Pati 1 Deteksyon Cistanches Herba (Rou Cong Rong) Pwodwi medsin lè l sèvi avèk espès-espesifik siyati nikleyotik

Pou plis enfòmasyon, tanpri kontakte:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* ak Shi-lin Chen 3

1 Laboratwa kle nan sibstans biyoaktif ak Resous Itilize nan Medikaman Chinwa, Ministè Edikasyon, Enstiti nan Devlopman Plant Medsin, Akademi Chinwa nan Syans Medsin ak Peking Union Medicinal College, Beijing, Lachin, 2 NHP Rechèch Alyans, Enstiti Biyodiversite nan Ontario (BIO), Inivèsite Guelph, Guelph, ON, Kanada,

3 Laboratwa kle nan Beijing pou Idantifikasyon ak Sekirite Evalyasyon medikaman Chinwa, Enstiti nan Medikaman Chinwa, Akademi Lachin nan Syans Medikal Chinwa, Beijing, Lachin

Cistanche deserticola gen anpil efè, klike isit la yo konnen plis

Cistanches Herbase yon plant medsin ki gen pwopriyete dezentoksikasyon epi li se souvan itilize nan pwovens Lazi. Dwe nan balans ki genyen ant ekipman pou ak demann, adiltè yo souvan te ajoute pou pwofi. Sepandan, pa gen okenn sipèvizyon regilasyon paske zouti kontwòl kalite yo pa ase pou idantifye pwodwi lou trete. Se konsa, yon zouti molekilè roman ki baze sou siyati nikleyotid ak espès-espesifik primè yo te devlope. REjyon ITS2 yo soti nan 251Cistanches Herbaechantiyon adiltè yo te sekans. Sou baz sit SNP, kat siyati nikleyotid nan 30 ∼37 bp ak sis espès-espesifik primè yo te devlope, epi yo te valide pa melanj eksperimantal atifisyèl ki gen ladan sis espès diferan ak rapò diferan. Metòd sa a te aplike tou pou detekte 66Cistanches Herbapwodwi sou mache a, ki gen ladan ekstrè ak medikaman patant Chinwa. Rezilta yo te demontre sèvis piblik siyati nikleyotid yo nan idantifye adiltè nan melanj. Etid la mache devwale 36.4% adiltè: 19.7% ki enplike adiltè ak songarik Cynomorium oswaSispannSinensis, ak 16.7% ki enplike sibstitisyon ak Cy. songaricum, Ci. sinensis, oswa Boschniakia rossica. Rezilta yo te revele tou ke Cy. chante se te adiltè ki pi komen nan mache a. Se konsa, nou rekòmande pou itilize nan siyati espesifik nikleyotid espesifik pou kontwole adiltè ak verifye asirans nan chèn ekipman pou pwodwi medsin, espesyalman pou pwodwi trete ki gen ADN degrade.

Mo kle: Cistanches Herba, medikaman patant Chinwa, siyati nikleyotid, ADN degrade, kontwòl kalite medikaman

ENTODIKSYON

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) se yon medikaman ki byen koni nan pwovens Lazi (Chinwa Pharmacopoeia Komisyon, 2015; Japon Famasi Konvansyon, 2016); medikaman sa a sòti nan tij dlo sikile yoCistanche deserticolaY. C. Ma oswaCistanche tubulosatonik, menm jan li pa toksik epi yo ka pran pou peryòd tan ki long (Li et al., 2016). Anplis de sa,SisanHerba te bay ak onè a nan yo te rele "Desert Ginseng" paske nan gwo valè medsin li yo, espesyalman nan ranfòse fonksyon gason seksyèl (Zhang ak Su, 2014; Gu et al., 2016). Gen plis pase 100 medikaman patant Chinwa anrejistre nan Komisyon an Pharmacopoeia Chinwa (2015) ak nan lòt estanda ofisyèl lokal yo pwogrese (Wang et al., 2012) . Kòm popilasyon moun aje yo ogmante, gen demann konsiderab pouCistanches Herbaak pwodwi medsin li yo. Sepandan, resous materyèl anvan tout koreksyon yo ap vin de pli zan pli ra. An reyalite, de espès orijinal yo nanCistanches Herbayo te ajoute nan Liv Lachin Plant Wouj kòm plant sovaj eta-pwoteje (kategori II) (Fu, 1991). Materyèl yo medsin sou mache a yo sitou kiltive nan nòdwès Lachin.

