Pati 1: echinacoside pwovoke lanmò selil kansè apoptotik pa anpeche anzim dezenfektan pisin nukleotid MTh1.

Kontakte:joanna.jia@wecistanche.com

Résumé:Anpèchman nan anzim dezenfektan pisin nukleotid MTH1 lakòz anpil domaj oksidatif ADN ak apoptoz nan selil kansè yo e kidonk yo ka itilize kòm yon estrateji antikansè. Kòm pwodwi natirèl yo te yon sous rich nan pwodwi chimik medsin, nan etid la prezan, nou te itilize MTH1-reaksyon anzimatik katalize kòm yon gwo-debi nan yon tès tès depistaj vitro pou chèche konpoze natirèl ki kapab anpeche MTH1.Echinacoside, yon konpoze ki sòti nan plant medsin yoCistancheak Echinacea, efektivman anpeche aktivite katalitik MTH1 nan yon tès in vitro. Tretman plizyè liy selil kansè moun akEchinacosidete lakòz yon ogmantasyon siyifikatif nan nivo selilè guanin oksidize (8-oxoguanine), pandan y ap nivo espès oksijèn reyaktif selilè a pa chanje, sa ki endike keEchinacosidetou inibit aktivite a nan selilè MTH1. Kontinwe, tretman Echinacoside pwovoke yon ogmantasyon imedya ak dramatik nan makè domaj ADN ak upregulation nan G1 / S-CDK inibitè p21 la, ki te swiv pa ki make lanmò selil apoptotik ak arè sik selil nan kansè men se pa nan selil ki pa kansè. Ansanm, etid sa yo idantifye yon konpoze natirèl kòm yon inibitè MTH1 epi sijere ke pwodwi natirèl yo ka yon sous enpòtan nan ajan antikansè.

Mo kle: Echinacoside, MTH1, 8-oxoG, domaj ADN, apoptoz, arete sik selilè

Cistancheekstrè genanti-kansèbenefis sante

Klike la a nan Pati 2

Entwodiksyon

Pisin selilè ak mitokondriyo nukleozid trifosfat (NTP) ak deoksinukleozid trifosfat (dNTP) se yon sib enpòtan nan divès espès oksijèn reyaktif (ROS). enkòpore nan ADN ki fèk sentèz pou lakòz aberasyon jenetik si yo pa fikse.6 Pa egzanp, pi gwo baz oksidize nan pisin nukleotid la, 8-oxoguanine (8-oxoG), ka baz pè ak sitozin ak adenin. Lè yo mete l nan adenin opoze pandan replikasyon ADN, li kapab lakòz T: A=G: C transvèsyon,7 ki se youn nan mitasyon ki pi komen yo jwenn nan kansè imen.8,9 Malgre ke pi fò nan dNTP gratis oksidize yo. yo retire nan anzim dezenfektan pisin nukleotid, etid nan tan lontan an te revele ke pisin nan nukleotid se toujou yon sous enpòtan nan baz oksidize nan molekil ADN ak yon kontribitè enpòtan nan domaj ADN oksidatif.3,10 anzim ki pi enpòtan pou dezenfekte a nan nukleotid. Men, menm anba siveyans anzim dezenfektan pisin nukleotid yo, yon pòsyon enpòtan nan dNTP oksidize yo enkòpore nan ADN, ak baz nan molekil ADN kapab tou soksid dirèkteman pa ROS.6 Selil Lè sa a, konte sou estrateji pi elabore ki enplike divès kalite. ADN glikosilaz, tankou OGG1 ak MUTYH, ak pwosesis reparasyon ADN, ki gen ladan reparasyon baz eksizyon (BER) ak reparasyon dezakò (MMR), pou ranje baz pwoblèm nan molekil ADN.10,16,17 BER a. nd MMR nòmalman repare anpil baz oksidize nan ADN chak jou epi konsa jwe wòl enpòtan nan pwoteje entegrite ak estabilite nan genòm nan.

