Pati 1 RNA-Seq PATI 1 ki baze sou asanble transcriptom De Novo ak dekouvèt jèn nan tij charnèl Cistanche Deserticola

Pou plis enfòmasyon tanpri kontakte:Joanna.jia@wecistanche.com

Résumé

Orijin

Cistanche deserticolase yon plant parazit konplètman ki pa fotosentetik ak gwo valè medsin epi li se sitou distribye nan dezè a nan Nòdwès Lachin. Tij chèch charnèl li yo se yon tonik enpòtan nan medikaman tradisyonèl Chinwa ak wòl nan sitou amelyore fonksyon seksyèl gason ak ranfòse iminite, men kèk etid mekanik yo te fèt an pati akòz mank de resous jenomik ak transcriptomic.

Cistanche deserticola gen anpil efè, klike isit la pou konnen plis

Rezilta yo

Nan etid sa a, nou te fè sekans transcriptome gwo twou san fon nan tij la charnèl nanC. deserticola, ak anviwon 80 milyon lekti yo te pwodwi lè l sèvi avèk sekans fen pè Illumina sou platfòm HiSeq2000 la. Sèvi ak Trinity assembler, nou te jwenn 95,787 sekans transkripsyon ak longè transkripsyon ki sòti nan 200bp rive 15,698bp, ki gen yon longè mwayèn 950 baz ak longè N50 nan 1,519 baz. Yo te idantifye 63,957 transkripsyon aktivman eksprime ak FPKM Mwens pase oswa egal a 0.5, kote 30,098 transkripsyon yo te anote ak deskripsyon jèn oswa tèm ontoloji jèn pa analiz resanblans sekans kont plizyè baz done piblik (Uniprot, NR, ak Nt nan NCBI, ak KEGG). Anplis de sa, nou idantifye jèn anzim kle ki enplike nan byosentèz lignin ak phenylethanoid glikozid (PhGs) ki konnen yo dwe engredyan prensipal yo aktif. Kat phenylalanine amonyak-lyase (PAL) jèn, premye anzim kle nan lignin ak biosentèz PhG, yo te idantifye ki baze sou konparezon sekans ak analiz filojenetik. De chemen biosentèz PhG yo te pwopoze tou pou premye fwa.

Konklizyon

An tou, nou te konplete yon analiz global de laC. deserticolatranscriptom tij charnèl lè l sèvi avèk teknoloji RNA-seq. Yon koleksyon jèn anzim ki gen rapò ak byosentèz lignin ak phenylethanoid glikozid yo te idantifye nan relve nòt yo reyini ak anote, ak fanmi jèn nan PAL te prevwa tou. Done sekans etid sa a pral bay yon resous enpòtan pou fè rechèch biosentèz glikozid feniletanoid nan lavni ak etid jenomik fonksyonèl nan plant medsin enpòtan sa a.

Entwodiksyon

C. deserticolase yon genus atravè lemond nan plant dezè kontinuèl ki soti nan fanmi Orobanchaceae, epi li se yon espès konplètman ki pa fotosentetik epi anjeneral grandi plant oloparazit anba tè [1]. Li se parazit sou rasin psammophyte Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) [1, 2], ki sitou abite nan dezè ak semi-dezè akòz gwo tolerans li nan sechrès ak salinite [1, 3].C. deserticolamontre gwo rezistans nan kondisyon anviwònman difisil epi li sitou distribye nan Nòdwès Lachin [4–6], espesyalman nan Inner Mongolia, Gansu, ak Xinjiang. Li konsidere kòm yon espès sovaj ki an danje nan dènye ane yo akòz ogmantasyon konsomasyon pa imen [5, 6]. C. deserticola ki souvan rele dezè ginseng se souvan ke yo rekonèt kòm dezè-broomrape ak tij la chèch charnèl te anpil itilize kòm yon tonik tradisyonèlman enpòtan nan Lachin ak Japon pou anpil ane [4, 7-10]. Li te okòmansman anrejistre nan Shen Nong Ben Cao Jing (Dictionary of Chinese Materia Medica, 1977) [11] apeprè 1800 ane de sa e li te konsidere kòm youn nan sous prensipal yo nan Chinwa herba medsin Cistanche.

