PATI 1 Relasyon regilasyon ant varyasyon kalite ak anviwònman Cistanche Deserticola nan twa ekotip ki baze sou analiz mikrobyom tè

Anviwònman an afekte konpozisyon ak fonksyon mikrobyom tè a, ki enfliyanse endirèkteman kalite plant yo. Nan etid sa a, yo te itilize sekans anplikon 16S pou revele diferans ki genyen nankonpozisyon kominote mikwòb tè a nanCistanche deserticolanan twa ekotip (tè saline-alkali, preri, ak tè sab). atravè analiz korelasyon nan abondans kominote mikwòb, kontni glikozid fenilethanoid, ak faktè ekolojik, relasyon regilasyon ant kominote mikwòb ak varyasyon kaliteC. deserticolate ekspoze. pwofil fonksyon metabolik mikrobyom tè a te prevwa lè l sèvi avèk Tax4Fun. Done yo te montre ke kominote mikwòb tè yo nan twa ekotip yo te siyifikativman diferan (AMOVA, P < 0.001),="" ak="" divèsite="" alfa="" nan="" kominote="" mikwòb="" tè="" preri="" a="" te="" pi="" wo="" a.="" analiz="" debaz="" mikrobyom="" demontre="" ke="" kominote="" mikwòb="" tè="" yo="">C. deserticolayo te sitou te gen yon sechrès, tolerans sèl, rezistans alkali, ak rezistans estrès, tankou Micrococcales ak Bacillales. Biomarkers yo, sètadi, oceanospirillales (saline-alkali tè), Sphingomonadales (preri), ak propionibacteriales (tè sab), ka distenge twa kominote mikwòb ekotip, yo te fouye nan LEfSe ak forè o aza. Rezilta analiz korelasyon yo demontre ke 2′-acetylatteoside pozitivman korelasyon ak oceanospirillales nan tè saline-alkali. Des fonksyon metabolik yo montre metabolis trè rich (idrat kabòn ak metabolis asid amine) ak pwosesis enfòmasyon sou anviwònman an (transpò manbràn ak transdiksyon siyal). an jeneral, konpozisyon an ak fonksyon nan mikrobyom tè yo te jwenn yo dwe faktè enpòtan nan varyasyon nan kaliteC. deserticolanan diferan ekotip. Travay sa a te bay nouvo apèsi sou relasyon regilasyon ant anviwònman an, kominote mikwòb tè a, ak varyasyon kalite plant yo.

Plis enfòmasyon tanpri kontakte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola gen anpil efè, klike isit la pou konnen plis

Cistanche deserticolase yon plant parazit ki pa fotosentetik ki ka grandi nan abita sèk, tankou tè sab ak twou rivyè sèk, osi byen ke nan kondisyon estrès, tankou saline-alkali land1. Plant sa a parazit sou rasin psammophyte Haloxylon ammodendron, ki montre gwo rezistans nan kondisyon anviwònman piman bouk2. Plant yo konte sou entèraksyon benefis ant rasin ak mikwo-òganis pou jwenn eleman nitritif, ankouraje kwasans ak reziste estrès ekstèn3. Pandan se tan, mikwòb tè a gouvène sik byojeochimik makronutriman, mikronutriman ak lòt eleman ki enpòtan anpil pou kwasans plant4. Sepandan, relasyon ki genyen antC. deserticolaak mikwo-òganis tè rizosfè rete klè. Kontinwe, prezante mikrobyom nan tè rizosfè nanC. deserticolase nesesè.