Dwe nan dezekilib la konsiderab ant rezèv la ak demannSisanHerba, anpil adiltè te antre nan mache a; adiltè sa yo konsistan avèk estanda epi yo ka menase sekirite dwòg. Adiltè yo li te ye gen ladan tij yo sèk nan Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang nan Chinwa),Sispannsinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan, ak Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Adiltè sa yo gen karakteristik mòfolojik ki sanble ak sa yo ki nanSisanHerba, fè idantifikasyon taksonomik tradisyonèl difisil, patikilyèman apre se materyèl la trete nan pwodwi medsin. Idantifikasyon mikwoskopik pa disponib paskeSisanHerbapa gen okenn karakteristik definitif oswa inik. Zouti chimi analyse aktyèl yo pa ase pou detekte adiltè nan Cistanches Herba paske konpoze menm jan an tou egziste nan adiltè yo li te ye. salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) ak Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Se poutèt sa, devlopman yon metòd molekilè rapid pou otantifikasyon nan Cistanches Herba ak pwodwi li yo ijan bezwen pou sistèm kontwòl kalite apwopriye nan medikaman patant Chinwa ak lòt endistri pwodwi medsin.

Chen et al. premye sijere entèn espas transkri 2 (ITS2) kòm yon baryè inivèsèl pou plant medsin (Chen et al., 2010). Solèy et al. verifye rejyon ITS2 a kòm yon baryè ADN pi preferab pou idantifyeSisanHerba ak adiltè li yo (Solèy et al., 2012). Sepandan, ITS2 pa ka itilize pou fè distenksyon ant medikaman patant Chinwa soti nan ADN degrade. Dènyèman, yon nimewo ogmante nan syans yo te montre ke "barcode mini" a se yon metòd itil pou anplifye ADN degrade (Hajibaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Sepandan, siyati nikleyotid yo pi apwopriye pase barcodes mini, kòm ansyen yo refere a youn oswa plis nikleyotid ki inik nan yon espès epi yo ka efektivman itilize pa anpil teknik molekilè, tankou ADN pwofil, mikwoflitik, ak bouk-medyatè anplifye (de Boer et al., 2015). Han et al. devlope siyati nikleyotid pou Panax ginseng, Angelica Sinensis, ak Lonicera japonica ak avèk siksè idantifye medikaman yo ki asosye ak medikaman patant Chinwa (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

pwodwi fonksyonèl ki genSisanHerba. Espesyalman, nou (1) devlope kat siyati nikleyotik ak sis pè prensipal espesifik pou diferan natif natalSisanHerba ak li te ye adiltè, (2) valide kat siyati nikleyotid nan eksperyans ki gen ladan melanj de koupon taksonomik yo itilize pou prepare pwodwi Cistanches Herba ki gen tou de engredyan natif natal ak adiltè, ak (3) fè yon sondaj sou mache nan 66SisanPwodwi herba atravè siyati nikleyotid yo.

Sispanngen anpil efè epi li ka amelyore fonksyon ren

materyèl ak metòd

Echantiyon Koleksyon ak Preparasyon

Nan total, 251 echantiyon yo te ranmase soti nan Inner Mongoli, Xinjiang, ak Ningxia, nan mitan lòt zòn; echantiyon sa yo enkli 214Cistanches Herbaak 37 adiltè epi yo detaye nan tab siplemantè S1. Korespondan echantiyon vouche yo te valide pa taksonomis ak depoze nan Herbarium nan Enstiti a nan Devlopman Plant Medsin, Akademi Chinwa nan Syans Medikal, Beijing, Lachin. Yon total de 35 pakèt poud, epis, ak ekstrè nanSisanHerba te achte nan magazen sou entènèt ak dwòg brik-ak-mòtye nan Beijing ak Chengdu (Table 1). Nan total, 31 pakèt nan medikaman patant Chinwa ki gen ladanSisanHerba te achte nan diferan dwòg (Tab 2), ak konpozisyon yo deklare nan diferan medikaman patant Chinwa yo montre nan Tablo Siplemantè S3. Karakteristik mòfolojik diferan nan diferan fòm dòz yo montre nan Figi 1.

