Pati 1: Verbascoside Pwoteje Selil Pankreyas Kont ER-Estrès
Mar 05, 2022
Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plis , Paola Marciani 1, plis , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 ak Carla Perego 1,*
Résumé:
Prèv epidemyolojik sibstansyèl endike ke yon rejim alimantè ki rich nan polifenol pwoteje kont devlope dyabèt tip 2. Glikozid phenylethanoid laverbascoside/acteoside, yon konpoze plant polifenolik toupatou, gen plizyè pwopriyete byolojik ki gen ladan gwo antioksidan, anti-enflamatwa ak aktivite neuroprotective. Objektif rechèch sa a se te teste efè posibverbascosidesou selil pankreyas yo, yon sib pa janm teste anvan. Sourit ak selil imen yo te enkube akverbascoside(0.8–16 uM) pou jiska senk jou ak yon konbinezon de teknik byochimik ak imaj yo te itilize pou evalye siviv selil la ak fonksyon anba kondisyon nòmal oswa andoplasmik retikul (ER)-estrès pwovoke. Nou te jwenn yon efè pwoteksyon ki depann de dòz laverbascosidekont estrès oksidatif nan selil klonal ak imen. Etid mekanik te revele ke polifenol la pwoteje selil yo kont disfonksyon ER-estrès medyatè, modulation aktivasyon an nan pwoteyin kinaz RNA-tankou endoplasmic reticulum kinase (PERK) branch nan repons lan pwoteyin depliye ak ankouraje dinamik mitokondriyo. Kòm yon rezilta, ogmante viabilite, fonksyon mitokondriyo ak kontni ensilin yo te detekte nan selil sa yo. Etid sa yo bay prèv keverbascosideranfòse kapasite selil yo pou fè fas ak ER-estrès, yon kontribitè enpòtan nan malfonksyònman -selil ak echèk nan kondisyon dyabetik ak sipòte potansyèl la terapetik nan verbascoside nan dyabèt.
Mo kle:
verbascoside; polifenol; selil ki pwodui ensilin; dyabèt; UPR; estrès oksidatif; ER-estrès; PERK; anti-enflamatwa; mitokondri
1. Entwodiksyon
Dyabèt se yon maladi kwonik ki afekte plizyè santèn milyon moun [1]. Etyoloji diferan karakterize tip 1 (T1D) ak tip 2 dyabèt (T2D) tou de prezante mank ensilin [2]. Ensilin kontwole konsantrasyon glikoz nan plasma stimul absorption glikoz nan misk ak selil grès ak modile metabolis glikoz fwa. Disponibilite eleman nitritif, òmòn, ak entrées neral kontwole sekresyon ensilin pankreyas epi kenbe konsantrasyon glikoz nan san nan yon seri fizyolojik [3-5]. Se poutèt sa, malfonksyònman -selil mennen nan dyabèt karakterize pa jèn ipèglisemi.
T2D se yon kondisyon pwogresif kote rezistans ensilin ak disfonksyon selil yo lye ansanm ak prèv ki sot pase yo te ogmante enterè nan wòl prensipal prensipal selil yo nan sitiyasyon ipèglisemi [6,7]. Nan sijè ki pa dyabetik obèz - selil konpanse rezistans ensilin ak ogmante sekresyon òmòn nan. Sepandan, nan kèk sijè, kòm kondisyon yo deteryore, ensilinemi gout ak nivo glikoz monte nan ipèglisemi [8,9].