Nan selil ki anba gwo estrès oksidatif, ogmante enkòporasyon nukleotid oksidatif nan ADN ka akable kapasite reparasyon selilè a epi deklanche repons domaj ADN (DDR).apoptoz, konsa mete yon baryè pou tumorigenesis.19 Poutan, byenke selil kansè yo montre tansyon oksidatif ki wo anpil epi jenere yon fado ki kapab letal nan nukleotid oksidize,20 yo ka siviv senesans ki asosye ak DDR oswaapoptoz.21 Yon gwo kantite etid yo montre ke MTH1, lè yo retire efektivman 8-oxodGTP ak 2-OH-dATP danjerezman abondan nan selil timè yo, jwe yon wòl kle nan devlopman kansè.22 MTH1 te Yo te jwenn twòp ekspresyon nan diferan kalite kansè,23–25 ak nivo 8-oxoG, ak limit blesi ADN oksidatif la te pi ba nan timè pase nan tisi nòmal ki antoure yo.26–28 Fonksyonèlman, twòp ekspresyon MTH1 te redwi anpil. kantite mitasyon ADN yo te wè nan fibroblasts anbriyon sourit ki gen MMR ki enfim10 epi ki te pèmèt selil yo simonte senesans selilè prematire ak apoptoz onkojenik Ras ki te pwovoke;29 alòske sipresyon MTH1 te anpeche devlopman kansè nan sourit OGG1-defisyan30 e li te ankouraje ROS-induit DDR ak senesans selilè nan Ras-transfòme selil.3,29,31 Kidonk, byenke MTH1 jwe yon wòl pwoteksyon nan anpeche ROS-induit mitasyon nan selil ki an sante, etid sa yo te jwenn ke MTH1 se patikilyèman obligatwa pou Aparisyon an ak siviv. nan selil kansè yo. Etid resan yo te bay plis prèv pou sipòte wòl MTH1 nan devlopman kansè.31–34 Sipresyon MTH1 pa RNAi oswa ti inhibiteurs molekil nan plizyè liy selil kansè yo te lakòz yon ogmantasyon siyifikatif nan enkòporasyon 8-oxo d G nan ADN jenomik. , ki mennen ale nan gwo domaj ADN, lanmò selil apoptotik, ak redwi siviv selil kansè yo.32,33 Nan syans ksenograf sourit, anpèchman nan MTH1 avèk efikasite siprime kwasans lan nan eksplant kansè. Sa ki enpòtan, siprime MTH1 pa t gen enpak sou kwasans ak siviv selil nòmal yo, pwobableman paske selil nòmal yo gen pi ba ROS e pakonsekan yo mwens depann sou MTH1 pou siviv.32,33 Konklizyon sa yo sijere ke anpèchman MTH1 se yon estrateji roman pwomèt pou konbat kansè.

Pwodwi natirèl yo te yon sous rich nan konpoze medsin.35 Anpil terapi modèn, ki gen ladan dwòg anti-kansè, te sòti nan preparasyon èrbal oswa botanik. yo dwe karakterize, lajman akòz difikilte nan kontwole konpozisyon yo defini san anbigwite efikasite yo ak mekanis nan aksyon.40 Nouvo apwòch ki pèmèt pou deteksyon nan konpoze aktif ak analiz de mekanis molekilè yo bezwen. Nan sans sa a, tès depistaj segondè-debi ki gide nan sib yo ka enstrimantal nan jwenn konpoze medsin ki defini mekanikman nan resous natirèl yo. Nan etid sa a, nou te itilize reyaksyon anzimatik ki katalize MTH1- kòm yon tès en vitro ki gen gwo pwodiksyon pou chèche konpoze natirèl ki ka anpeche MTH1. Surprenante, tès depistaj la revele saEchinacoside, yon pwodwi natirèl ki pi byen li te ye pou aktivite antioksidatif ki pisan li yo, se kapab anpeche MTH1.

Echinacosidenan cistanche kapabanti-apoptoz

Materyèl ak metòd

Materyèl

Konpoze natirèl èrbal yo te achte nan men Yuanye Byolojik Teknoloji co, Shanghai, Repiblik Pèp la nan Lachin. Non, nimewo katalòg, nimewo rejis Chemical Abstracts Service (CAS), ak pite chak konpoze yo endike nan Tablo S1. Solisyon Stock nan konpoze yo te prepare nan 100 pousan dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), ak solisyon k ap travay yo te prepare nan tanpon tès oswa mwayen kilti selil konplè. Yo te itilize menm solisyon an san yo pa konpoze tès la men ki gen menm kantite DMSO kòm kontwòl machin. (S)-crizotinib te achte nan men Selleck Chemicals, Houston, TX, USA.