C. deserticolase souvan itilize nan Azi de Lès, Azi Santral, Afrik Dinò ak lòt peyi kòm yon kalite manje ak swen sante medikaman pou amelyore memwa, amelyore fonksyon seksyèl ak pwoteje fwa a5,6. Engredyan prensipal yo aktif nanC. deserticolase glikozid phenylethanoid (PhGs), iridoid, lignans ak polisakarid. Pami eleman sa yo, PhG yo se eleman aktif7. Etid anvan te rapòte ke kontni an nan PhGs nan diferan ekotip nanC. deserticolakonsiderableman diferan, pami yo ta ka itilize 2′-acetylatteoside kòm yon makè chimik pou distengeC. deserticolapwodui nan Xinjiang ak Inner Mongolia1. Etid sou kominote mikwòb yo te montre ke kominote mikwòb yo ka kontwole metabolis lame yo8,9. Se poutèt sa, yon konparezon nan relasyon ki genyen ant kominote mikwòb ak metabolit nan tè a rizosfè nanC. deserticolaan ekotip diferan se ijan bezwen.16S anplikon sekans nan echantiyon tè rizosfè plant yo te fèt yo eksplore divèsite nan kominote mikwòb, bay nouvo apèsi sou relasyon ki genyen ant plant ak kominote mikwòb tè10,11. Pou egzanp, Asosyasyon an nan distribisyon an ak dinamik nan fongis andofitik ak C. songaricum ak N. tangutorum te envestige nan syans mikrobiom lè l sèvi avèk sekans segondè-debi11. Nan etid sa a, nou te fè sekans anplikon 16S rRNA pou jwenn mikrobyom tè a.C. deserticolanan diferan ekotip. Yo te konpare diferans ki genyen nan kominote mikwòb tè a nan divès kalite ekotip tou, epi yo te defouye byomaketè ki te kapab distenge twa ekotip yo. Apre sa, yo te kalkile analiz korelasyon atravè abondans kominote mikwòb kle yo, kontni PhG yo ak faktè ekolojik yo, epi yo te eksplore relasyon regilasyon an. Finalman, fonksyon tè microbiomes deC. deserticolanan diferan ekotip te prevwa.

Materyèl ak Metòd

Etid deskripsyon sit ak echantiyon.Dapre envestigasyon feld,C. deserticolagen twa ekotip prensipal, ki gen ladan tè saline-alkali, preri ak tè sab. Nan mwa avril 2017, nou te kolekte echantiyon tè ki reprezante pi gwo ekotip yoC. deserticolanan Lachin. Echantiyon tè nan tè saline-alkali yo te kolekte nan Ebinur Lake (AB1, AB2, AB3) ak Baiicheng Beach (BJ1, BJ2, BJ3, BJ4, BJ5) nan pwovens Xinjiang. Yo te pran echantiyon tè preri nan vil Tula (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5) nan pwovens Xinjiang. Yo te ranmase echantiyon tè nan tè Sandy nan Alxa (AL1, AL2, AL3, AL4, AL5, AL6) nan pwovens Inner Mongolia ak konte Minqin (GS1, GS2), konte Changcheng (GS3, GS4) nan pwovens Gansu. Enfòmasyon sou lonjitid, latitid ak altitid tout pwen echantiyon yo montre nan Tablo 1 ak Fig. 1. Nan sit la feld, nou te itilize yon egzèsis silendrik asye pur ak yon dyamèt 5 cm pou kolekte tè a adjasan a tij sukulan nan.C. deserticolaak lame li a, epi imedyatman estoke li nan yon frijidè pòtab nan -20 degre. Apre transpòte yo nan laboratwa a, echantiyon tè yo te pase nan yon tami 2-mm pou retire tisi plant yo, rasin, wòch, elatriye epi estoke nan -20 degre nan yon frijidè anvan plis eksperyans.

Ekstraksyon ADN ak 16S rRNA Sekans.Yo te retire ADN tè lè l sèvi avèk Twous Izolasyon ADN PowerSoil (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) apre manyèl la12. Pite ak bon jan kalite ADN jenomik la te tcheke pa 0.8 pousan jèl agarose elektwoforèz ak nanodrop.