Echantiyon melanje: Poud nan Ci.dezèkolòm, Ci.tibouloz, Cy. songaricum, Ci. sinensi, B. Rossica, ak O. coerulescens yo te atifisyèlman melanje nan konbinezon diferan (nan yon rapò 1:1) anvan ekstraksyon. Detay yo nan echantiyon sa yo melanje yo montre nan lejand la nan Figi 3. Anplis de sa, poud yo nan kat adiltè yo te melanje ak otantik Ci la. dezètekil nan diferan pousantaj pwa: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000: 1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 ak 60000:1 (Tab 3). Ak de pwodwi otantik yo melanje nan menm pwopòsyon yo.

Dekosyon: Tranch nan Ci. dezè ak Cy. yo te itilize changarik pou prepare dekourajman an. Tranch yo (10 g) yo te bouyi nan 300 mL nan dlo doub-distrè pou 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, ak 240 min ak Lè sa a, itilize pou ekstraksyon ADN.

Ekstraksyon ADN, Reyaksyon Polymère Chèn (PCR) Anplifikasyon, ak Sekans

Echantiyon, dekozyon, ak echantiyon melanje: echantiyon yo (40- 50 mg) yo te tè nan poud amann atravè yon Retsch MM400 mobil miksè (Retsch co, Almay) nan yon frekans nan 30 Hz. ADN jenomik la te imedyatman ekstrè ak yon Plant Inivèsèl DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing co, Lachin) dapre enstriksyon manifakti a. ITS2 te anplifye pa primè inivèsèl 2F / 3R (Chen et al., 2010).

nan paralèl pou chak pakèt. Poud medikaman chinwa a lave ak 700 μL nan prewash tanpon [100 mM Tris-HCL, pH 8.0; 20 mM ethylenediaminetracetic asid (EDTA), pH 8.0;

700 mM NaCl; 2% polyvinylpyrrolidone (PVP)-40; ak 0.4% β-mercaptoethanol] plizyè fwa jiskaske supernatant la te klè ak san koulè, apre yo fin ki melanj lan te santrifye nan 7500 × g pou 5 min nan tanperati chanm. Presipitasyon an te imedyatman itilize pou ekstrè ADN jenomik atravè ADN Inivèsèl ADN Inivèsèl (Tiangen Biotech Beijing co.) selon enstriksyon manifakti a. Nan fen a, ADN nan chak pakèt te konsantre nan yon tib. Sis espès-espesifik pè primè-SYF1 / SYR1, HMRCF / HMRCR, GHRCF / GHRCR, CCRF / CCRR,

SCRF / SCRR, ak LDF / LDR-yo te fèt atravè Premye Minis

6.0 lojisyèl (Premier co, Kanada) anplifye Cistanches Herba ak adiltè li yo (detay yo montre nan tab 4). PCR te fèt nan yon reyaksyon 50 μL-volume ki gen 1 μL of

KOD FX (Toyobo co, Japon), 25 μL nan 2 × PCR buffer, 10 μL nan dNTPs (2 mM), 1.5 μL nan chak primè (10 μM), ak 4 μL (∼50 ng) nan modèl ADN; volim ki rete a te fèt nan dlo doub-distile. Reyaksyon yo te fèt pa

yon sik tèmik (VeritiTM 96-Byen tèmik Cycler, Aplied Biosystem co, USA); pwogram tèmik yo ki nan lis nan Tablo 4. Pwodwi PCR yo te egzamine atravè 3% agarose elektwofòez ak pirifye pou sekans bidirectional ak yon sekans ABI 3730XL (Aplike Biostems co.) an akò ak metòd la sekans Sanger. Lè sa a, sansiblite nan sis primè yo te teste atravè kantite tan reyèl PCR (QRT-PCR) atake ak yon sistèm CFX96 An tan reyèl (Bio-rad Lab., USA). Papòt sik yo te otomatikman kalkile pa sistèm lan atravè "PCR Baseline Subtracted Curve" modèl la. qRT-PCR te fèt nan yon reyaksyon 15 μL-volim ki gen 7.5 μL nan SYBR (X)R Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio co, Japon), 1.0 μL nan chak primè (10 μM), ak 1.0 μL nan modèl ADN ak volim ki rete a ki gen ladan dlo doub-distil. QRT-PCR a te fèt ak twa replik teknik ki baze sou ki erè estanda te kalkile.