Glikoz se modulateur ki pi enpòtan nan fonksyon selil yo. Eksitasyon glikoz afekte règleman jèn yo ak ekspresyon pwoteyin ki enplike nan anpil fonksyon selil tankou glikoliz, sentèz ensilin ak sekresyon [10]. Sekresyon ensilin ki pwovoke glikoz depann sou metabolis oksidatif pou pwodui adenosine trifosfat (ATP) ak yon nivo ki ba nan espès oksijèn reyaktif (ROS) pwodui fizyolojik. Sepandan, -selil yo pa trè byen ekipe ak anzim scavenger ak feblès sa a fè yo trè sansib a estrès oksidatif [11,12]. Kòm estrès oksidatif monte - selil pwodiksyon ensilin diminye, epi - selil yo pwodui sitokin ki deklanche domaj selil yo atravè enflamasyon ak apoptoz [13]. Enteresan, byenke mas selil redwi yo te deja atribiye a lanmò selil, etid resan yo sijere yon gwo wòl nan dediferentiyasyon selil [14,15]. Li te vin klè ke plizyè etap kondwi nan T2D. Ensilte metabolik ak oksidatif lakòz estrès retikul andoplasmik (ER) ki mennen nan n bès nan sentèz ensilin ak sekresyon, pwosesis enflamasyon swiv lage cytokines ak pèt selil yo ka rive nan apoptoz ak dediferentiyasyon. Konesans sa a se fondamantal yo nan lòd yo devlope estrateji apwopriye nan tretman, depi estrès oksidatif ak enflamasyon ka kontrekare, ak plastisit nan selil pankreyas yo pèmèt posiblite pou retounen selil souch nan -selil jan yo pwouve nan sourit [16].
Dènyèman, vilnerabilite nan -selil nan estrès oksidatif te avèk siksè pouse itilize nan antioksidan dyetetik pou anpeche dyabèt [17]. Pami manje ki pi enteresan antioksidan, lwil oliv se li te ye pou pwopriyete benefis li yo depi ansyen Lagrès yo. Lwil oliv gen bon kantite asid gra mono-enstore (MUFA) ak plizyè polifenol tankou tirosol, hydroxytyrosol, oleuropein, ak verbascoside.
Verbascoside, ke yo rele tou acteoside, se yon glikozid feniletanoid ki sòti nan Olea europea, plant nan espès Verbascum, ak 23 lòt fanmi plant [18-20]. Li ka jwenn tou nan sous-pwodwi lwil oliv (li anrichi nan dlo ize moulen oliv ki sòti nan pwosesis fwi oliv) oswa yo ka pwodwi pa jeni metabolik ak apwòch biyoloji sentetik [21].
Pa gen okenn done yo te rapòte sou byodisponibilite verbascoside nan imen, ankò. Etid ki fèt sou sourit, SKBR3 ak selil Caco-2 sijere ke li ka posib pou verbascoside ki pa metabolize travèse baryè entesten an, sikile nan plasma san, epi fè efè antioksidan [20,22,23]. Kontrèman ak pi fò nan polifenol plant yo, verbascoside sitou aji sou selil yo atravè modulasyon nan transkripsyon jèn nan yon varyete de anzim ak faktè regilasyon, ak efè antioksidan ak anti-enflamatwa [24-30].
Malgre ke yo konnen anpil efè benefis verbascoside pou sante moun, pa gen okenn done sou efè li sou selil pankreyas yo. Piske estrès oksidatif ak enflamasyon se nan baz patojèn T2D, nou te envestige si tretman verbascoside ta ka amelyore viabilite selil yo ak
fonksyon nan kondisyon ER-estrès pwovoke epi nou karakterize mekanis molekilè nan aksyon li yo. Done nou yo revele ke verbascoside anpeche estrès oksidatif selil yo ak enflamasyon modile deklanchman repons pwoteyin ki dewoule a ak ankouraje dinamik mitokondriyo, kidonk sa ki lakòz ogmante viabilite selil ak kontni ensilin.