Rejyon hypervariable V3-V4 nan jèn bakteri 16S rRNA te anplifye ak primè 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) ak 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)13. Pou chak echantiyon tè, yo te ajoute yon sekans kòd bar 10-chif nan fen 5′ nan premye ak ranvèse primè yo (Allwegene Company, Beijing)12. Yo te fè PCR la sou yon Gradient Mastercycler (Eppendorf, Almay) lè l sèvi avèk 25 ul volim reyaksyon ki gen 12.5 ul KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix, 1 µl Jadendanfan Avant (5 µM), 1 µl Jadendanfan ranvèse (5 µM), 5 µl ADN (kantite modèl total se 30 ng) ak 5.5 µl H2O. Paramèt monte bisiklèt yo jan sa a: 95 degre pou 5 min, ki te swiv pa 28 sik nan 95 degre pou 45 s, 55 degre pou 50 s ak 72 degre pou 45 s, ak yon ekstansyon fnal nan 72 degre pou 10 min. Yo te mete twa pwodwi PCR pou chak echantiyon pou diminye patipri PCR nan nivo reyaksyon yo. Pwodwi PCR yo te pirifye lè l sèvi avèk yon QIAquick Gel Ekstraksyon Twous (QIAGEN, Almay) ak Lè sa a, quantifiée lè l sèvi avèk PCR14 an tan reyèl.

Sekans gwo twou san fon yo te fèt sou yon platfòm MISeq nan Konpayi Allwegene (Beijing). Apre kouri a, analiz imaj, apèl baz ak estimasyon erè yo te fèt lè l sèvi avèk Illumina Analysis Pipeline Version 2.614.

Cistanchetubulosa ka anti-aje

Analiz done.Done anvan tout koreksyon yo te tcheke, epi yo te retire sekans yo baze sou konsiderasyon sa yo: sekans ki pi kout pase 200 bp ak nòt kalite ki ba (mwens pase oswa egal a 20) epi yo te genyen baz ki pa klè oswa yo pa t matche. sekans Jadendanfan yo ak tags barcode15. Lekti ki kalifye yo te separe lè l sèvi avèk echantiyon-espesifik sekans kòd bar yo epi koupe ak Illumina Analiz Pipeline Version 2.6. Lè sa a, yo te analize done yo lè l sèvi avèk QIIME. Sekans yo te gwoupe nan inite taksonomik operasyonèl (OTU) nan yon nivo resanblans 97 pousan 16 pou jenere koub rarefaksyon ak kalkile endis richès ak divèsite yo. Yo te itilize zouti Ribosomal Database Project Classifer pou klasifye tout sekans yo nan diferan gwoup taksonomik15. Yo te fè analiz gwoupman dapre enfòmasyon OTU ki soti nan chak echantiyon lè l sèvi avèk R pou egzamine resanblans ki genyen ant diferan echantiyon17. Matris UniFracdistances ant kominote mikwòb ki soti nan chak echantiyon yo te kalkile lè l sèvi avèk koyefisyan Tayc la epi yo te reprezante kòm yon metòd pè-gwoup san pondere ak pye bwa regroupman aritmetik mwayen, ki dekri diferans (1-resanblans) pami plizyè echantiyon yo18. Yon ti pyebwa ki gen fòma Newick te pwodwi tou atravè analiz sa a. Divèsite alfa te aplike nan analiz konpleksite divèsite espès pou yon echantiyon lè l sèvi avèk kat endis, ki gen ladan Chao1, espès obsève, divèsite filojenetik (PD) pye bwa antye ak endèks divèsite Shannon. Endis sa yo te kalkile lè l sèvi avèk lojisyèl QIIME (Boulder, CO, USA) nan Python (v.1.8.0) (La Jalla, CA, USA)19. Yo te itilize analiz divèsite beta pou evalye diferans echantiyon yo an tèm de konpleksite espès yo. Yo te kalkile divèsite beta lè l sèvi avèk analiz kowòdone prensipal (PCoA) ak analiz gwoup nan QIIME20. Analiz de divèjans molekilè (AMOVA) te fèt lè l sèvi avèk mothur. EdgeR te itilize pou kalkile diferans OTU ant gwoup yo. Yo te itilize Heatmap.2 pou trase kat chalè a, alòske Ggplot te itilize pou trase kat Manhattan.

