Pandan kèk deseni ki sot pase yo, syantis yo te reyalize pwogrè remakab nan amelyore sante ak pwolonje lavi.

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

ENTWODIKSYON

Selil epitelyal lantiy yo (LECs) fòme yon monokouch selil ki kouvri kapsil lantiy la anteryè epi pwolonje nan banza lantiy ekwatoryal la [1, 2]. Konstriksyon nòmal ak fonksyon LEC yo esansyèl pou kenbe transparans ak omeyostazi metabolik tout lantiy la[3]. Ogmante prèv endike ke senesans nan LEC yo ka lakòz modifikasyon, denaturasyon, ak agrégation nan pwoteyin lantiy ki gen ladan anzim ak kristalin, kidonk finalman mennen nan opakifikasyon lantiy oswa menm katarak [3-5]. Katarak ki gen rapò ak laj (ARC) rete kòz prensipal nan andikap vizyèl ak avèg, ki afekte grav kalite lavi moun ki pi gran [6]. Kounye a, pa gen okenn estrateji efikas pou prevansyon pwogresyon ARC. Se poutèt sa, li nesesè yo devlope yon entèvansyon famasi ki ka amelyore transparans nan lantiy la ak retade pwogresyon ARC.

Pandan kèk deseni ki sot pase yo, syantis yo te reyalize pwogrè remakab nan amelyore sante ak pwolonje lavi yo lè l sèvi avèk plizyè entèvansyon jenetik, dyetetik ak famasi [7]. Metformin (MET) se youn nan ajan anti-aje anpil etid. Etid sibstansyèl sijere ke MET ka soulaje senesans ak pwolonje yon lavi ki an sante nan divès sistèm modèl bèt. MET ka pa sèlman pwolonje lavi Caenorhabditis elegans, men tou amelyore sante li ak vitalite [8]. MET ka diminye akimilasyon ki gen rapò ak laj ak estrès oksidatif ki gen rapò ak domaj ADN nan selil tij Drosophila midgut pou pwolonje lavi yo [9]. Etid anvan yo endike tou ke administrasyon MET kwonik ba-dòz amelyore sante ak lavi sourit [10]. Anplis, prèv émergentes endike ke lè pasyan ki gen dyabèt yo trete ak MET, yo manifeste benefis siviv, menm lè yo konpare ak kontwòl ki pa gen dyabèt [11].

KSL09

Tanpri klike isit la pou konnen plis

Anplis aktivite MET pou pwomouvwa lavi a nan divès òganis modèl, MET vize plizyè chemen siyal selilè pou amelyore maladi ki gen rapò ak laj yo. MET yo te montre yo modile otofaji sitou atravè aktivasyon adenosine monofosfat (AMP)-aktive pwoteyin kinaz (AMPK) epi anpeche neurodegeneration ak neuroinflammation pou jwe yon wòl neuroprotective nan maladi Parkinson la [12]. Menm jan an tou, MET amelyore chanjman ki gen rapò ak laj nan selil endothelial sinusoidal fwa a atravè AMPK ak wout oksid nitrique endothelial [13].cistanche dosage redditAnplis, deklanchman AMPK kwonik pa MET anpeche kadyomyopati pa upregulating otofaji nan sourit OVE26 ki gen dyabèt [14]. Anplis de sa, MET soulaje deteryorasyon kadyovaskilè ki asosye ak laj pa amelyore otofaji ak restriksyon kalorik [15]. Anplis de sa, tretman MET ka anpeche ateroskleroz ki asosye ak laj nan sourit ApoE-7- ak lapen pwovoke pa yon rejim alimantè ki gen anpil grès, siyifikativman anpeche kalsifikasyon plak ateroskleroz, diminye nivo pwoteyin C-reyaktif ki gen anpil sansiblite, ak reprime aktivasyon an nan. faktè nikleyè kappa B(NF-kB)chemin nan veso sangen [16-18].