Analiz sekans: Sekans yo te modifye ak manyèlman reyini atravè CodonCode Aigner 5.1.4 (CodonCode co, USA).

Sekans LI yo soti nan GenBank te anmède atravè modèl la Markov Hidden (HMM) jwenn sekans ITS2 (Keller et al., 2009). Sekans yo te Lè sa a, aliyen pa MEGA 5.0 lojisyèl atravè metòd aliyman "Misk" (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

Sispanngen anpil efè e li ka amelyoreRenFonksyon

REZILTA

Devlopman nan siyati Nucleotide ak espès-espesifik pè primè pou Cistanches Herba ak Adiltè

Anplifikasyon PCR a ak sekans pousantaj siksè nan echantiyon yo 251 yo te 100% lè pè a premye 2F / 3R te itilize. Longè alimantè a nan Cy. sekans songarik ITS2 yo te 229 bp (Figi Siplemantè S1). Analiz de sekans yo ki soti nan espès yo herbarium ak sa yo ki nan espès ki gen rapò ak espès ki gen rapò ak GenBank (Tab siplemantè S2) revele de yon sèl polymorphisme (SNP) sit pou Cy. changarik. Sou baz SNP yo, yon sèl Cy. songaricum-espesifik 30- bp nikleyotid siyati (5′-caattattg aggtcattg taagagagcgt-3') te devlope (Figi 2A). Rezilta Aliyman Lokal debaz (BLAST) rezilta nan NCBI te demontre ke siyati nikleyotik sa a te inik nan Cy. chante (Tab 5). Avèk yon analiz ki sanble ak sekans yo soti nan espès ki gen rapò ak pre, youn nan de SNP yo te dekouvri soti nan Ci. sinensis, B. rossica, ak O. coerulescens. Sou baz SNP yo, siyati nikleyotid yo pou lòt twa adiltè yo te devlope menm jan an tou, ki gen ladan yon siyati 34 bp (5′-cgatgatgcga, ggatgcaggg ccgg-3′) pou Ci. Sinensis, a 37 bp siyati (5′- acactgcct cccgtgcgca acgacg gccggtc-3') pou B. rossica, ak yon siyati 31 bp (5′-gtctggatggtg tcgatgatgtg ttgctgatgtg g-3′) pou O. coerulescens (Figi 2BD). Analiz BLAST nan NCBI revele tou ke siyati nikleyotid sa yo te espesifik epi yo pa prezan nan nenpòt lòt espès (Tablo 5).

Cistanches Herbaak adiltè li yo ta ka anplifye an menm tan soti nan melanj atravè pè a 2F / 3R inivèsèl primè. Se konsa, nou fèt espès-espesifik pou anplifikasyon siyati nikleyotid pa aliyen sekans ITS2 yo. Kat pè premye primè espesifik-SYF1 / SYR1, CCRF / CCRR, SCRF / SCRR, ak LDF / LDF - yo te fèt anplifye siyati yo nikleyotid nan Cy. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis, ak O. coerulescens, respektivman (tab 4). Longè anplik yo te 123, 72, 131, ak 71 bp, respektivman.

Anplis de sa, yon total de 214 sekans ITS2 soti nan materyèl Eksperimantal Cistanches Herba yo te analize. De kout primè espesifik-HMRCF / HMRCR ak GHRCF / GHRCR pou Ci. dezè ak Ci. tibulosa, respektivman-yo te fèt anplifye rejyon yo kout nan echantiyon yo degrade (Tab 4). Longè anplik yo te 132 ak 134 bp, respektivman.