tès depistaj in vitro

Egzamen anzimatik in vitro yo te itilize pou analize konpoze natirèl èrbal yo te swiv pwosedi Gad et al yo dekri yo.32 Yon ti tan, yo te prepare dilusyon seri konpoze endividyèl yo nan tanpon tès la ki gen 100 mM Tris-. acetate (pH 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg acetate, 0.005 pousan Tween 20, ak 1 mM DTT. Apre sa, 0.5 nM recombinant humanMTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), ak 0.2 U/mL pirofosfataz inòganik (Thermo Fisher Scientific) yo te ajoute, epi plak yo te enkube sou yon plak Shaker pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Volim reyaksyon final la te 100 μL nan yon plak 96-byen. Nan fen reyaksyon an, yo te ajoute malachite vèt (J&K Syantifik, Beijing, Repiblik Pèp la Lachin),41, epi plak yo te enkube nan tanperati chanm pou yon lòt 15 minit. Yon lektè microplate BioRad 680 te mezire absorpsyon nan 630 nm (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Valè konsantrasyon inhibitor (IC50) yo te detèmine pa analiz regresyon ki pa lineyè lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism la.

kilti selilè

Osteosarkòm MG-63 imen, SK-HEP-1hepatokarcinom, kansè nan tete MCF7, kansè kolorektal SW480, ren anbriyon HEK293, ak liy selil fibroblast NIH/3T3 sourit yo te soti nan American Type Culture Collection, ak nòmal imen an. liy selil fwa L-O2 te achte nan men KenGen Biotech, Nanjing, Repiblik Pèp la Lachin. Selil sa yo te kenbe nan 37 degre nan yon atmosfè imidite ak 5 pousan CO2, swiv enstriksyon founisè yo bay yo. Pa gen okenn deklarasyon etik obligatwa nan men Komisyon Konsèy la revizyon enstitisyonèl pou itilize nan liy selil sa yo.

Mezi nan nivo {{{0}}oxo Entraselilè 8-oxoG yo te mezire pa tach ak Cy3-avidin konjige.42 Yo te gen yon total de 1 × 104 selil. simen sou yon plak kouvri wonn nan 12-plak byen. Nan demen, selil yo te trete ak 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, oswa 80 μM Echinacoside pou 5 èdtan, 12 èdtan, oswa 24 èdtan epi yo te fikse ak glas. -frèt metanol pou 20 minit, ki te swiv pa enkubasyon nan Tris-tampon saline (TBS) ak 0.1 pousan Triton X-100 (Sigma-Aldrich) pou 15 minit. Echantiyon yo te bloke nan TBS ak 0.1 pousan Triton X-100 ak 15 pousan serom fetis bovin pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak Lè sa a, tache ak Cy3-avidin konjige (0.5 ug/mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) nan bloke solisyon pou 1 èdtan nan 37 degre. Apre yo fin lave yo nan saline ki gen tanpon fosfat (PBS) 3 fwa pou 5 minit, kouvèti yo te sele sou plak pwotèj ensèk an vè. , USA). Imaj yo te pran epi analize pa yon mikwoskòp konfokal Zeiss LCM 510.

Mezi nan nivo entraselilè ROS ROS yo te mezire pa sikometri koule lè l sèvi avèk yon twous tès ROS ki baze sou selil (Beyotime Biotechnology, Haimen, Repiblik Pèp la Lachin). Selil ki grandi nan plak sis byen yo te trete ak 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, oswa 80 μM Echinacoside pou 5 èdtan, 12 èdtan, oswa 24 èdtan, lave de fwa ak PBS, epi enkubate ak 10. μM dichlorofluorescein diacetate pou 30 minit nan 37 degre. Lè sa a, selil yo te trypsinize ak analize pa sitomèt koule FACCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Nivo entraselilè ROS yo te eksprime kòm mwayèn entansite fluoresans dichlorodihydrofluorescein nan selil yo. Nimewo yo montre yo te mwayèn twa eksperyans endepandan.