Dapre obsèvasyon sa yo, etid prezan an te eseye eksplore si MET ka retade aje ARC ak mekanis molekilè ki kache. Konklizyon nou yo se jan sa a: (i) tretman MET kwonik ki ba-dòz te retade senesans nan LECs nan sourit ki gen laj natirèl, kidonk anpeche opakite lantiy la; (i) chemen AMPK la te inaktive, ak flux otofajik te andikape nan LECs senesan; (i) ) tretman MET kwonik ki ba-dòz te retade senesans LECs nan sourit ki gen laj natirèl lè yo aktive chemen AMPK a ak amelyore otofaji. Konklizyon nou yo pwouve wòl anti-aje MET nan epi bay ase prèv ke MET ka pwouve ke yo dwe yon opsyon ki ka geri posib pou ARC.

REZILTA

Senesans nan LEC yo te asosye ak ARC nan sourit ki gen laj natirèl

Plizyè mekanis potansyèl ARC, ki gen ladan efè aje, yo te envestige anpil.benefis ekstrè cistanche,Sepandan, asosyasyon ki genyen ant senesans LECs ak ARC nan vivo rete klè. Nou te ipotèz ke senesans LEC yo ka lakòz ARC nan vivo. Se poutèt sa, nou konstwi yon modèl sourit nan ARC. Rezilta nou yo te revele ke transparans nan lantiy la nan sourit ki gen laj natirèl (pi gran sourit) te siyifikativman diminye kòm konpare ak sa ki nan gwoup kontwòl la (jenn sourit) (Fig.1a). Jan yo montre nan Fig.1b, ensidans nan katarak nan gwoup la ki gen laj natirèl te 95.23 pousan. H & E tès tach endike ke LEC yo nan gwoup kontwòl la te wonn nan fòm ak ranje regilyèman, ak dansite nan LECs nòmal yo te relativman wo, tandiske LEC yo nan sourit yo ki gen laj natirèl yo te plat nan fòm ak ranje inegal, ak dansite nan. senesan LEC yo te siyifikativman diminye (Fig.1c). Anplis de sa, SA - -Gal tach te montre ke rapò a nan senesan LEC yo te elve nan sourit ki gen laj natirèl (figi 1d). Anplis de sa, nou analize ekspresyon pwoteyin nan makè senesans ki asosye atravè tach IHC ak analiz Western blot. IHC tach revele ke ekspresyon de p21 ak p53 te ogmante nan LEC yo nan sourit ki gen laj natirèlman konpare ak jèn sourit (Fig. 1e, f). Menm jan an tou, nou te dekouvri plis ekspresyon pwoteyin p21 ak p53 te pi wo nan kapsil lantiy sourit ki gen laj natirèl pase nan kapsil lantiy jèn sourit (figi 1g). Rezilta sa yo sijere ke senesans nan LEC yo te asosye ak ARC nan sourit ki gen laj natirèl.

KSL10

Cistanche ka anti-aje

Administrasyon MET kwonik ba-dòz amelyore transparans lantiy la ak soulaje senesans LECs Anvan nou teste efè metformin sou ARC, nou te detèmine si administrasyon MET kwonik ba-dòz la an sekirite pou sourit yo. Apre tretman MET pou 10 mwa, 28 sourit (18 nan gwoup ki gen laj natirèl ak 10 nan gwoup MET) te mouri akòz kòz natirèl. Nou te jwenn ke sourit vivan nan tou de gwoup yo te an sante, epi pa te gen okenn diferans enpòtan nan pwa kò ak pwa ògàn ant tou de gwoup (Tablo 1). Se poutèt sa, rezilta sa yo endike ke dòz la nan metformin yo itilize nan etid la te an sekirite pou bèt yo epi yo ka itilize pou eksperyans ki vin apre yo.