Detèminasyon biomarker ak mikrobyom nwayo.Analiz lineyè diskriminasyon (LDA) ak metòd forè o aza (RF) nan sitwèb Microbiome Analyst21 yo te itilize pou detèmine mikrobiom biomarker la.

Sitwèb la premyèman fè tès sòm-rank Kruskal-Wallis ki pa parametrik pou idantifye karakteristik ki gen abondans diferansyèl siyifikatif konsidere faktè eksperimantal oswa klas enterè, ki te swiv pa LDA pou kalkile gwosè efè chak karakteristik diferan abondan21. Karakteristik yo konsidere kòm siyifikatif dapre valè p ajiste yo. Defo adj.p-valè koupe=0.05. Analiz RF fèt lè l sèvi avèk pake randomForest5. RF se yon algorithm aprantisaj sipèvize ki apwopriye pou analiz done ki gen gwo dimansyon. Metòd sa a itilize yon seri pye bwa klasifikasyon, chak nan yo grandi atravè seleksyon owaza karakteristik nan yon echantiyon bootstrap nan chak branch22. Microbiome Analyst te adopte analiz nwayo a nan fonksyon debaz nan mikwo-byome R pake a

analiz korelasyon nan kominote mikwòb kle yo, kontni PhGs ak faktè ekolojik.Sa ki nan sèt glikozid phenylethanoid (PhGs) nan twa ekotip yo nan C. deserticola, sètadi, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, 2′-acetylatteosid, tubuloside A ak cistanoside F, yo te detèmine atravè HPLC. Kondisyon kwomatografik yo enplike yon kolòn Waters C18 (150 mm × 3.9 mm, 4.6 μm), ak faz mobil la gen asetonitrile ak 0.2 pousan asid fòmik. Anviwònman kwomatografi yo te jan sa a: 0-10 min, 10 pousan → 15 pousan A; 10–30 min, 15 pousan → 40 pousan A. Pousantaj fow la te 1 mL/min. Longèdonn absòpsyon, volim piki ak tanperati kolòn yo te 330 nm, 10 μL ak 27 degre, respektivman. Etid metodoloji a refere a travay eksperimantal preliminè gwoup referans la1.

Etid sa a kolekte 16 estasyon meteyorolojik tou pre twa kalite ekolojik yoC. deserticolaXinjiang Bole 51238, Tacheng 51133, Tori 51241, Karamay 51243, Buxail 51156, Yumin 51137, Emin

51145, Gansu Minqin 52681, Yongchang 52674, Wuwei 52679, Gulang 52784, Inner Mongolia Suikou 53419, Hangjinhouqi 53420 ak Wuhai 53512. Done sèt faktè klimatik ki soti nan 1981 sèvi kòm analiz klimatik koreksyon done kòm faktè koreksyon.

Redundancy analysis of diferential metabolites and bioclimatic factors was performed by using Canoco 5 software23. Pearson correlation coefcient was calculated for biomarker microbiome abundance, compound con- tent and ecological factor data integration. In this study, the log2 data conversion was uniformly performed before the analysis. SPSS was used to calculate the Pearson correlation coefcient of the six biomarkers, six core micro- biomes, seven main active components of C. deserticola and the ecological factors in the three habitats, and the screening standard was as follows: pearson correlation coefcient (r) >{{0}}.5 ak valè p < 0.05.="" relasyon="" yo="" pami="" faktè="" ki="" anwo="" yo="" te="" vizyalize="" lè="" l="" sèvi="" avèk="" cytoscape24="" (the="" cytoscape="" consortium,="" san="" diego,="" ca,="" usa,="" vèsyon="" 3.7.0)="" ak="" pheatmap="" (r="">

Prediksyon pwof fonksyonèl mikwòb nan mikrobyom la.Tax4Fun25 (R package, http:// tax4fun.gobics.de/) te itilize pou predi mikwòb fonksyonèl profles microbiomes nan echantiyon tè yo. Yo te itilize tab OTU Biom nan mikrobyom tè kòm yon fle opinyon pou imputasyon metagenom nan echantiyon tè C. deserticola. Lè sa a, yo te analize abondans klas jèn yo prevwa nan nivo gwoup KEGG Orthology (KO) 3. Rezilta Tax4Fun yo te analize nan doBy (R package)26.