2. Materyèl ak Metòd
2.1. Selil Kilti ak Materyèl
Selil sourit tc3 (pwofesè Hanahan—Depatman byochimik ak byofizik, University of California, San Francisco, CA [31]) yo te kiltive nan mwayen RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90). 0, Pero MI, Itali) complétée ak 10 pousan (v/v) chalè-inaktive serom ti towo bèf fetis (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Itali), 1 pousan (v/v) penisilin-streptomycin (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Itali) ak 1 pousan (v/v) L-glutamine (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Itali). Ilo imen nan Langerhans yo te izole nan Milan (Niguarda Ca' Granda) soti nan donatè kadav milti-òganis dapre pwosedi ki dekri pa Ricordi et al. [32]; yo te kiltive nan mwayen kilti RPMI ki gen 5.5 mmol / L glikoz, 10 pousan chalè-inaktive fetal serom fetis, 0.7 mM Glutamine, 50 inite / mL penisilin ak 50 ug / mL streptomycin (EuroClone, SpA, Pero MI, Itali). Kat preparasyon ilo diferan yo te itilize, pite ilo yo te 80 ± 10 pousan. Komite etik nan lopital Niguarda Ca' Granda nan Milan te apwouve izolasyon ak etid islet (11.12.2009). selil tc3 yo te trete ak 0.8, 1.6, ak 16 uM verbascoside (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), asid kafeik ak hydroxytyrosol (kado kalite Professeur Dell'Agli, Depatman Syans Farmakolojik ak Biomolekilè, Universita degli Studi di Milano, Milan, Itali) nan mwayen RPMI konplè pou 5 jou, pandan y ap ilo imen ak 16 uM verbascoside. Selil trete metanol/etanòl yo te itilize kòm kontwòl. Yo nan lòd yo pwovoke estrès oksidatif, selil yo te trete ak H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM nan mwayen RPMI konplè pou 20 minit anvan analiz, pandan y ap tretman ak tunicamycin 2 ug / mL (T7765, Sigma Aldrich). ) pou 7 h te fèt pou pwovoke estrès ER.
2.2. Deteksyon nan rantabilite selil pa tès MTT
Selil yo te plake nan 96 plak milti-puit, epi senk jou apre tretman verbascoside yo te enkube ak 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethyltiazol{{7} }yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromur) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) pandan 4 èdtan nan yon atmosfè imidifye ki genyen 5 pousan CO2 a 37 oC. Apre enkubasyon, selil yo te dousman resuspend nan 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Itali) ak absorpsyon nan 540 nm te detekte ak yon lektè microplate (Benchmark, lektè microplate, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) [33]. Eksperyans yo te fèt an triple ak done yo te eksprime kòm ogmantasyon pliye sou echantiyon kontwòl.
2.3. Deteksyon Lanmò Selil pa Flow Cytometry
Senk jou apre enkubasyon ak 16 uM verbascoside, selil yo te detache pa 7 min enkubasyon ak trypsin / EDTA, kolekte epi santrifuje; te granules a dousman resuspende nan fosfat tanpon saline sèl ki ba. Selil yo te tache ak MuseTM konte ak reyaktif viabilite (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) swiv pwotokòl manifakti a epi analize atravè sitometri koule. Eksperyans yo te fèt an triple ak done yo te eksprime kòm pousantaj nan selil mouri sou total la.
2.4. ROS Jenerasyon
ROS Entraselilè yo te evalye ak DCFDA (2/,7/-dichlorofuorescein diacetate) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA), yon sond manbràn pèmeyab ki vin fliyoresan lè mare nan ROS [34]. selil tc3 yo te pre-chaje ak 15 uM DCFDA nan tanpon Krebs-Ringer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7.4 ak 2 mM CaCl2)
konplete ak 11 mM glikoz pou 1 èdtan nan 37 oC. Kontni ROS la te detekte pou 30 minit tou de nan kondisyon fondamantal ak estrès ak yon lektè microplate (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Swis). Valè mwayen ak devyasyon estanda yo te baze sou twa eksperyans endepandan.