Validasyon nan Siyati Nikleyotik ak Espès-Espesifik Metòd Primè ki baze sou Melanj Atifisyèl ak Dekosyon

Efikasite anplifikasyon nouvo pè prensipal yo te valide nan melanj lan. Pwodwi PCR yo te jwenn atravè chak pè primè pou chak espès vize, jan yo montre

valè kkwi nan B. Rossica oswa O. coerulescens ta ka jwenn menm pwopòsyon de echantiyon yo te 30000:1 oswa 40000:1, ak rezilta anplifikasyon nan Ci. sinensis, Ci.tibouloz, ak Ci deserticola ta ka detekte lè rapò a te 2000:1. Men, pa gen okenn rezilta detekte ta ka jwenn pou Cy. changarik lè li konstitye pwopòsyon de 2000:1.

Pou verifye si wi ou non metòd siyati nikleyotid la fonksyon ak materyèl trete, dekoksyon nan Ci. dezè ak Cy. yo te prepare changarik la. Rezilta yo te montre ke badj la kout soti nan Ci. dezètekilòt ta ka anplifye, menm apre echantiyon yo te bouyi pou 210 min. Anplis de sa, siyati nikleyotid la nan Cy. chante ta ka anplifye apre echantiyon yo te bouyi pou 150 min, pandan y ap pa gen okenn pwodwi PCR yo te detekte apre echantiyon yo te bouyi pou 210 oswa 240 minit (Figi 4). Rezilta yo sekans demontre ke siyati a kout nikleyotid te avèk siksè jwenn nan dekorasyon an.

Sondaj sou mache adiltè atravè Siyati Nikleyozòn ak Primè espesifik

Metòd ki anwo a te aplike pou deteksyon an nanSisanPwodwi Herba sou mache a. Trannde pakètSisanTranch herba, poud, ak ekstrè yo te anplifye ak sekans lè l sèvi avèk sis primè espesifik (rezilta agarose elektwofòn yo montre nan Figi Siplemantè S2 ak sekans yo ki nan lis nan Done Siplemantè Fèy 1). Analiz de sekans yo atravè siyati nikleyotid yo revele ke senk pakèt tranch yo te natif natal. Yon pakèt tranch ak yon pakèt poud te ranplase ak Cy. changarik ak yon ekstrè yo te ranplase ak Ci. sinensis. Lòt sis pakèt poud yo te melanje: senk yo te adiltre ak Cy. songarik ak Ci. sinensis ak youn te adiltre ak Cy. chante (Tab 1). Anplis de sa, yo te ranplase yon pakèt tranch ki te ranplase ak Salvia miltiorrhiza.

Cistanches Herba nan medikaman patant Chinwa sibi nan divès pwosesis ki fè otantifikasyon difisil. Kapasite nan sis pè prensipal yo anplifye espès-espesifik rejyon siyati nikleyotik soti nan medikaman yo patant Chinwa te teste (rezilta yo jèl elektwofònez yo montre nan Figi Siplemantè S2). Pifò medikaman patant Chinwa gen eleman nan diferan kalite espès yo. Pou egzanp, Shihu Yeguang grenn (ZCY34) gen 25 engredyan, ki gen ladan Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu), ak Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). Soti nan engredyan sa yo, Cistanches Herba ta ka anplifye espesyalman atravè pè a premye GHRCF / GHRCR. Sekans dirèk nan pwodwi yo PCR revele tras trè pwòp. Sepandan, yon gwoup vizib pa t 'kapab jwenn ak pè a premye pè HMRCF / HMRCR.

Yon lòt egzanp se Kangguzhi Zengsheng grenn (ZCY44). Gen uit engredyan nan adisyon aSisanHerba nan medikaman patant Chinwa sa a, men pa te gen okenn gwoup vizib jwenn pa swa GHRCF / GHRCR oswa HMRCF / HMRCR, ki vle di ke nonCistanches Herbate prezan. Sepandan, rejyon adiltè a nan Cy. songaricum te avèk siksè anplifye pa pè a premye pè espesifik SYF1 / SYR1. Rezilta sekans lan te demontre siyati nikleyotid nikleyotid la nan Cy. changarik la te avèk siksè jwenn.

Sispanngen anpil fonksyon e li genanti enflamatwakonsekans yo