Ekstrè yo nanC. deserticolagenyen yon pakèt fonksyon medsin, espesyalman pou itilize nan amelyore fonksyon seksyèl, tonifye ren an, pwoteje fwa a, aktivite aperitif, amelyore memwa, imunomodulateur, aktivite antioksidatif, anti-enflamatwa, aktivite antiviral, elatriye [7-10, 12–. 15]. Pi gwo konpozan bioaktif nan C. deserticola se glikozid Phenylethanoid (PheGs, PhGs) [2, 9, 10, 14, 15]. Jiska dat, plis pase 20 glikozid feniletanoid yo te izole nan tij sukulan nanC.deserticola[9, 14, 16]. Pami yo, acteoside ak echinacoside se de eleman prensipal ak aktivite famasi enpòtan [2, 16], epi dokimante kòm estanda kalite yo nan.C. deserticolanan farmakope Chinwa a (edisyon 2005 ak 2010). Twa konpozan chimik PhG yo se asid òganik, sakarid, ak feniletanoid, sepandan, detay yo konsènan chemen biosentetik fenilethanoid yo rete mal konprann nan.C.deserticola.

Malgre enpòtans komèsyal ak medsin nanC.deserticola, done jenomik ak transcriptomik espès sa a trè limite. Pa gen okenn EST ki disponib nan baz done NCBI la epi enfòmasyon konplè sou genòm pou espès sa a pa disponib eksepte sekans genòm klowoplast [1]. Done transcriptomic limite yo anpeche etid mekanis biosentetik PhG yo. Teknoloji RNA-seq ka jenere sekans pati ki eksprime nan genòm vize a [17] epi idantifye jèn [18] lè l sèvi avèk platfòm teknoloji NGS yo (tankou Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq, ak Roche 454). Li vin de pli zan pli popilè nan transcriptome de novo asanble [19-22], paske li se yon apwòch pri-efikas ak pwisan ak rezolisyon segondè ak gwo ranje dinamik [23-25], espesyalman paske li gen avantaj pou eksplore transkripsyon abondans ki ba. [26]. Akòz divès kalite avantaj yo, RNA-seq espesyalman atire pou òganis ki pa modèl ak resous jenetik limite [27-29]. Men, pa gen okenn rechèch detaye sou C. deserticola transcriptome pa RNA-seq.

Nan etid sa a, nou globalman sekans transcriptome tij la pou C. deserticola lè l sèvi avèk platfòm Illumina Hiseq2000 la epi nou te resevwa done anvan tout koreksyon 7.9G. Pa asanble ak anotasyon, nou minye jèn ki enplike nan byosentèz PhG ak jèn ki responsab pou tout biosentèz lignin.

Analiz RNA-seq nou an te pwodwi premye aC. deserticolatranscriptom konsansis ak bay nouvo Sur nan yon konpreyansyon konplè sou valè medsin nanC. deserticola.Anplis de sa, metòd ki dekri la a ka lajman aplike nan transcriptomes pwofil pou fasilite dekouvèt jèn ki enplike nan chemen biosentèz espesifik konpozan medsin nan yon lòt plant medsin ak resous jenomik trè limite.

Cistanchegen anpil fonksyon

Materyèl ak Metòd

Koleksyon materyèl plant

Tij la fre sukulan pouC. deserticolanan etap nan ègzumasyon te kolekte nan yon baz plant nan BayanHot City nan Alexa Lig nan Inner Mongoli nan nòdwès Lachin. Pèmi a kolekte te jwenn nan men pwopriyetè a (HongKui CongRong Group) nan baz la plant. Yo te depoze echantiyon bon an nan Plant Genomic Nwayo nan Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences. Apre netwaye, tisi tij sukulan yo te koupe an ti moso epi imedyatman jele nan nitwojèn likid, epi answit estoke nan -80 degre jiskaske plis pwosesis.

Ekstraksyon RNA, konstriksyon bibliyotèk cDNA, ak sekans Illumina

RNA total yo te extrait nan tij sukulan an lè l sèvi avèk TRIzol Reagent (Invitrogen Inc., California, USA) dapre enstriksyon manifakti a. Echantiyon ki kapab lakòz yo te trete ak DNase I pou retire nenpòt ADN jenomik. RNAs ekstrè yo te mezire lè l sèvi avèk yon bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies) epi tcheke entegrite lè l sèvi avèk elektwoforèz jèl agarose denaturasyon ak tach bromur etidyòm. Echantiyon RNA ak rapò A260/A280 ant 1.9 ak 2.1, RNA 28S:18S rapò ki pi wo pase 1.0, ak nimewo entegrite RNA (RINs) Yo te itilize mwens pase oswa egal a 8.5 nan analiz ki vin apre yo.

Bibliyotèk RNA-seq yo te pwodwi lè l sèvi avèk Illumina Truseq RNA Sample Preparation Kits. Poly(A) plis RNA te izole nan RNA total lè l sèvi avèk Dynal oligo(dT)25 pèl selon enstriksyon manifakti a. Apre pirifikasyon, yo te ajoute tanpon fwagmantasyon pou kraze mRNA a an fragman kout. Premye-seksyon cDNA te sentèz lè l sèvi avèk fragman kout sa yo kòm modèl, ansanm ak SuperScript III transkriptaz ranvèse ak N6 primè hexamer o aza. Lè sa a, dezyèm seksyon cDNA yo te sentetize lè l sèvi avèk tanpon, dNTPs, RNaseH, ak ADN polymerase I. ADN cDNA ki te lakòz doub-chachen te sibi fen-reparasyon lè l sèvi avèk T4 DNA polymerase, DNA polymerase I Klenow fragman, ak T4 polinukleotid kinaz, ak ligated nan. adaptè ki itilize T4 DNA ligase. Fragman adaptè-ligated yo te pirifye lè l sèvi avèk yon twous ekstraksyon Quick PCR ak eluye ak tanpon EB. Apre analiz ak elektwoforèz jèl agarose, yo te chwazi fragman apwopriye kòm modèl pou anplifikasyon PCR. Sekans bibliyotèk cDNA ki te lakòz yo te fèt ak yon sistèm Illumina HiSeq 2000.

Transkripsyon de novo asanble ak quantifikasyon ekspresyon jèn

Lekti kri ki te pwodwi nan sekans yo te netwaye lè yo retire sekans adaptè yo (ATCTCGTATGCCGTC) lè l sèvi avèk metòd anndan kay la. Lè sa a, nou te pote soti yon sevè bon jan kalite filtraj pwosesis. Premyèman, baz ki gen nòt kalite Phred ki pi ba pase 20 ta dwe koupe soti nan fen 3' nan sekans lan, jiskaske kouri nan yon baz ak yon bon jan kalite ki pi wo (mwens pase oswa egal a 20). Si longè lekti a te kout pase 50bp, li ta jete. Dezyèmman, lekti yo pral plis filtre dapre kritè ke 70 pousan baz nan yon sèl lekti gen bon jan nòt (mwens pase oswa egal a 20). Twazyèmman, sèlman pè-fen lekti yo te itilize pou plis asanble. Yo te fè asanble transkripsyon de novo lè l sèvi avèk Trinity release_20130216 [30] ki te gen twa modil lojisyèl siksesif: Inchworm, Chrysalis, ak Butterfly. Paramèt asanblaj yo te fikse jan pi ba a:—seqType fq—JM 300G —min_contig_longè 200—CPU 20—inchworm_cpu 20—bflyCPU 20.

Pou quantifier abondans transkripsyon, lekti sekans pè-fen yo te re-aliyen ak transkripsyon yo reyini lè l sèvi avèk yon script nan Trinity [31]. Lekti kat yo te itilize pou quantification pa lojisyèl RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) [32]. Jenn oswa abondans izofòm te reprezante pa fragman pou chak kilobaz transkripsyon pou chak milyon fragman kat (FPKM) valè, transkripsyon sa yo ki gen valè FPKM egal a oswa pi gwo pase 0.05 yo te defini jan yo eksprime.

Anotasyon fonksyonèl nan transkripsyon eksprime

Pou pa gen okenn seri anotasyon jèn nan C. deserticola eksepte pou genomic klowoplas la [1]. Nou anote transkripsyon eksprime yo lè nou konpare ak Genbank Nt, Genbank Nr, ak TAIR10_ pep_20101214_mezajou done yo separeman lè l sèvi avèk pwogram BLAST la (E< =="" 1e-20).="" meanwhile,="" all="" expressed="" transcripts="" were="" translated="" into="" potential="" proteins="" according="" to="" orf="" prediction="" by="" transdecoder="" [30]="" and="" predicated="" for="" the="" conserved="" domains="" based="" on="" the="" pfam="" database="">

engredyan aktif akteozid nansistanch

Gene Ontology ak anotasyon chemen KEGG

Pa aliyman resanblans sekans ak baz done Uniprot (http://www.uniprot.org/), yo te jwenn anotasyon Gene Ontology (GO) nan tout transkripsyon reyini lè w itilize dosye asosyasyon telechaje nan (ftp://ftp.ebi.ac). uk/pub/databases/GO/goa/UNIPROT/gene_asosyasyon. goa_uniprot.gz). GO tèm gwoupman eksprime jèn yo te fèt lè l sèvi avèk scripts koutim, epi nou te anote jèn nan katriyèm nivo pou CC, BP, ak kategori MF separeman.

Enfòmasyon sou chemen KEGG yo te asiyen pou tout sekans pwoteyin prevwa lè l sèvi avèk zouti sou entènèt KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34]. Yo te soumèt sekans nan fòma Fasta a demann KAAS, epi yo te telechaje dosye yo tout enfòmasyon sou chemen ki gen rapò ak transcriptom tij C. deseticola. Yo te itilize 13 seri done jèn òganis plant yo nan KEGG pou anotasyon lè l sèvi avèk metòd BBH (bi-direksyon pi bon frape).

Analiz RT-qPCR

Apre dijesyon ak DNase I, yo te konvèti apeprè 5ug total de RNA nan premye strand cDNA atravè reyaksyon ranvèse-transcription ak oligo(dT)15 primè ak NoScript Reverse Transcription System (Promega). Lè sa a, pwodwi cDNA yo te dilye 10-pliye ak dlo deyonize san nukleaz anvan yo itilize kòm yon modèl nan PCR an tan reyèl. GoTaq 2-Step RT-qPCR System (Promega) te anplifye cDNA espesifik yo nan yon volim 20 ul. PCR anplifikasyon te per-fòme nan tanperati a recuit de 60 degre ak 7500 an tan reyèl PCR Deteksyon Sistèm (Applied Biosystems) dapre enstriksyon manifakti a. Abondans transkripsyon relatif yo te kalkile pa metòd papòt sik konparatif la ak jèn "comp10579_c0" kòm yon estanda entèn, lè l sèvi avèk lojisyèl 7500 Manager la.

Premye pè pou RT-PCR yo te fèt ki baze sou lojisyèl sou entènèt (http://primer3.ut.ee/) epi yo ekri nan S1 Dataset.

Rezilta yo

Sekans RNA ak asanble transcriptom de novo nan tij charnèl C. deserticola

Tij C. deserticola te itilize anpil kòm yon tonik tradisyonèlman enpòtan nan Lachin ak Japon pou anpil ane. Pou jwenn yon BECA mondyal ekspresyon jèn nan tij charnèl C. deserticola, nou kolekte echantiyon tij C. deserticola nan menm baz plant la nan 2013 ak 2014, respektivman. RNAs total yo te ekstrè ak RNAs polyA plis yo te pirifye pou konstwi bibliyotèk RNA-seq pè-fen. 79,433,734 ak 86,019,176 pè-fen lekti ki koresponn ak prèske 8 milya ak 8,6 milya baz nan sekans yo te jwenn lè l sèvi avèk sekans Illumina HiSeq 2000.

platfòm nan echantiyon 2013-ane ak 2014-ane (Tablo 1). Apre yo fin retire sekans adaptè yo ak filtraj lekti ki pa bon kalite (gade detay nan Metòd), yo te itilize 64,831,040 lekti-wo kalite pè nan echantiyon 2013-ane a pou asanble transcriptome de novo. Sèvi ak Trinity sekans asanblaj [30], 51,719 jèn ak 95,787 sekans transkripsyon yo te pwodwi ak longè transkripsyon ki sòti nan 200 bp a 15,698 bp. Longè an mwayèn nan transkripsyon reyini se 950 baz ak longè N50 a se 1,519 baz. Kantite transkripsyon nan diferan longè revele ke 57.32 pousan nan transkripsyon reyini yo te apeprè 500- bp oswa pi long (figi 1A). Lekti-wo kalite pè-fen nan echantiyon an 2014-ane yo te trase sou transkriptòm ki te rasanble a. Anplis, nou te jwenn ke nimewo transkripsyon pou chak jèn reyini varye ak 69 pousan nan jèn ak yon sèl izofòm eksprime pandan y ap 31 pousan nan jèn eksprime de oswa plis transkripsyon (Fig 1B).

Kantifikasyon ekspresyon ak anotasyon fonksyonèl nan transkripsyon reyini

Gen oswa abondans transkripsyon yo te quantifye lè l sèvi avèk pake RSEM, nan ki lekti sekans yo te re-aliyen ak jèn yo reyini oswa sekans transkripsyon lè l sèvi avèk Bowtie ak lekti sa yo te itilize pou quantification. Yo te kalkile valè FPKM pou chak jèn oswa transkripsyon, epi finalman, nou te idantifye 63,957 ak 52,857 transkripsyon ki eksprime aktivman (valè FPKM mwens pase oswa egal a 0.5) nan echantiyon tij charnèl C. deserticola nan 2{{17} }13 ak 2014, respektivman. 44,776 transkripsyon (70,01 pousan nan echantiyon 2013-ane a, 84,71 pousan nan echantiyon 2014-ane a) te souvan eksprime nan de kopi yo, ak korelasyon an (koyefisyan korelasyon Pearson: 0,91979) nan done ekspresyon yo te yo montre nan S1 Fig. Done anvan tout koreksyon sekans yo te telechaje nan baz done NCBI SRA (nimewo aksesyon: SRX857402 ak SRX858938). Nou itilize jèn eksprime yo idantifye nan echantiyon 2013-ane a pou plis analiz. Yo te jwenn enfòmasyon annotasyon fonksyonèl pou tout transkripsyon eksprime yo lè l sèvi avèk de metòd. Premyèman, tout transkripsyon eksprime yo te aliyen ak baz done nukleotid li te ye (GenBank pa) ak baz done sekans peptide (GenBank nr ak Arabidopsis peptide) separeman pa algorithm BLAST la. Sou 63,957 relve nòt eksprime,

29,220 (45.7 pousan) yo te anote epi yo te montre omoloji nan sekans nan nenpòt nan twa baz done sijè yo ak E-valè koupe 1e -20. Pandan se tan, rejyon kodaj kandida yo pou tout sekans transkripsyon eksprime yo te prevwa lè l sèvi avèk lojisyèl TransDecoder ak ORF ki pi long yo pou chak transkripsyon yo te itilize pou rechèch domèn Pfam. Kòm yon rezilta, 21,358 (33.4 pousan) transkripsyon yo te anote ki baze sou baz done Pfam la. An jeneral, 30,098 (47.1 pousan) relve nòt yo te siyifikativman matche ak jèn li te ye nan baz done piblik yo lè yo konbine de metòd ki anwo yo. Lis konplè eksprime transkripsyon yo ak anotasyon fonksyon yo te montre nan done siplemantè (S2 Dataset).

Nou te fè sondaj sou 20 transkripsyon ki pi eksprime yo (Tablo 2) ki koresponn ak 18.99 pousan nan tout lekti sekans yo, epi nou te jwenn ke pi fò nan yo se jèn ki reponn a abyotik.

stimul estrès. Dehydrin (DHN), yon klas pwoteyin estrès idrofil ak tèmostab ak yon gwo kantite asid amine chaje ki fè pati gwoup II Late Embryogenesis Abundant (LEA) fanmi an, se jèn ki pi eksprime. Twa diferan transkripsyon Dehyrin (comp28713_c0_seq1/2/4) yo te detekte trè eksprime nan tij la charnèl ki ka patisipe nan pwoteje selil yo kont domaj ki te koze pa estrès sechrès. Lòt jèn ki gen rapò ak estrès tankou pwoteyin chòk chalè, pwoteyin ki gen rapò ak patojèn, ak metalothionein yo te eksprime tou, ki ka gen rapò ak anviwònman siviv grav li yo. Anplis de sa, gen kèk jèn konstititif ki gen ladan jèn RNA ribozomal 26S (konp22329_c2_seq1), pwoteyin ki asosye ak oksin ki reprime/ki asosye ak dòmi (konp20999_c0_seq1), Faktè ADP-ribosilasyon (konp20499_ c0_seq1) yo te transkri anpil tou.

Klasifikasyon fonksyonèl nan tout transkripsyon eksprime ki baze sou Gene Ontology ak baz done KEGG

Gene Ontology (GO) te jwenn anotasyon nan dosye Uniprot ak asosyasyon idantite. An total, 20,907 relve nòt, ki reprezante 32.69 pousan nan total sekans eksprime yo, yo te asiyen nan 1,745 tèm fonksyonèl. Nan total fonksyon GO tèm, plasman nan pwosesis byolojik la te fòme majorite (1,116, 63.95 pousan) ki te swiv pa eleman selilè (329, 18.85 pousan) ak fonksyon molekilè (300, 17.20 pousan). Fonksyon transkripsyon eksprime yo te plase yo te kouvri yon pakèt kategori GO, epi 10 pi gwo tèm GO ki gen transkripsyon ki pi annote yo te nan lis nan Tablo 3. Epi nou bay tout distribisyon transkripsyon eksprime yo nan twa kategori Ontoloji Gene (Fonksyon Molekilè, Konpozan Selilè, ak pwosesis byolojik) nan dosye siplemantè a (S3 Dataset). Tèm GO ki gen rapò ak fonksyon obligatwa ak aktivite transferaz te reprezante prensipalman nan kategori fonksyon molekilè. Konsènan fonksyon yo obligatwa, kasyon obligatwa (4,394 transkripsyon) reprezante pi abondan, ki te swiv pa obligatwa nukleotid/nukleozid (3,404 transkripsyon an mwayèn) ak pwoteyin obligatwa (2,422 transkripsyon). Pandan ke yo nan gwoup aktivite transferaz la, pi plis yo se moun ki gen transfere gwoup ki gen fosfò (2,256 relve nòt, 65.77 pousan). Pami kategori eleman selilè yo, relve nòt yo te plis lokalize nan intraselilè (10,581 relve nòt an mwayèn), pandan y ap nan kategori pwosesis byolojik la, relve nòt yo te plis patisipe nan pwosesis metabolik biopolymer (6,683 relve nòt an mwayèn), ki te swiv pa règleman sou pwosesis selilè (4,841). transkripsyon), ekspresyon jèn (4,678 transkripsyon) ak transpò (3,512 transkripsyon).

Yo nan lòd yo m 'jèn ki enplike nan byosentèz la nan lignin ak PhG, yo te fouye 21,358 sekans pwoteyin potansyèl ki pa redondants kont sekans jèn nan 13 òganis plant nan baz done a KEGG, epi yo te asiyen nan 275 chemen KEGG ak omwen 5 frape. 10 pi gwo chemen ki gen sekans ki pi aliye yo te bay lis nan Tablo 4. Pifò nan chemen yo te enplike nan pwosesis metabolik prensipal yo, tankou metabolis asid amine oswa pwoteyin (ko01230, ko04141, ak ko04120), metabolis idrat kabòn (ko01200 ak ko00500), ak nukleotide. oswa metabolis nukleozid (ko03018, ko00230, ak ko00240). Anplis de sa, gen 27 wout segondè ki gen rapò ak metabolis (figi 2), tankou biosentèz zo rèl tè terpenoid, byosentèz fenilpropanoid, byosentèz karotenoid, biosentèz alkaloid izoquinolin, ak tropane, piperidin, ak byosentèz alkaloid piridin. Rezilta sa yo bay plis endikasyon ke pwosesis metabolik aktif yo te sou pye nan tisi tij C. deserticola. Tout transkripsyon eksprime ki asosye ak chemen KEGG yo te nan lis nan dosye siplemantè a (S4 Dataset). Malgre ke gen kèk chemen ki chanje anpil ant C. deserticola ak lòt plant, tankou diri [35] (S5 Dataset), objektif prensipal nou an nan etid sa a gen pou objaktif pou revele pwofil transcriptome antye nan tij C. deserticola a, ak imajine a. chemen ki gen rapò ak byosentèz PhGs ki ta ka itil pou gide kiltivasyon an.

Jèn kandida ki kode anzim ki enplike nan byosentèz lignin

Lignin se dezyèm polymère natirèl terès ki pi abondan nan wayòm plant la, ki konpoze jiska yon tyè nan materyèl yo jwenn nan mi selil plant yo [36, 37]. Kòm yon eleman enpòtan nan mi selil yo, lignin ede transpòte dlo, bay sipò mekanik ak entegrite estriktirèl, ak defann kont patojèn ak èbivò [38-40]. Wòl lignin sa yo gen anpil valè pou sipòte kwasans erektif anba tèC. deserticolanan dezè a. Nan etid sa a, nou te prezante foto konplè sou chemen biosentèz lignin nanC. deserticola(Fig 3), kote monomè lignin yo biosintetize soti nan fenilalanin atravè yon seri reyaksyon anzimatik, ki gen ladan idroksidasyon, methylasyon, rediksyon, ak pwosesis polimerizasyon oksidatif. Lignin anzim ki gen rapò ak biosentèz yo te detekte pou twa fòm sitou sentèz nan vaskilè.

tisi (p-hydroxyl-phenyl (H), guayacyl (G) ak syringyl (S) lignin) ak 5-hydroxyl-guayacyl lignin ki te sèlman idantifye nan COMT (asid kafeyik 3- O-methyltransferase, EC 2.1.1.68) ensufizant (tankou knock-down) plant [41, 42].

Phenylalanine amonyak-lyase (PAL, EC 4.3.1.24) se premye anzim kle nan chemen biosentèz lignin (figi 3) ki transfòme fenilalanin nan asid cinnamic pa deaminasyon ki pa oksidatif [43, 44]. Yon total de 6,297 lekti PAL yo te sekans epi 7 transkripsyon PAL yo te rasanble nanC. deserticola(Tablo 5). Nan konparezon resanblans sekans, nou te jwenn ke 4 nan yo (comp28550_c1_seq1/2/3/5) te gen plis pase 95 pousan resanblans ak sekans mRNA li te ye nan C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), pandan ke comp28550_c1_seq4 ak comp25940_c{0_seq1 te gen 77 pousan ak 82 pousan resanblans, respektivman. Prediksyon ORF te revele 5 transkripsyon yo te gen potansyèl pou kode pwoteyin epi yo te pote ak domèn aromat asid amine lyase (PF00221.14). Pami yo, se sèlman transkripsyon comp28550_c1_seq4 ki kapab kode yon sekans pwoteyin konplè ki gen 718 résidus asid amine. Yo te rapòte ke PAL te kode pa yon ti fanmi multigene nan pifò espès plant, tankou 4 nan Arabidopsis thaliana [39, 45], 5 nan Populus trichocarpa [46, 47], 3 nan Scutellaria baicalensis [48], ak 7. Cucumis sativus [43, 49], elatriye. Analiz filogenetik nou an sijere ke te gen 4 PAL kode jèn nan C.deserticola epi nou te rele yo CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3, ak CdPAL4, respektivman (S2 Fig). 4-coumarate-CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12) ak trans-cinnamate 4-monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) se de anzim ki responsab pou transfòme asid cinamik nan p-coumaroyl-CoA nan de lòd ranvèse. Yo tou nan zo rèl do, ak valè ekspresyon FPKM yo se 39.57 ak 51.93, respektivman.

Kat kalite lignin yo te biosentèz pa diferan chemen ki te kontwole pa twa anzim kle, cinnamoyl-CoA reduktaz (CCR, EC 1.2.1.44), shikimate o-hydroxycinnamic-methyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133), ak ferulate {{1} }} hydroxylase (F5H, EC 1.14.-.-). Yo te rapòte CCR kòm yon pwen kontwòl nan chemen lignin [50, 51] ki katalize X-CoA (X ki gen ladan p-coumaroyl, kafeoyl, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl, ak sinapoyl) nan Y-aldehyde (Y). enkli p-coumar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl, ak sinap), pandan ke HCT katalize p-coumar-oyl-CoA nan p-coumaroyl asid shikimic / p-coumaroyl asid kinik. De anzim yo, menm jan ak yon switch, reglemante biosentèz P-hydroxyl-phenyl lignins oswa twa lòt kalite lignins.

F5H se te yon lòt switch branch ki te reglemante syringyl lignin ak 5-hydroxyl-guayacyl lignin. Lòt anzim enpòtan yo enkli asid kafeyik 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104), ak cinnamil-alkòl dehydrogenase ( CAD, EC 1.1.1.195) yo te detekte tou eksprime. Enfòmasyon detaye sou ekspresyon yo te bay lis nan Tablo 6. Jèn anzim sa yo idantifye nan etid sa a pral bay yon resous valab pou etid jenomik fonksyonèl nan plant medsin enpòtan sa a. 10 jèn ki gen rapò ak chemen biosentèz lignin nan Tablo 6 yo te chwazi pou verifikasyon RT-qPCR pou konfime rezilta RNA-seq nou yo (figi 4), ak gwo korelasyon yo (koyefisyan korelasyon Pearson: 0.90343) te endike gwo presizyon ak repwodiksyon analiz transcriptom nou an. . S1 Dataset bay lis sekans primè yo itilize nan analiz sa a.

Cistanchegen anpil efè

Jèn kandida ki kode anzim ki enplike nan byosentèz PhG yo

Phenylethanoid glycosides (PhGs) yo konnen yo dwe engredyan prensipal yo aktif nanC. deserticolaak aktivite pou amelyore puisans seksyèl, elimine radikal gratis, ak anti-aje [7-10]. Twa konpozan chimik PhG yo se asid òganik, sakarid, ak phenyl etanòl aglikon (figi 3). Asid òganik ki gen ladan asid kafeyik, asid ferulik, ak asid koumarik se pwodwi nan chemen biosentèz fenilpropanoid la. Konpozan sakarid ki gen ladan glikoz ak rhamnose yo se pwodwi nan metabolis idrat kabòn, tankou metabolis lanmidon ak sikwoz, sik amine ak metabolis sik nukleotid, fruktoz ak metabolis mannoz, elatriye Sepandan, chemen an biosentèz nan pati feniletanol pa klè ankò. Isit la, nou pwopoze de posib phenylethanol biosentèz chemen ki baze sou done sekans nou an. Youn nan se asid kafeyik rapòte oswa chemen asid ferulik, ke yo rele tou chemen asid cinnamic ki sanble ak chemen zo rèl do lignin biosentèz la. Yon lòt baze sou wout metabolis phenylalanine (figi 3), nan ki fenilalanin nan feniletanòl te reyalize pa yon 'chemen Enrlich' li te ye ki te jwenn premye nan ledven yon syèk de sa ak valide nan flè petunia [52, 53], tomat [52, 53]. 54], ak leve [55, 56]. Kat jèn anzim kode aspartate / tirozin aminotransferaz, histidinolphosphate aminotransferase, ak prensipal-amine oksidaz ki responsab pou konvèsyon fenilalanin nan feniletanòl yo te detekte eksprime nan tij C. deserticola. Pwodwi phenylethanol ka plis soksid pa monooxygenase oswa methylated pa methyltransferase nan dérivés li yo (phenylethanol aglycon) ki te patisipe nan biosentèz PhG. An rezime, yo te pwopoze de wout byosentèz phenylethanol aglycon pou C. deserticola men yo toujou bezwen plis etid.