2.5. Western Blotting
selil tc3 yo te kolekte epi solubilize nan tanpon RIPA (15 0 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 1 pousan TERGITOLw NP40, 0.5 pousan deoxycholate) te ajoute ak aprotinin (Sigma Aldrich, A45299, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) ak inibitè Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) pou 40 min nan 4 oC. Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine pa tès Bradford [35] lè l sèvi avèk Bradford Reagent (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA), 30 ug pwoteyin yo te rezoud pa 10 pousan SDS-PAGE epi yo te transfere sou manbràn nitrocellulose (Millipore, Burlington). MA, USA). Antikò prensipal yo te aplike pou 2 èdtan nan bloke tanpon ak 5 pousan lèt ki pa gen anpil grès oswa 5 pousan solisyon BSA; Antikò prensipal sa yo te itilize: sourit anti- -aktin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), sourit anti-akrolein (Abcam, ab48501,Cambridge, UK), sourit anti-BIP (kado janti nan prof. Borgese Nica, Enstiti nan nerosyans, CNR, Milan, Itali), lapen anti-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), sourit anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), lapen anti-phospho-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), sourit anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, USA), lapen anti-phospho-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), lapen anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), mouton anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), lapen anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), lapen anti-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA). Inc., 5324, Danvers, MA, USA) ak lapen anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). Antikò segondè yo HRP-konjige (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) yo te itilize nan 1:5000 dilution. Pwoteyin yo te detekte lè l sèvi avèk sistèm deteksyon ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Itali) lè l sèvi avèk sistèm Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Almay) ak dansite bann te quantifike pa lojisyèl Image Studiow Lite (LI). -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. Eksperyans yo te fèt an triple ak done yo te eksprime kòm ogmantasyon pliye sou echantiyon kontwòl.
2.6. Potansyèl manbràn mitokondriyo
selil tc3 ak ilo imen nan Langerhans yo te enkube ak 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Itali) oswa 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde nan 3 730 min, Itali) Srl, Milan, Itali. oC; Entansite fliyoresans yo te detekte ak lektè mikroplak TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em pou MitoSpyw Orange CMTMros; 490/516 nm Ex/Em pou MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Männedorf Group, Swis). Selil yo te enkube ak 500 uM H2O2 pou 20 min epi yo te detekte entansite fliyoresans jan sa dekri anvan an. Valè mwayen ak devyasyon estanda yo te baze sou twa eksperyans diferan.
2.7. Mòfoloji mitokondriyo ak dinamik
selil tc3 yo te pre-chaje ak 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Itali) nan 11 mM glikoz Krebs-Ringer tanpon nan 37 oC pou 30 min. Echantiyon yo te pozisyone nan yon chanm D epi yo te imajine jaden o aza yo lè l sèvi avèk filtè rhodan nan mikwoskòp Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Almay). Pou evalye mòfoloji mitokondriyo, yo te analize paramèt sa yo lè l sèvi avèk lojisyèl analizè patikil ImageJ la: zòn (um2), sikilè (4mArea2/Perimeter2) ak dyamèt maksimòm Feret (um) [37].
Pou eksperyans time-lapse, yo te pote imaj yon sèl selil nan 1 ankadreman pou chak segonn pou 30 s anba kontwòl oswa kondisyon estrès oksidatif. Pou mezire distans kimilatif mitokondriyo a (um2), imaj yo te premye korije pou klowòks foto, answit videyo yo te analize lè l sèvi avèk yon Plug-in Image-Pro Plus ki egziste deja (swiv objè) (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Jiska douz
selil yo te imajine nan twa eksperyans endepandan ak done yo te prezante kòm valè vle di ak devyasyon estanda.
2.8. Sekresyon ensilin
Ilo izole imen nan Langerhans yo te simen nan 96-plak byen nan yon dansite 20 ilo pou chak pi epi, apre 5 jou nan tretman an, kontni ensilin ak sekresyon yo te mezire nan baz (3.3 mM glikoz) ak ankouraje (16.7 mM glikoz). ) kondisyon pa mwayen yon immunoassay ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Upsala, Syèd).