Tach imunofluoresan

Selil ki grandi sou kouvèti kouvèti yo te trete ak {{0}} μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, oswa 80 μM Echinacoside pou 5 èdtan, 12 èdtan, oswa 24 èdtan epi yo te lave yon fwa ak PBS, fiks ak 4 pousan paraformaldehyde nan PBS pou 20 minit, epi bloke nan TBS ak 0.1 pousan Triton X-100 ak 15 pousan serom fetis bovin pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Selil fiks yo te tache pou 2 èdtan nan tanperati chanm ak yon antikò prensipal kont 8-oxoG (sourit monoklonal anti{-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (antikò lapen-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery). , TX, USA), oswa kaspas aktif-3 (lapen anti-caspase-3, Bioss, Beijing, Repiblik Pèp la Lachin), ki te swiv pa tach ak yon Alexa 488-antisorit bourik konjige ( Abcam) oswa Cy3-konjige kabrit anti-lapen (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) segondè antikò pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Apre lave yo nan PBS 3 fwa pou 5 minit, kouvèti yo te sele sou glisad vè nan VECTASHIELD Mounting Medium ak DAPI (Vector Laboratories). Imaj yo te pran pa yon mikwoskòp konfokal Zeiss LCM 510.

tès fòmasyon koloni

Jou anvan tretman an, selil yo te simen nan yon plak sis pui nan yon konsantrasyon 1 × 104 selil pou chak pi. Lè sa a, yo te trete ak 0 μM, 60 μM, oswa 80 μM Echinacoside pou 7 jou. Apre yo fin lave ak PBS, selil yo te fiks ak metanol frèt ak tache ak solisyon kristal vyolèt (Sigma-Aldrich) (0.5 pousan nan 25 pousan metanol). Imaj yo te foto apre siye plak yo lannwit lan. Kristal vyolèt kristal yo te fonn lè w ajoute 70 pousan etanòl, epi yon lektè microplate BioRad 680 te mezire absòbe nan 595 nm. Done yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism la.

MTT tès

Yon jou anvan tretman an, selil yo te simen nan 96-plak byen nan yon konsantrasyon 1 × 104 selil pou chak pi, ki te swiv pa tretman ak dilusyon seri nan Echinacoside pou 24 èdtan oswa 48 èdtan, oswa ak 60 μM Echinacoside pou 5 èdtan, 12 èdtan. , oswa 24 èdtan. Yo te retire mwayen an, epi selil yo te lave ak PBS, epi apre sa, 20 μL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{15} }diphenyl tetrazolyum bromide (MTT) solisyon (5 mg/mL nan PBS, pH 7.2) (Thermo Fisher Scientific) te ajoute nan chak pi. Plak yo te enkube a 37 degre pou yon lòt 4 èdtan. Nan fen a, yo te retire solisyon MTT la epi yo te ajoute 150 μL DMSO nan chak pi. Plak yo te enkube sou yon plak Shaker pou 10 minit, epi absòbe a nan 570 nm te mezire pa yon lektè Microplate BioRad 680. Chak eksperyans te fèt de fwa an triple. Done yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism la. Valè IC50 yo te detèmine lè l sèvi avèk analiz regresyon ki pa lineyè.

analiz sik selilè

Selil ki nan plak sis-pou yo te trete ak 0 μM, 6{{10}} μM, oswa 80 μM Echinacoside pou 24 èdtan, rekòlte ak tripsin (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) , lave de fwa ak PBS, ak Lè sa a, fiks ak glas-frèt etanòl (70 pousan) pou 2 èdtan nan -20 degre. Selil fiks yo te lave de fwa nan PBS frèt epi yo te resispann nan 300 μL PBS ki fèk prepare ak 0.1 pousan Triton X-100, 0.2 mg/mL DNase-gratis RNase A (Sigma-Aldrich), 10 ug/mL yòd propidium ( PI) (Hoffman-La Roche Ltd., Bâle, Swis). Apre enkubasyon nan 37 degre nan fè nwa a pou 20 minit, selil yo te filtre nan yon may nilon Falcon (BD Biosciences), chaje sou sitomèt koule FAC-SCalibur, epi analize lè l sèvi avèk lojisyèl ModFit (BD Biosciences).

Analiz fragmentasyon ADN

Selil ki grandi nan plak sis byen yo te trete ak 0 μM, 60 μM, oswa 80 μM Echinacoside pou 24 èdtan epi yo te fikse nan glas-frèt 4 pousan paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) pou 20 minit. Apre yo fin lave ak PBS, selil yo te sele nan VECTASHIELD Mounting Medium ak DAPI (Vector Laboratories). Mòfoloji nikleyè te foto ak yon mikwoskòp fliyoresan Olympus. Pou detekte fwagmantasyon ADN sou jèl agaroz, yo te ekstrè ADN lè l sèvi avèk QIAamp DNA micro kit (Qiagen NV, Venlo, Netherlands), epi yo te fè elektwoforèz sou jèl agarose 2 pousan ki gen 0.1 ug/mL bromur etidyòm.