Imedyatman, yo te administre MET kwonik ba-dòz pou evalye si MET te kapab anpeche opakite lantiy ak soulaje senesans ki gen rapò ak laj nan LECs nan sourit ki gen laj natirèl. Kòm espere, transparans nan lantiy la nan gwoup la MET te amelyore anpil kòm konpare ak transparans nan lantiy la nan gwoup la ki gen laj natirèl (Fig.2a). Anplis de sa, obsèvasyon mòfolojik konfime ke lantiy la nan gwoup la MET te montre yon rediksyon nan opakite. Ensidans la nan katarak nan gwoup la ki gen laj natirèl te 95.23 pousan, tandiske ke nan gwoup la MET te 19.00 pousan (Fig.2b).H&E tès tach revele ke dansite nan LECs nan gwoup la MET te miyò pi wo. pase sa nan sourit yo ki gen laj natirèl (figi 2c). Anplis, LEC yo nan gwoup la MET yo te relativman wonn nan fòm konpare ak sa yo ki nan gwoup la ki gen laj natirèl (Fig.2c). SA - -Gal tach te montre ke rapò a nan senesan LEC yo te siyifikativman diminye nan gwoup la MET konpare ak sa ki nan gwoup la ki gen laj natirèl (Fig.2d). Analiz IHC te revele ke ekspresyon de p21 ak p53 te diminye plis nan LEC yo nan gwoup la MET pase nan gwoup la ki gen laj natirèl (Fig.2e, f). Menm jan an tou, analiz Western blot te revele ke ekspresyon pwoteyin p21 ak p53 te konsiderableman diminye nan kapsil lantiy gwoup MET yo konpare ak gwoup ki gen laj natirèl (Fig.2g). Rezilta sa yo siyifi ke administrasyon MET kwonik ba-dòz te kapab amelyore transparans lantiy la ak soulaje senesans LEC yo.

KSL11

Administrasyon MET kwonik ki ba-dòz atenue senesans LECs nan sourit ki gen laj natirèl atravè aktivasyon AMPK Yon kantite done akablan sipòte konklizyon ke aktive AMPK se ase pou pwolonje lavi nan òganis modèl yo, ogmante apèl li kòm yon sib lonjevite [19,20] . Lè nou konsidere teyori sa a, nou evalye ekspresyon chemen AMPK nan LEC sourit yo. Nivo relatif FAS mRNA a te redwi nan gwoup ki gen laj natirèl ak ogmante nan gwoup MET (Fig. 3a). Jan yo montre nan Fig.3b, c, ekspresyon fosforilasyon AMPKa (Thr172) ak fosforilasyon ACC (Ser79) te redwi nan LEC yo nan sourit ki gen laj natirèlman konpare ak sa yo ki nan sourit jèn. Sepandan, ekspresyon fosforilasyon AMPKa (Thr172) ak fosforilasyon ACC (Ser79) te ogmante nan LEC gwoup MET yo konpare ak gwoup ki gen laj natirèl. Anplis de sa, analiz Western blot te revele ke ekspresyon pwoteyin fosforilasyon AMPKa (Thr172) ak fosforilasyon ACC (Ser79) te siyifikativman downregulated nan kapsil lantiy yo nan laj natirèl la, ak nivo ekspresyon pwoteyin fosforilasyon AMPKa (Thr172) ak fosforilasyon ACC ( Ser79) yo te ogmante nan kapsil lantiy yo nan gwoup la MET (Fig.3d). Done sa yo te revele ke chemen AMPK la te inaktive nan LEC yo nan sourit ki gen laj natirèl. Anplis de sa, administrasyon MET kwonik ba-dòz diminye senesans LEC nan sourit ki gen laj natirèl atravè aktivasyon AMPK.

Administrasyon MET kwonik ki ba-dòz te retabli flux otofajik la pou soulaje senesans LECs nan sourit ki gen laj natirèl. Pou analize plis chanjman molekilè ak selilè nan lantiy la apre tretman MET, nou te detèmine ekspresyon LC3 ak p62 paske yo lajman aksepte kòm byomarkè nivo otofaji yo. Kòm demontre nan Fig. 4a, nivo ekspresyon relatif p62 mRNA a te ogmante siyifikativman nan gwoup ki gen laj natirèlman konpare ak gwoup kontwòl la; sepandan, nivo ekspresyon mRNA relatif nan p62 te sibstansyèlman desann-reglemante nan gwoup la MET kòm konpare ak sa ki nan gwoup la ki gen laj natirèl.cistanche genghis khanAnplis de sa, tach IHC revele ke nivo yo nan pwoteyin ki asosye ak mikrotubule 1 chèn limyè 3 (LC3-II/l) ak p62 yo te ogmante nan LEC yo nan sourit ki gen laj natirèl. Anplis de sa, rezilta nou yo montre ke nivo LC3-II/l ak p62 yo te konsiderableman diminye nan LEC Gwoup MET (Fig. 4b, c). Nivo pwoteyin nan LC3-ll ak p62 yo te ogmante ansibleman nan kapsil lantiy yo nan gwoup la ki gen laj natirèl (Fig.4d). Ansanm, nou te espekile ke flux otofajik la te andikape nan LEC yo nan sourit ki gen laj natirèl epi yo ta ka retabli pa administrasyon MET kwonik ki ba-dòz pou soulaje senesans nan LECs nan sourit ki gen laj natirèl.

