwayen konplè ki gen 0.2 µg chak antikò costimulatory CD28 ak CD49b. Yo te fè eksitasyon nan 96 pwi/plak lè l sèvi avèk 2 µM nan chak pisin peptide oswa SEB (kòm kontwòl pozitif) oswa mwayen pou kont li (kòm kontwòl negatif). Brefeldin A te ajoute nan chak pi nan yon konsantrasyon final nan 10 µg / ml epi yo te plak la enkube nan 37 degre C, 5 pousan CO2 lannwit lan. Lè sa a, selil yo te lave, tache ak yon lank viabilite (vyolèt, lank reyaktif fliyoresan, Invitrogen), fiks, epi pèmeabilize ak reyaktif BD Cytofifix / Cytoperm. Lè sa a, echantiyon selil pèmeabilize yo te estoke nan -80 degre anvan pwosedi tach la. Antikò tach te fèt nan yon sèl etap apre pèmeabilizasyon. Tout itilize yoantikòyo endike nan Tablo 1. Apre 30 min enkubasyon sou glas nan fè nwa a, selil yo te lave nan tanpon BD Perm/Wash. Selil yo te konte ak yon LSR II (BD) imedyatman apre pwosedi tach la epi yo te itilize lojisyèl FlowJo pou analiz done yo.

TABLE 1 Antikò yo itilize pou tach makè selil iminitè ak sitokin intraselilè

Deteksyon ADN klamidyal nan vajen pa PCR kalitatif

Abbott RealTime CT/NG essai (ABBOTT, Rungis, Frans) se yon tès in vitro polymerase chain reaction (PCR) pou deteksyon dirèk ak kalitatif ADN plasmid la pou jenom CT (C.trachomatis) ak NG (N. gonorrhoeae). . Asid nikleik te ekstrè nan echantiyon UTM (medya transpò inivèsèl) sou M2000SP ak anplifikasyon te fèt sou M2000SP, dapre enstriksyon manifakti a. Rezilta yo te eksprime kòm papòt sik (Ct).

Analiz estatistik

Tout estatistik yo te fèt ak lojisyèl GraphPad Prism (vèsyon 8.1.2). Done ki pa nòmalman distribiye yo te analize ak tès ki pa parametrik; Tès Kruskal-Wallis ak tès konparezon miltip Dunn pou detèmine siyifikasyon diferans ant gwoup yo. Koub ki montre pousan bèt negatif PCR yo te konpare ak yon tès estatistik Log-rank (Mantel-Cox). Konparezon yo te konsidere estatistik siyifikatif si valè P la te < 0.05 (P <0.05). Plis nivo siyifikasyon yo endike ak asterisk *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001.

Deklarasyon disponiblite done yo

Kontribisyon orijinal yo prezante nan etid la enkli nan atik la / Materyèl siplemantè. Plis demann yo ka dirije bay otè ki koresponn lan.

Deklarasyon etik

Etid bèt la te revize ak apwouve pa "Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) anba deklarasyon nimewo A14-026. Etid la te otorize pa "Ministè Rechèch, Inovasyon ak Edikasyon" anba nimewo anrejistreman APAFIS#720-201505281237660.

Kontribisyon otè

Eksperyans ki fèt ak konsepsyon: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Fè eksperyans: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Pwodui vaksen ak konstwi antijèn: IR, PM, AO. Analize done yo: JD, EL, FF, IR, HJ. Elabore ak modifye papye a: JD, EL, FF. Chak nan ko-otè ki nan lis yo te fè kontribisyon sibstansyèl nan travay la atravè konsepsyon ak konsepsyon, ak / oswa akizisyon, analiz, ak entèpretasyon nan done yo. Tout otè kontribye nan atik la epi apwouve vèsyon an soumèt.

Rekonesans

Nou remèsye Fondasyon Dormeur, Vaduz pou don an bay Inite Evolisyon ak Transmisyon Viral pou enstriman laboratwa ki gen rapò ak pwojè sa a.