Rezilta yo

Konpozisyon kominote mikwòb. The 16S rRNA sequencing resulted in 834,323 raw reads, amongst which 522,929 passed the quality and length fltering. The data set comprised 20,511–48,337 (mean: 33,994) sequences per sample. The high-quality reads were clustered using >97 pousan idantite sekans nan 3541 OTU mikwòb (Tablo 1).

Kominote mikwòb la te jeneralman klase nan 19 phyla, 46 klas ak 87 lòd (figi 2a, b ak S1-S3). Nan nivo filòm, Aktinobakteri (35 pousan), Proteobacteria (31 pousan) ak Firmicutes (15 pousan) te dominan nan tè saline-alkali. Preri a te domine ak Actinobacteria (37 pousan), Proteobacteria (29 pousan) ak Bacteroidetes (9 pousan). Nan tè sab, Aktinobakteri (42 pousan), Proteobacteria (33 pousan) ak Firmicutes (6 pousan) te dominan. Nan nivo klas la, Aktinobakteri (25 pousan), Gammaproteobacteria (21 pousan) ak Bacilli (15 pousan) te dominan nan tè saline-alkali, alòske Aktinobakteri (22 pousan), Alphaproteobacteria (16 pousan) ak Bacilli (8 pousan) te dominan nan preri. Nan tè sab, Aktinobacteria (23 pousan), Alphaproteobacteria (20 pousan) ak Gammaproteobacteria (9 pousan) domine. Nan nivo lòd (figi 2c–e), Micrococcales (22 pousan), Oceanospirillales (15 pousan) ak Bacillales (15 pousan) te dominan nan tè saline-alkali. Micrococcales (11 pousan) ak Bacillales (8 pousan) domine nan savann. Kidonk, lòd bakteri ki pi dominan yo te Micrococcales (10 pousan) ak Acidimicrobial (7 pousan).

Divèsite bakteri tè nan twa ekotip C. deserticola.Mezi divèsite nan echantiyon an (-divèsite) revele yon gradyan divèsite pami twa abita yo (Fig. 2f ak Tablo S1). Divèsite alfa nan kominote mikwòb bakteri tè a nan chak echantiyon te estime lè l sèvi avèk richès nan kominote a (Chao 1, ki te eksprime kòm kantite total prevwa OTU nan chak echantiyon), espès obsève, PD pyebwa antye ak endèks divèsite Shannon. Espès yo obsève, Chao 1 ak PD endis pyebwa antye sijere ke kominote tè preri yo te gen divèsite ki pi wo a, alòske divèsite tè saline-alkali ak tè sab yo sanble. Rezilta yo nan koub therarefaction (Fig. S1) yo sanble ak rezilta ki anwo yo.

Acteosidenansistanchgen bon efè souren

Rezilta AMOVA yo (Tablo S2) te montre ke p < 0.001,="" ki="" endike="" yon="" diferans="" enpòtan="" pami="" twa="" abita="" yo.="" rezilta="" gwoupman="" pyebwa="" divèsite="" distans="" bray="" (fig.="" s2)="" nan="" twa="" echantiyon="" tè="" abita="" yo="" te="" montre="" echantiyon="" tè="" saline-alkali="" yo="" te="" byen="" regroupe,="" epi="" distans="" ant="" echantiyon="" tè="" sab="" ak="" salin="" yo="" te="" pre.="" rezilta="" pcoas="" san="" kontrent="" nan="" simitye="" unifrac="" distans="" 2d="" ki="" pa="" pondéré="" (figi="" 2g)="" te="" montre="" ke="" echantiyon="" tè="" diferan="" nan="" kominote="" mikwòb="" bakteri="" ki="" soti="" nan="" abita="" diferan="" yo="" te="" byen="">