DISKISYON

Katarak ki pa trete yo se yon kòz prensipal avèg atravè lemond ki karakterize pa opakifikasyon lantiy kristal la [23]. Etid epidemyolojik yo montre ke laj se faktè risk dominan pou katarak, ke yo rekonèt kòm ARC, ak tretman an sèlman se retire chirijikal [24]. Etid anvan yo te montre ke senesans nan LECs se kòz prensipal ARC [25]. Jiska dat, pa te gen okenn ajan terapetik efikas pou anpeche twoub lantiy la ak diminye senesans LEC yo san efè segondè endezirab. Konsantre etid prezan an se te evalye baz molekilè byolojik pou senesans LEC yo ak mekanis pou pwoteje LEC nòmal kont senesans. Rezilta nou yo te revele ke inaktivasyon AMPK ak andikap otofaji te asosye ak senesans LECs ak ARC. Anplis de sa, nou te jwenn ke MET ta ka pwoteje LEC yo kont senesans ak anpeche twoub lantiy la pa aktive AMPK ak amelyore otofaji.

Senesans se yon pwosesis byolojik fondamantal ki akonpaye pa yon bès jeneral nan fonksyon tisi yo. Kòm lavi a ogmante, malfonksyònman ki gen rapò ak laj tankou ARC vin sante grav

pwoblèm [26]. Senesans nan LEC yo te rapòte yo dwe patisipe nan ensidan an ak devlopman nan ARC [5]. Rezilta nou yo te revele ke LEC yo nan sourit ki gen laj natirèl yo te plat nan fòm ak ranje inegal, ak dansite nan LECs diminye ansibleman (Fig. 1c, d). Anplis de sa, ekspresyon de jèn ki asosye ak aje (p21 ak p53) te upregulated nan LEC yo nan sourit yo ki gen laj natirèl (figi 1e, f, g). Rezilta nou yo te enplike ke senesans nan LEC yo te asosye ak ensidan an ak devlopman nan ARC. Se poutèt sa, yon konpreyansyon egzat sou mekanis molekilè ki kache nan senesans nan LEC yo ka oblije bay yon rezon pou nouvo estrateji tretman.

MET se medikaman ipoglisemi oral ki pi preskri pou dyabèt tip 2 atravè lemond. Prèv émergentes endike ke MET gen efè benefisye sou sante pi lwen pase sa ki asosye ak amelyorasyon nan glisemi [27]. Li te konfime ke mekanis yo nan MET yo enpòtan pou vize chemen fondamantal nan aje byolojik, tankou aktive AMPK, ogmante otofaji, anpeche enflamasyon, ak egzèse efè anti-oksidatif [28]. Nan imen, MET yo te itilize nan pratik klinik pou plis pase 60 ane; li gen yon pwofil sekirite segondè epi li se yon pozisyon inik pou entèvni nan plizyè chemen enpòtan ki responsab pou aje ak maladi ki gen rapò ak laj. Sepandan, efè MET sou ARC ak mekanis regilasyon efè sa yo pa janm te rapòte. Kontinwe, nan etid nou an, administrasyon kwonik ba-dòz MET nan sourit ki gen laj natirèl amelyore transparans nan lantiy la (Fig. 2a) ak diminye senesans nan LECs nan vivo (Fig. 2).