Konfli enterè FF, IR, PA ak AWO se ko-envantè sou yon aplikasyon patant sou vaksen kont klamidya [WO2014146663A1]. Tout dwa yo te asiyen nan Statens Serum Institut, yon enstiti gouvènman Danwa ki pa fè pwofi. Otè ki rete yo deklare ke rechèch la te fèt nan absans nenpòt relasyon komèsyal oswa finansye ki ta ka entèprete kòm yon konfli enterè potansyèl.

Nòt Piblikatè a Tout reklamasyon ki eksprime nan atik sa a se sèlman sa otè yo epi yo pa nesesèman reprezante sa yo ki nan òganizasyon afilye yo, oswa sa yo ki nan Piblikatè a, editè yo, ak evalyatè yo. Nenpòt pwodwi ki ka evalye nan atik sa a, oswa reklamasyon ki ka fè pa manifakti li yo, pa garanti oswa andose pa Piblikatè a.

Referans

1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N, et al. Estimasyon mondyal de prévalence ak ensidans kat enfeksyon seksyèlman transmisib geri nan 2012 ki baze sou revizyon sistematik ak rapò mondyal. PLoS One (2015) 10(12):e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304

2. Longbottom D, Coulter LJ. Klamidyoz bèt ak enplikasyon zoonotik. J Comp Pathol (2003) 128(4):217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629

3. Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Risk pou sekèl apre enfeksyon jenital klamidya trachomatis nan fanm yo. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2:S134–55. fè: 10.1086/652395

4. Dodet B. Baryè aktyèl, defi, ak opòtinite pou devlopman vaksen STI efikas: pwen de vi pwodiktè vaksen yo, konpayi biotech yo ak ajans finansman yo. Vaccine (2014) 32(14):1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032

5. Brunham RC, Kuo CC, Cles L, Holmes KK. Korelasyon nan repons iminitè lame a ak rekiperasyon quantitative nan Klamidya trachomatis soti nan andocol imen an. Infect Immun (1983) 39(3):1491–4. doi: 10.1128/iai.39.3.1491- 1494.1983

6. Cotter TW, Meng Q, Shen ZL, Zhang YX, Su H, Caldwell HD. Pwoteksyon efikasite nan gwo manbràn ekstèn pwoteyin-espesifik imunoglobulin a (IgA) ak antikò monoklonal IgG nan yon modèl murin nan enfeksyon nan aparèy jenital klamidya trachomatis. Infect Immun (1995) 63(12):4704–14. doi: 10.1128/iai.63.12.4704-4714.1995

7. Johansson M, Schon K, Ward M, Lycke N. Etid sou sourit knockout revele ke pwoteksyon anti-klamidyal mande pou selil TH1 ki pwodui IFN-gamma: èske sa a vre pou moun? Scand J Immunol (1997) 46 (6): 546-52. doi: 10.1046/j.1365- 3083.1997.d01-167.x

8. Gondek DC, Olive AJ, Stary G, Starnbach MN. Selil CD4 plis T yo nesesè ak ase pou bay pwoteksyon kont enfeksyon klamidya trachomatis nan aparèy jenital anwo murin lan. J Immunol (2012) 189 (5): 2441–9. doi: 10.4049/ jimmunol.1103032

9. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Evalyasyon IgA sekretè andedan ak siplemantè epitelial nan enfeksyon klamidyal. Imunoloji (2014) 143 (4): 520-30. doi: 10.1111/imm.12317

10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Rezilta divèjan apre transsitoz IgG ki vize antijèn klamidyal intraselilè ak ekstraselilè. Immunol Cell Biol (2014) 92 (5): 417-26. doi: 10.1038/icb.2013.110

11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Pwoteksyon kont enfeksyon Chlamydia trachomatis ak chanjman patolojik anwo aparèy jenital pa antikò netralize vaksen ankouraje VD4 nan pi gwo pwoteyin manbràn ekstèn lan. J Enfekte Dis (2015) 212 (6): 978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137

12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. Th1/Th17 T selil tisi-rezidan iminite ogmante pwoteksyon men li pa obligatwa nan yon estrateji vaksen kont enfeksyon jenital ak klamidya trachomatis. Front Immunol (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463

Mande plis:

Imèl:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plis 86 15292862950

Ajoute sipleman cistanche nan kabwa:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop