Pati 1: Katyografik entèraksyon epigenomik ak transkriptomik pandan fòmasyon memwa ak rapèl nan Ansanm Engram Hippocampal la.
Mar 15, 2022
Pou plis enfòmasyon:ali.ma@wecistanche.com
Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*
1Picower Enstiti pou Aprantisaj akmemwa, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
2Depatman nan sèvo ak syans kognitif, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
3Syans enfòmatik ak laboratwa entèlijans atifisyèl, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
4Divizyon Medsin ki fèk fèt, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA.
5Broad Institute of Harvard ak MIT, Cambridge, Massachusetts, USA.
Klike souCistanche boutik vitamin ak Cistanche pou memwa
Résumé
Epigenom ak twa dimansyon (3D) - achitekti jenomik ap parèt kòm faktè kle nan règleman dinamik diferan pwogram transkripsyon ki nesesè pou fonksyon newòn yo. Isit la nou itilize yon sistèm tag ki depann sou aktivite nan sourit yo pou detèmine eta epigenetik, achitekti 3D-genòm, ak jaden flè transkripsyon selil engram yo pandan lavi yo.memwafòmasyon ak rapèl. Konklizyon nou yo revele samemwakodaj mennen nan yon evènman priming epigenetic, ki make pa ogmante aksè nan amelyore san chanjman korespondan transkripsyon.memwakonsolidasyon imedyatman rezilta nan reyòganizasyon espasyal nan gwo segman chromatin ak entèraksyon pwomotè-améliorant. Finalman, ak reaktivasyon, newòn engram yo itilize yon seri entèraksyon denovolong-ranje, kote améliorant prime yo te pote an kontak ak pwomotè respektif yo pou kontwole jèn ki enplike nan tradiksyon pwoteyin lokal yo nan konpatiman sinaptik yo. Ansanm, travay nou an elicide transkripsyon konplè a epi Itilizatè yo ka wè, enprime, kopye, ak telechaje tèks ak done-min kontni an nan dokiman sa yo, pou rechèch akademik, sijè toujou a plen kondisyon yo pou itilize: http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms
*Korespondans ak : marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.
Kontribisyon otè:
AM ak L.-HT te konsèptualize ak konsepsyon pwojè a. AM ak AZ te fè eksperyans konpòtman, ISH, imunostaining, ak analiz MARIS. CA te fè piki viris ak immunostainings. AM ak HSM te fè eksperyans ATAC-seq. AM ak AZ te fè eksperyans nikleyè RNA-seq. AM, HSM ak VD fè eksperyans pc-Hi-C ak Hi-C. AM, HSM, VD, RMR, ak JDV te fè analiz ATAC-seq. AM, RMR, HSM, VD, ak FG fè analiz nikleyè RNA-seq. AM, VD, HSM, ak RMR fè analiz pc-Hi-C ak Hi-C. Tout otè te ede entèprete done yo. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK, ak LHT te ekri maniskri a ak opinyon tout otè yo. LHT te bay zouti yo ak sipèvize pwojè a.
Enterè konpetisyon:
Otè deklare pa gen enterè konpetisyon.
peyizaj la epigenomik atravè lavi a nanmemwafòmasyon ak rapèl nan ansanbl engram ipokanp lan.
Fòmasyon ak prezèvasyon memwa alontèm depann sou ekspresyon jèn kowòdone ak sentèz pwoteyin sinaptik1. Pwosesis molekilè sa yo aji nan yon popilasyon espesifik nan newòn, yo rele selil engram 2–4. Dènye apwòch ki itilize ekspresyon repòtè ki depann sou aktivite yo te bay yon kad pou eksplore ansanbl engram5–8, men mekanis molekilè ki gouvène.memwadepo ak rekiperasyon rete mal konprann. Espesyalman, modifikasyon epijenetik ak achitekti 3D-genomic ap parèt kòm yon faktè kle nan règleman dinamik ekspresyon jèn9-17, epi gen yon ogmantasyon apresyasyon nan enpòtans yo nan fonksyon newòn, devlopman, ak maladi14, 16, 18.
Isit la, nou itilize modèl la sourit Recombination Vize nan Popilasyon Aktif (TRAP) 5,6, nan ki aktive newòn eksprime Pwoteyin Asosye Sitoskelèt Aktivite Regle, (Arc) jèn, yo pèmanan atenn nan yon fason inducible. Aktive newòn pandanmemwakodaj, konsolidasyon, ak rapèl yo te klase ak sibi sekans RNA nikleyè (nRNA-seq), Esay pou Transposase-Accessible Chromatin lè l sèvi avèk sekans (ATAC-seq), ak kaptire konfòmasyon kwomozòm (Hi-C). Done nou yo montre samemwakodaj mennen nan yon ogmantasyon genomic-lajè nan aksè chromatin, san yo pa espere chanjman nan ekspresyon jèn. Anplis de sa, nou demontre ke faz an reta nan konsolidasyon memwa te asosye ak re-lokalizasyon nan gwo segman chromatin (sous-konpatiman) soti nan anviwònman inaktif ak tolerans, ak reòganizasyon nan peyizaj la entèraksyon pwomotè-améliore. Finalman, réactivation de newòn yo pandanmemwarapèl ki asosye ak entèraksyon denovopromoter-enhancer, itilize yon gwo sous-ensemble de enhancers ki te prime pandanmemwakodaj. Entèraksyon pwomotè-améliorant sa yo asosye ak yon chanjman gaya nan ekspresyon jèn ki enplike nan sentèz pwoteyin lokal yo ak mòfogenesis sinaptik.
Rezilta yo
Idantifikasyon tanporèl ak espasyal selil engram aktive ak reaktive
Swiv aktivite newòn sou tan se youn nan pi gwo defi yo lè etidye selil engram yo, kòm makè yo pou aktivite newòn, ke yo rekonèt kòm jèn imedya bonè (IEG), retounen nan debaz yon ti tan apre endiksyon1,2. Pou simonte limit sa a, nou te pwofite modèl TRAP5,6, ki mande de transjèn, youn ki eksprime CreERT2 ki soti nan yon pwomotè Arc ki depann de aktivite ak youn ki pèmèt ekspresyon repòtè pwoteyin jòn fliyoresan (eYFP), nan yon Kre-. fason depandan. Administrasyon tamoksifèn (TAM) nan sourit TRAP yo lakòz yon etikèt pèmanan eYFP nan newòn Arc aktive yo. San TAM, CreERT2 kenbe nan sitoplasm la ak eYFP pa eksprime (Done pwolonje Fig. 1a). Sourit TRAP yo te sibi paradigm klasik Pavlovian kontèks pè kondisyone (CFC) (Fig. 1a), yon metòd souvan itilize pou etidye memwa aversive19. Apeprè 1.5-2 èdtan apre yo fin ekspoze a FS, sèvo yo te kolekte pou idantifye i) RNA obligatwa pwoteyin fox-1 omològ 3 (Rbfox3) ke yo rele tou NeuN plus ak eYFP plis newòn tag ki te aktive pandan premye ekspoze a (aktive). -bonè), ki ka distenge ak ii) NeuN plis /eYFP- ki pa aktive newòn eta fondamantal (Basal) (Fig. 1a). Apre senk jou, nan absans rekiperasyon, nou kolekte iii) NeuN plis /eYFP plis newòn ki te make nan jou fòmasyon an, ki vle di alontèm.memwakonsolidasyon (aktive-an reta). Nan yon
diferan kòwòt, sourit yo te re-ekspoze nan estimilis la kondisyone ak ekspresyon ki vin apre a andojèn pwoteyin ARC te teste 1.5-2 èdtan apre re-ekspozisyon. Sa a te pèmèt idantifikasyon iv) doub-pozitif NeuN plis /eYFP plis / andojèn Arc plis engram newòn ki te aktive pandan fòmasyon ak reyaktif pandan fòmasyon.memwasonje (Reaktive). Miyò, byenke ADN recombination ka pa konplètman rive 1.5-2 èdtan apre FS la, nou obsève gwo ko-lokalizasyon (mwayèn 84 pousan) ant pwoteyin Arc andojèn ak repòtè Arc:eYFP (Done pwolonje Fig. 1b), ki te tou. ki konsistan avèk rapò anvan yo20.
Pou konfimememwakodaj ak rapèl pandan CFC, yo te anrejistre konpòtman lè w konjele pandan fòmasyon ak re-ekspozisyon pou siyal laperèz (Done pwolonje Fig. 1c). Konfòm ak piblikasyon anvan yo6,20, done nou yo te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan kantite eYFP plis (aktive-bonè ak -fen) newòn nan ipokanp la, konpare ak sourit ki te rete nayif nan CFC nan kalòj lakay yo (F (2, 70)=240.3, P<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">
Se fòmasyon memwa ki asosye ak ogmante aksè chromatin, sitou sou améliorant
Pou pi byen konprann fòs molekilè ki gouvène diferan pwogram transkripsyon yo, nou mezire chanjman nan genomic lajè aksè nan chromatin atravè diferan faz nan.memwa. Tisi Hippocampal yo te pisin ak nwayo izole (Done pwolonje Fig. 2a, Tablo siplemantè 1) yo te sibi preparasyon bibliyotèk ATAC-seq. Rejyon aksesib diferans (DARs) analiz (Diffbind, mòd DESeq2) ant tout popilasyon (figi 2a) te revele ke pifò chanjman nan eta chromatin rive pandan faz bonè fòmasyon memwa, kote 7,862 rejyon atravè genomic a genyen. aksesiblite (Basal vs Bonè, Tablo Siplemantè 2). Kontrèman, nou te obsève chanjman relativman minim nan eta chromatin lè nou t ap fè tranzisyon soti nan Aktive-bonè ak Aktive-Anreta (582 DARs) ak ant Aktive-Anreta ak Reaktive newòn (725 DARs), ak 48 pousan sipèpoze ant yo (Done Pwolonje Fig. 2b). ). Remakab, nou te idantifye yon gwo pousantaj (52 pousan) nan DARs ki estab ki te vin pi aksesib nan Aktive-bonè epi ki te rete aksesib nan tou de newòn Aktive-fen ak Reyaktif (figi 2b, c; Tablo siplemantè 2). Enteresan, pandan ke tou de chanjman bonè (Basal vs Bonè) ak stableman te vin DARs yo te rich pou rejyon entèjenik, chanjman chromatin an reta (Bonè vs an reta ak Anreta vs Reyaktif) yo te sitou anrichi pou sit pwomotè, (Fig. 2d).
Yo te bay insight fonksyonèl lè w evalye kijan DAR yo make pa diferan modifikasyon histon. Nou te premye itilize ChromHMM pou etabli yon modèl eta chromatin apati de etid endepandan ki te itilize tisi ipokanp an gwo anvan ak apre chòk pye 21,22. Apre sa, nou te fè yon analiz pliye anrichisman (obsève sou distribisyon espere) nan DAR yo pou diferan eta sa yo ak revele ke chanjman kwomatin bonè ak DARs ki estab yo te rich pou mak améliorant (Fig. 2e; Done Pwolonje Fig. 2c, Tablo Siplemantè 3) .
Rezilta sa yo nan liy ak piblikasyon anvan yo, ki montre ke eksitan kilti prensipal newòn pwovoke aktivite pwolonje enhancer12,23. Apre sa, nou analize sipèpoze lokal ki estab endividyèl ak H3K4me1 ak H3K27ac21. De mak histon sa yo delimite diferan popilasyon améliorant, ki ka swa 'prime' (sèlman H3K4me1), 'aktif' (H3K4me1 ak H3K27ac), oswa 'latent' (pa gen mak)18. Pik ki estab yo te montre yon distribisyon atravè tou de améliorant prime ak aktif (Done pwolonje Fig. 2d), kote yo te prevwa 47 pousan nan sit sa yo yo dwe 'latan' (pa gen okenn sipèpoze ant DARs ak mak histon21 jwenn 1h apre FS). Pou konfime modèl nou an, nou te fè chromatin immunoprecipitation (ChIP) pou makè histon H3K4me1 ak H3K27ac, ki te swiv pa qPCR. Kat sit te chwazi yo te chwazi nan analiz modélisation putatif nou an (Done pwolonje Fig. 2d; Enhancer 1 - prevwa premye, Enhancer 2- prevwa aktif, Enhancer 3 ak 4 - prevwa inaktif). An akò ak modèl nou an, nou te idantifye de kote 'latan' nan eta fondamantal (Améliorant 3 ak 4) ki te transfòme nan yon eta 'aktif' pandanmemwafòmasyon (figi 2f). Anplis de sa, yo te jwenn 1 améliorateur putatif la 'prime' nan eta a fondamantal e li te vin aktif, kote te gen yon ogmantasyon siyifikatif ki estab nan makè H3K27ac pandan faz an reta ak rapèl (figi 2f). Ansanm, done sa yo endike ke repètwa améliorant ki fèk aksesib yo te elaji nan newòn engram potansye yo, kote rejyon inaktif oswa prime te genyen mak H3K4me1 ak H3K27ac e konsa te vin aktif améliorant.
Pou konprann wòl fonksyonèl pwomotè aksesib ak rejyon améliorant yo, nou te fè analiz anrichisman motif (Tablo siplemantè 4). Done nou yo endike ke majorite (70 pousan) motif sou pwomotè aksesib yo egalman anrichi e yo te idantifye nan tout faz yo.memwa(Done pwolonje Fig. 2e). Kontrèman, majorite sit améliorant yo te montre modèl diferan nan faktè transkripsyon (TF)-obligatwa motif atravè diferan faz memwa. Enteresan, motif yo eksprime omniprésente nan Jun Proto-Onkogene, Ap-1 Transcription Factor Subunit (sètadi Jun-Ap1), ak Faktè Regilasyon X (Rfx) fanmi TF yo, te siyifikativman anrichi sèlman apre premye faz nan. kodaj (Done pwolonje Fig. 2e). Li te deja rapòte ke konplèks Jun-Ap1 jwe yon wòl santral nan seleksyon amelyore e li ta ka aji kòm yon TF pyonye pou defini sit amelyorasyon pandan devlopman nan sèvo ak aktivite newòn12,24. Konklizyon sa yo ki konsistan avèk done nou yo ki te montre yon gwo pousantaj nan loci inaktif / prime nan eta a fondamantal (Fig. 2f, Done pwolonje Fig. 2c, d). Pakonsekan, li parèt ke aktivite newòn ta ka deklanche obligatwa nan Jun-Ap1 nan améliorant inaktif, ki Lè sa a, rekrite modifikatè kwomatin ki aktive améliorant inaktif. Menm jan an tou, anrichisman nan faktè transkripsyon Yin Yang 1 (Yy1) motif sèlman nan améliorant soti nan eta yo byen bonè ak an reta, sijere ke òganizasyon pwomotè-enhancer se yon pwosesis aktif nanmemwafòmasyon, kòm li te fèk rapòte ke Yy1 fasilite fòmasyon sa a entèraksyon alontèm25. Kolektivman, done sa yo sijere ke faz inisyal la nanmemwafòmasyon chanje jaden aksesiblite chromatin nan newòn aktive, ak chanjman ki dire lontan ki estab ki fèt sitou nan rejyon enhancer.
Chanjman dinamik nan achitekti nikleyè espasyal ak aksè chromatin pandan inisyal lamemwafòmasyon koresponn ak ogmante frekans entèraksyon pwomotè-améliorant pandanmemwasonje
Achitekti nikleyè 3D ap parèt kòm yon faktè kle nan règleman dinamik ekspresyon jèn, nan anpil fonksyon newòn26-28. Pakonsekan, nou te enterese nan delimiter chanjman egzak ki rive nan òganizasyon chromatin espasyal pandanmemwafòmasyon ak konsolidasyon. Nou pwodui done Hi-C ki soti nan eta fondamantal ak eYFP plis newòn ki make (bonè ak -fen, Tablo siplemantè 5). Chromatin separe an de konpatiman sub-nikleyè distenk nan espasyal, 'A' ak 'B', ki koresponn ak chromatin nan transcriptionally aktif ak inaktif, respektivman15, 16,26. Prèv bonè sijere ke aktivite newòn ak siyal ekstèn ta ka pwovoke yon re-òganizasyon nan achitekti 3D -chromatin14,27,28. Analiz eta lòj nou an15, 16,26 (figi 3a–c) revele re-lokalizasyon gwo segman chromatin soti nan inaktif (B) nan anviwònman an tolerans (A) (ak vis vèrsa) pandan faz inisyal la ak an reta nan.memwafòmasyon (212 segman chanje soti nan A a B, 127 soti nan B a A, gwosè mwayèn nan ~ 436Kbp). Enteresan, 52 pousan nan rejyon yo nan faz bonè a ki te chanje soti nan B a A te kenbe eta sa a nan faz an reta (sa vle di rete nan eta A, Fig. 3b,c; Tablo Siplemantè 6). Anplis, prèske tout rejyon sa yo sipèpoze ak DAR yo te jwenn nan analiz ATAC-seq nou an, ki konfime tranzisyon an nan sub-lòj soti nan inaktif nan anviwònman an tolerans (figi 3d). Done sa yo endike ke kèk loci sibi chanjman sou-lòj atravè diferan faz memwa, epi kidonk ka kontribye nan chanjman alontèm nan pwopriyete newòn ak fonksyon apre premye aktivasyon.
Pandan ke done Hi-C nou yo sijere reòganizasyon gwo echèl, li te rete klè si reoryantasyon sa a pèmèt entèraksyon an nan repètwa nouvo pwomotè-amelyorasyon ak amann-akor nan diferan pwogram transcriptional (Fig. 3e). Lè nou itilize teknik pwomotè-kapti Hi-C (pc-HiC), nou etidye chanjman egzak ki fèt nan entèraksyon pwomotè-améliorant pandan pwosesis la.memwafòmasyon ak rapèl. Pou etid sa a, nou te itilize "appâts" ki fèt sou fason pou vize ~5000 pwomotè29. An akò ak piblikasyon anvan yo29, nou te detekte ~ 19,000 (pa gwoup) pwomotè-améliorant enpòtan (67.5 pousan) ak pwomotè-pwomotè (46.2 pousan) entèraksyon (Done pwolonje Fig. 3a, b).
Depi pwomotè nan sèvo mamifè yo ta ka anba kontwòl plizyè eleman regilasyon14,30,31, nou te analize sipèpoze ki genyen ant tout améliorant kominike ak pwomotè respektif yo. Nou te jwenn ke pandan chakmemwafaz, menm pwomotè yo kominike pi souvan ak yon sous-ensemble diferan de améliorant (sa vle di inik, Bazal - 3243, Bonè - 7602, Anreta - 7028, Reaktive - 7244; Fig. 4a,b; Done Pwolonje Fig. 3c; Tablo siplemantè 7). Rezilta sa a ki konsistan avèk piblikasyon anvan yo ki montre ke amelisateur miltip ki antoure plizyè jèn (c-Fos ak Arc) yo enpòtan anpil pou deklanchman yo ak frekans entèraksyon yo ak pwomotè respektif yo chanje an repons a divès ajan depolarize nan newòn kiltive31. Nou menm tou nou te idantifye yon ti gwoup entèraksyon kote pwomotè yo t ap kominike avèk menm améliorant yo atravè diferanmemwafaz (sa vle di komen, ~ 31 pousan nan tout entèraksyon; Tablo siplemantè 7). Anplis de sa, newòn reaktive prezante nòt entèraksyon siyifikativman pi fò (jan yo kalkile pa Chicago, Fig. 4b; Done Pwolonje Fig. 3d). Pakonsekan, byenke kantite entèraksyon inik yo te menm jan an nan eta byen bonè, an reta, ak reaktive, nòt entèraksyon pi fò yo endike ke entèraksyon pwomotè espesifik yo rive pi souvan pandan memwa.
sonje. Nosyon sa a te plis valide pa eksperyans 3C, ak primè ki fèt pou mezire frekans nan entèraksyon ant améliorant chwazi (E) ak pwomotè jèn (P) ki kode pou ekaryotik tradiksyon inisyasyon faktè 3 subunit D (Eif3d) oswa reseptè glutamate, ionotropik, kainate. 3 (Grik3) (Fig. 4c). Done nou yo te montre ke newòn reaktive yo te gen yon ogmantasyon siyifikatif nan frekans entèraksyon ant pwomotè Eif3d ak améliorant chwazi a, konpare ak lòt popilasyon yo (figi 4c). Ansanm, done sa yo endike ke entèraksyon pwomotè-améliorant yo rive pi souvan pandanmemwasonje.
Apre sa, nou te mande si wi ou non entèraksyon dinamik alontèk yo idantifye atravè pc-HiC koresponn ak rejyon kwomatin ki vin pi aksesib, jan yo detèmine atravè ATAC-seq. Sa a ta konfime ke aksè a ogmante gen yon konsekans fonksyonèl nan pote sou nouvo entèraksyon pwomotè-amelyore. Pou reyalize sa, nou te konpare sipèpoze ant améliorant kominike nan chak popilasyon selil ak DARs (obsève) oswa yon seri o aza nan loci genomic aksesib (espere). Analiz nou an te revele yon sipèpoze enpòtan ant tou de te genyen DARs nan aktive-bonè newòn ak stable te vin genyen DARs ak améliorant interaction yo, nan tout popilasyon selil (Tout Ps < 0.0001,="" pwolonje="" done="" fig.="" 3e).="" kontrèman,="" chanjman="" nan="" aksè="" chromatin="" ki="" te="" fèt="" pandan="" faz="" an="" reta="">memwakonsolidasyon ak reyaktivasyon pa t 'siyifikativman sipèpoze ak amelyore entèraksyon (Done pwolonje Fig. 3e). Ansanm, rezilta sa yo endike ke genyen aksè a pandan kodaj memwa se yon evènman priming ak loci primed sa yo angaje yo nan entèraksyon de-novo fonksyonèl pwomotè-améliorant pandan faz pita nan.memwafòmasyon. Sa a jaden flè dinamik ilistre pa vizyalize rejyon yo jenomik alantou ekaryotic tradiksyon inisyasyon faktè 5 subunit A (Eif5a) jèn (Fig. 4d). Diseksyon molekilè tanporèl sa a nan lavi engram la mete aksan sou fason kowòdone priming eta epigenetik yon selil pandanmemwakodaj ak konsolidasyon fasilite entèraksyon alontèm pandan reyaktivasyon.