KSL12

Li se lajman rekonèt ke MET aktive chemen AMPK ki se mekanis potansyèl MET pou egzèse yon efè anti-aje [29]. AMPK, yon Capteur enèji selilè, jwe yon wòl enpòtan nan reglemante balans enèji selilè [30]. Plizyè etid yo montre ke AMPK sèvi kòm yon entegratè ak medyatè nan plizyè chemen ak pwosesis ki asosye enèji ak lonjevite. Nan etid nou an, nou te jwenn ke inaktivasyon AMPK se te yon karakteristik nan senesan LECs nan sourit ki gen laj natirèl (Fig.3). Imedyatman, MET yo te montre estimile chemen AMPK pou anpeche senesans LECs (Fig.3). Kòm yon activateur AMPK etabli, wòl MET nan prevansyon aje jeneralman atribiye nan efè li yo sou modulation chemen siyal en, tankou restorasyon otofaji, aktivasyon Sirt1 ak Foxo1 ak repwesyon mTOR [31,32]. Etid nou an te bay yon nouvo liy prèv ki ensiste sou enpòtans fonksyon AMPK aktive pa MET nan anpeche ensidan ARC la.

Kòm mansyone pi wo a, AMPK kominike ak anpil wout ak pwoteyin fè egzèsis yon efè anti-senesans, ki gen ladan ogmantasyon nan otofaji. Autophagy, ki parèt kòm yon pwosesis debaz pou asirans lonjevite, te atire enterè toupatou kòm yon potansyèl sib terapetik pou maladi ki gen rapò ak laj. Autophagy se yon pwosesis byolojik konplèks ki gen plizyè etap. Pwosesis konplè otofaji yo rele flux otofaji, ki lajman itilize pou reflete nivo otofaji. Kòm yon endikatè nan otofaji, LC3-Il se byen mare nan manbràn otofagosomal la ki degrade pa anzim lizozomal yo.ekstansyon lavi cistancheMenm jan an tou, p62, yon substra otofagi-espesifik, anjeneral degrade nan otofagolyzosome, ak ekspresyon li endirèkteman reflete nivo otofaji. Nan etid la prezan, rezilta nou yo te implique ke nivo otofaji klèman te bese nan senesan LECs (Fig. 4), tandiske MET ranvèse andikap ki gen rapò ak laj nan otofaji (Fig. 4). Mekanis molekilè anti-aje MET atribiye nan fonksyon prensipal AMPK nan selil yo paske li jeneralman amelyore otofaji atravè aktivasyon AMPK [33]. Anplis, yo montre MET ogmante otofaji dirèkteman, kidonk kontribiye nan prevansyon senesans [34]. Sepandan, etid pi detaye yo bezwen pou elicide mekanis ki kache yo, ki pwouve ke MET ogmante otofaji atravè yon chemen AMPK endepandan oswa depandan.

Li te demontre ke prévalence de ARC pa te asosye ak sèks nan popilasyon ki gen orijin Azyatik [35, 36]. Se poutèt sa, nou pa t konsidere sèks kòm yon faktè ki ka afekte ARC. Etid nou an ta dwe entèprete konsidere limit yo mansyone pi wo a.

KONKLIZYON

An rezime, nou te pwouve ke inaktivasyon nan chemen AMPK a ak andikap otofaji ki gen rapò ak laj ta ka kontribye nan senesans nan LECs ak ensidan an nan ARC. Anplis de sa, done ki soti nan eksperyans nou yo te revele ke MET efektivman retade senesans nan LECs ak fòmasyon nan ARC atravè aktivasyon nan chemen AMPK a ak ogmantasyon nan otofaji. Konklizyon nou yo se yon liy debaz pou plis envestigasyon nan mekanis molekilè ki itil nan wòl MET pandan pwosesis la aje nan ARC epi yo pral enfòmatif pou etid pi entansif sou devlopman nan nouvo estrateji kont ensidan an ak devlopman nan ARC.