Analiz de apoptoz pa flow cytometry selil Apoptotic yo te egzamine lè l sèvi avèk yon twous deteksyon Annexin V-FITC Apoptosis (Bestbio, Shanghai, Repiblik Pèp la nan Lachin), swiv enstriksyon manifakti a. Selil ki grandi nan 96-plak byen yo te trete ak 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM, oswa 160 μM Echinacoside pou 2 èdtan, 5 èdtan, 12 èdtan oswa 24 èdtan, lave de fwa ak PBS, ak Lè sa a, resuspende nan yon tanpon obligatwa. Apre sa, 5 μL annexin V-FITC ak 5 μL ofPI (Roche) yo te ajoute sekans, epi selil yo te enkube pou 15 minit nan fè nwa nan tanperati chanm. Selil yo te chaje sou sitomèt koule FACSCalibur (BD Biosciences), epi done yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl Cell Quest (BD Biosciences).

Analiz Western blot

Selil ki grandi nan plak sis pui yo te trete ak 0 μM, 6{{10}} μM, oswa 80 μM Echinacoside pou 5 èdtan, 12 èdtan, oswa 24 èdtan, lave de fwa ak PBS epi grate plak la lè l sèvi avèk 100 μL tanpon radyo-iminopresipitasyon (150 mM NaCl, 1.0 pousan IGEPAL CA-630, 0.5 pousan deoxycholate sodyòm, 0.1 pousan silfat sodyòm dodecyl). , ak 50 mM Tris, pH 8.0) (Sigma-Aldrich) ki gen 1 mM phenylmethane sulfonyl fliyò. Echantiyon yo te santrifuje nan 12,000× g pou 20 minit nan 4 degre. Konsantrasyon pwoteyin nan supernatant yo te detèmine pa reyaktif Bradford (Dingguo, Changchun, Repiblik Pèp la Lachin). Echantiyon yo te denatire nan 95 degre pou 10 minit epi yo separe sou 12 pousan sodyòm dodecyl silfat-polyacrylamid gel electrophoresis gel. Apre elektwoforèz, pwoteyin yo te transfere nan manbràn fliyò polyvinylidene (Millipore), ki te swiv pa bloke nan Tris-tampon saline ak Tween 20 (10 mM Tris, pH 7.5; 100 mM NaCl; 0.1 pousan Tween 20) ki gen 5 pousan (w/v) lèt san grès pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Blots yo te sonde ak antikò prensipal kont p21 (Abcam), poly (ADP-ribose) polymerase (Bioss), oswa aktive caspase -3 (Bioss), ki te swiv pa antikò segondè konjige peroksidaz refor (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Yo te devlope siyal yo lè l sèvi avèk twous deteksyon Western blotting kimiluminesans amelyore (Transgen Biotech, Changchun, Repiblik Pèp la Lachin). Eksperyans yo te repete twa fwa.

Echinacosidenan cistanche kapabanti-apoptozepianti-oksidasyon

Mezi nan mitokondriyo

potansyèl manbràn

Yo te mezire potansyèl manbràn mitokondriyo avèk lank JC{{0}} (Bioteknoloji), swiv enstriksyon manifakti a. Selil ki grandi nan plak sis-pou yo te trete ak 0 μM, 60 μM, oswa 80 μM Echinacoside pou 5 èdtan, 12 èdtan, oswa 24 èdtan, lave de fwa nan PBS ak Lè sa a, enkube ak JC -1 pou 20 minit. Imaj yo te pran lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan Olympus.

analiz estatistik

Yo te fè analiz estatistik lè l sèvi avèk GraphPad Prism Software. Siyifikasyon yo te kalkile lè l sèvi avèk yon analiz yon sèl nan divèjans, ak P0.05 te konsidere kòm estatistik enpòtan. Rezilta yo te eksprime kòm mwayen ± devyasyon estanda.

Echinacosidenan cistanche kapabanti-apoptozak amelyore iminite