konparezon kominote bakteri tè twa ekotip c. deserticola.Diferan OTU abondans heatmapsand volcano map(Fig. 3b,e,d,h and Table S3) te endike ke konpare ak echantiyon tè sab, 24 ak 17 OTU yo te respektivman anrichi ak apovri nan tè saline-alkali nan nivo lòd. Anplis de sa, konpare ak echantiyon tè sab, 8 ak 11 OTU yo te respektivman anrichi ak apovri nan savann lan. Dyagram Venn an (Fig. 3c,f) montre ke 216 OTU yo te vin pi piti nan tè sab, 8 yo te vin pi piti nan saline-alkali.

tè ak 1 OTU sipèpoze ant saline-alkali ak tè sab. Anplis de sa, 3 OTU yo te anrichi nan savann, alòske 161 yo te anrichi nan tè sab, ki gen ladan 6 OTU ki te sipèpoze ant savann ak tè sab. Konplo Manhattan yo (Fig. 3a) te demontre ke Xanthomonadales yo te plis rich ak apovri nan tè saline-alkali pase sa yo ki nan tè sab, pandan y ap Xanthomonadaceae bakteri WWH73, WD2101 gwoup tè, Vibrionales ak Verrucomicrobiales te siyifikativman apovri nan nivo lòd. Konpare savann ak tè sab, Xanthomonadales, gwoup tè WD2101, Vibrinales ak Verrucomicrobiales te siyifikativman apovri.

Cistanchedeserticola gen anpil efè sou tretmandyabèt

Detèminasyon biomakè ak mikrobyom nwayo nan twa ekotip C. deserticola.Metòd LEfSe ak RF (figi 4a,b,d) yo te itilize pou idantifye karakteristik ki gen abondans diferansye siyifikatif atravè echantiyon tè yo, kalkile gwosè efè chak karakteristik diferan abondan epi detèmine mikrobyom bakteri biomakè nan twa abita yo nan nivo lòd. . Rezilta yo prezante nan Tablo S4 te revele ke nòt LDA nan Oceanospirillales, Bacillales ak Flavobacteriales te pi wo a pami sa yo ki nan tè saline-alkali, alòske sa yo ki nan Sphingomonadales, Gaiellales, Rubrobacteriales, Burkholderiales ak Sphingobacteriales te pi wo a pami sa yo ki nan preri. Nòt LDA Propionibacteriales, Rhodospirillales, Solirubrobacterales, Rhizobiales, Xanthomonadales ak Pseudonocardiales te dominan nan peyi Sandy. Avèk esklizyon lòd ki pa finn ak kopi, yo te klase OTU sa yo an sis lòd, epi abondans yo te trase nan yon kat chalè (Fig. 4c).

Metòd pèsistans lan te adopte nan fonksyon debaz nan mikrobyom nan pake R pou idantifye mikrobyom debaz la nan twa ekotip C. deserticola. Mikwòm bakteri debaz sa a te genyen sis lòd, ki gen ladan Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobial, Streptomycetales and Sphingomonadales. Avèk esklizyon lòd endefned ak kopi, yo te klase OTU sa yo an sis lòd, epi abondans yo te trase nan yon kat chalè (Fig. 2h).

Metòd pèsistans lan te adopte nan fonksyon debaz nan mikrobyom nan pake R pou idantifye mikrobyom debaz la nan twa ekotip C. deserticola. Mikwòm bakteri debaz sa a te genyen sis lòd, ki gen ladan Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobial, Streptomycetales and Sphingomonadales. Avèk esklizyon lòd endefned ak kopi, yo te klase OTU sa yo an sis lòd, epi abondans yo te trase nan yon kat chalè (Fig. 2h).