MATERYÈL AK METÒD Reyaktif

MET te achte nan men Bristol-Myers Squibb Company (Lachin). Antikò kont p21 (ab188224), p53 (ab131442), AMPKa fosforil (p-AMPK) (Thr172) (ab133448), AMPKa1 (ab32047), -actin (ab8226) ak SQSTM1/p62 (3340-1) yo te jwenn nan Abcam (MA, USA). Antikò kont LC3 (12741) ak fosfo-acetyl CoA carboxylase (p-ACC) (Ser79) (3661) yo te achte nan men Cell Signaling Technology ( MA, USA).

Bèt ak tretman

Sourit gason C57BL6J ki te 3 ak 8 mwa yo te achte nan Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co Ltd.(Beijing, Lachin). Sourit yo te loje nan tanperati kontwole (tanperati, 20-25 degre ak imidite relatif, 55±15 pousan) kondisyon ak yon sik limyè / fè nwa 12 h, ak aksè gratis nan manje ak dlo. Tout pwosedi ak pwotokòl ki fèt sou bèt yo te apwouve pa komite etik Harbin Medical University.

Sourit yo te divize an twa gwoup sa yo: (i) gwoup kontwòl ki gen jèn sourit (3 mwa, pwa kò =29.72± 1.66 g, n =40) te resevwa yon rejim sourit pirifye estanda ak dlo. ad libitum; Lè sourit yo te gen 10 mwa, 120 sourit yo te owaza divize an de gwoup: gwoup ki gen laj natirèl ak gwoup MET. (i) gwoup ki gen laj natirèl (pi gran sourit, 20 mwa, pwa kò =32.98±1.93g, n{=60) te resevwa yon rejim estanda sourit pirifye ak dlo ad libitum; (ii) gwoup MET ( 20 mwa fin vye granmoun, pwa kò =31.21±2.81 g,n{=60) te kenbe sou yon rejim estanda sourit pirifye ak dlo jiskaske sourit yo rive nan 10 mwa; apre sa, tretman yo te kòmanse. Sourit nan gwoup MET yo te manje yon rejim alimantè ki konplete ak 0.1 pousan MET (Bristol Myers Squibb, Lachin) ak dlo lib pou 10 mwa.

izolasyon lantiy ak kapsil lantiy

Sourit yo te euthanized atravè dislokasyon nan matris. Yo te retire tout je a imedyatman nan tout bèt eksperimantal epi yo mete yo nan saline esteril. Yo te mete nè optik la anlè epi li te fikse ak yon pensèt. Lè sa a, yo te fè yon ensizyon sou nè optik ki antre nan je a, epi yo te rale sklero a tounen pou ekspoze lantiy la.cistanche nzApre sa, nou te itilize pensèt pou retire ti moso kò silyè ki tache ak plan ekwatoryal lantiy la. Foto lantiy fre yo te imedyatman pran, epi lantiy la te byen vit fiks ak 4 pousan paraformaldehyde nan tanperati chanm. Tout kapsil lantiy yo te byen vit kale nan lantiy ki rete a, yo te jele nan nitwojèn likid, epi yo te estoke nan 80 degre C pou eksperyans ki vin apre yo.

Ematoksilin ak eozin (H&E)

Lantiy fre a te imedyatman fikse ak 4 pousan paraformaldehyde nan tanperati chanm ak entegre nan parafine. Pou egzamen istolojik, tisi yo te koupe an 4- μm tranch. Apre deparafinizasyon ak reyidratasyon, seksyon parafin yo te prepare yo te tache ak solisyon ematoksilin (H) pou 8min, ki te swiv pa 5 plonje nan 1 pousan etanòl asid (1 pousan HCI nan 70 pousan etanòl)

epi rense avèk dlo distile. Imedyatman, seksyon yo te tache ak solisyon eosin (E) pou 3 minit, ki te swiv pa dezidratasyon ak alkòl gradye ak netwaye ak xylene. Chanjman mòfolojik yo te obsève anba yon mikwoskòp (Nikon, Eclipse, Japon).

Egzamen -galactosidase ki asosye ak senesans (SA- -Gal) Aktivite -galactosidase (SA- -Gal) ki asosye ak senesans yo te mezire lè w itilize yon twous tach SA{- -Gal (Sigma, CS{). {12}}030). Dapre enstriksyon manifakti a, seksyon tisi yo, apre yon seri de tretman, yo te lave ak saline ki gen tanpon fosfat (PBS) pou 5 minit (twa fwa) epi apre sa yo te enkube nan solisyon tach SA- -gal (pH 6.0) nan 37 degre san CO2 pou 24 h. Imaj yo te kaptire anba yon mikwoskòp limyè (Nikon, Eclipse, Japon). Pousantaj selil pozitif SA- -gal-pozitif yo te estime kòm kantite mwayèn selil pozitif / kantite mwayèn selil total yo.

Reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl (gRT-PCR) RNA total ki soti nan kapsil lantiy sourit yo te ekstrè lè l sèvi avèk reyaktif TRlzol la. Transkripsyon ranvèse te fèt ak ExScript RT Reagent Twous (Invitrogen). Yo te fè analiz quantitative ranvèse transcription-polymerase chèn reyaksyon (qRT-PCR) lè l sèvi avèk yon SYBR Green Supermix.

twous (Takara, Tokyo, Japon), ak -aktin kòm yon kontwòl andojèn. Yo te envestige transkripsyon yo pou plizyè jèn sib, ki gen ladan FAS (anvan, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'ak ranvèse, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (anvan, 5'-GGCGCCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} ak ranvèse, 5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') ak -aktin (anvan, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3' ak ranvèse, 5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. nivo chak ekspresyon jèn yo te

metòd. nòmalize nan -aktin ak kalkile lè l sèvi avèk 2-△△ct r tach imunohistochimik (IHC) Yo te itilize yon total de 5 seksyon reprezantan nan chak nan 10 lantiy yo chwazi pou chak gwoup pou analiz imunohistochimik (IHC). pou evalye ekspresyon p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3, ak p62. Apre echantiyon yo te prepare yo te enkube nan 60 degre pou 2 èdtan, yo te pase nan xylene ak klas alkòl seri pou deparaffinization. Imedyatman, echantiyon yo te bouyi nan 0.1 M nan asid asid (pH 6.1) pou 30 min ak refwadi nan tanperati chanm. Apre yo fin lave twa fwa ak PBS, echantiyon yo te tranpe ak 0.3 pousan HO, pou anpeche aktivite peroksidaz andojèn. Apre sa, antikò prensipal yo te ajoute ak refwadi nan 4 degre C, lannwit lan. Antikò segondè korespondan yo te enkube pou 1 èdtan nan 37 degre C. Apre yo fin lave ak PBS, echantiyon yo te enkube nan diaminobenzidine (DAB) jiskaske entansite tach vle devlope. Imaj selil imunostained yo te kaptire lè l sèvi avèk mikwoskòp Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Japon).

Analiz Western blot

Pwoteyin total ki soti nan kapsil lantiy sourit yo te ekstrè lè l sèvi avèk tanpon radyo-immunoprecipitation (RIPA) ak bwason inhibitor proteaz (Pierce, USA), epi yo te itilize yon twous asid bicinchoninic (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA) pou quantifier konsantrasyon pwoteyin. . Pwoteyin total (40 ug) te analize lè l sèvi avèk sodyòm dodecyl silfat-polyacrylamid jèl elektwoforèz (SDS-PAGE) ak elektwoforetik transfere sou manbràn filtre polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, Almay). Manbràn yo te enkube lannwit lan ak yon antikò prensipal nan 4 degre C. Nan jou ki vin apre a, manbràn yo te enkubate ak antikò segondè korespondan pou 1 èdtan nan 37 degre C. Gwoup imunoreaktif yo te vizyalize lè l sèvi avèk metòd substrate chemiluminescent ak yon Super Signal West Pico. twous (Pierce Biotechnology, USA). Twa eksperyans endepandan yo te fèt.

Analiz estatistik

Done yo te eksprime kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD). Analiz estatistik yo te fèt ak lojisyèl GraphPad Prism 7.0 ak Microsoft Excel. Pwoteyin yo te mezire lè l sèvi avèk lojisyèl Image J la. Yo te itilize tès t Elèv la ak analiz divèjans (ANOVA) pou kalkile siyifikasyon estatistik done eksperimantal yo. Diferans ak yon valè P<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">