2.9. Analiz estatistik
Tout analiz estatistik yo te fèt ak GraphPad Prism 8.0 sou kopi byolojik endepandan. Yo te evalye mwayen ant de gwoup yo lè l sèvi avèk tès t Student de-ke a epi yo te pran yon valè p < 0.05="" kòm="" prèv="" siyifikasyon="" estatistik.="" vle="" di="" nan="" mitan="" twa="" oswa="" plis="" gwoup="" yo="" te="" konpare="" pa="" analiz="" de="" divèjans="" (anova),="" ki="" te="" swiv="" pa="" plizyè="" tès="" konparezon="" post-hoc="" (tukey="" a).="" tès="" estatistik="" yo="" itilize="" a,="" valè="" egzak="" p="" ak="" kantite="" kopi="" (n)="" yo="" endike="" nan="" lejand="" figi="" endividyèl="" yo.="" ba="" erè="" nan="" figi="" yo="" montre="" mwayèn="" ±="" sd="" oswa="" mwayèn="" ±="" se,="" jan="" sa="">
3. Rezilta yo
3.1. Verbascoside Amelyore -Selil Viabilite
Depi pa te gen okenn done sou efè verbascoside sou selil yo, nou te fè tès MTT pou evalye viabilite selil yo epi jan yo montre nan Figi 1A, yo te obsève yon tandans pozitif ki depann de dòz la. Pakonsekan, pou plis etid, nou te chwazi konsantrasyon 16 uM ki estatistikman te pwouve efikas pou amelyore viabilite selil yo. Pa sikometri koule nou te etidye enpak senk jou enkubasyon verbascoside sou siviv selil yo nan kondisyon fondamantal ak apre 2{{21} } min nan pre-tretman ak 500 uM H2O2. Nan kondisyon fondamantal la, verbascoside pa t afekte siviv selil yo, sa ki sijere ke ogmante viabilite selil yo obsève nan tès MTT a ka akòz aktivite mitokondriyo amelyore. Lè nou konsidere ke, apre ekspoze H2O2, pre-tretman 16 uM verbascoside redwi siyifikativman estrès oksidatif-pwovoke lanmò selil (Figi 1B, C). Verbascoside se yon molekil konplèks ki ka modifye pa idrolize anzim [18]. Pou teste si metabolit verbascoside ta ka responsab efè pwoteksyon obsève, selil tc3 yo te trete ak idroksitirosol ak asid kafeyik (0.8 ak 16 uM) pou 5 jou. Tou de metabolit pa t 'amelyore viabilite selil yo, okontrè yon efè sitotoksik, ki pi enpòtan apre ekspoze H2O2, te detekte pou konsantrasyon 16 uM (Figi S1). Konklizyon sa a pwouve ke verbascoside epi pa metabolit li yo egzèse efè pwoteksyon nan tretman H2O2.
3.2. Verbascoside modile omeyostaz redox la epi li gen yon efè anti-enflamatwa nan selil yo.
Premye nou te konfime nan selil tc3 efè anti-enflamatwa ak antioksidan verbascoside obsève nan lòt kalite selil [24,29,34]. Yo te evalye aktivite verbascoside ROS a ak selil tc3 ki make ak ROS espesifik DCFDA (2/,7/-dichlorofuorescein diacetate) selil pèmeyab pwofonde. Jan yo montre nan Figi 2A, yo te detekte yon diminisyon enpòtan nan kontni ROS apre tretman pre-verbascoside, tou de nan kondisyon estrès fondamantal ak oksidatif.
Analiz Western blot te revele yon diminisyon siyifikatif nan makè estrès oksidatif akrolein ak ekspresyon 4-hydroxynonenal (HNE) nan selil trete verbascoside. Anplis de sa, nou te jwenn yon ogmantasyon nan ekspresyon superoxide dismutase (SOD1), sijere ke verbascoside egzèse aktivite antioksidan li yo pwobableman ak de mekanis diferan, dirèkteman kòm yon ROS scavenger ak endirèkteman pa pwovoke ekspresyon an nan anzim antioksidan (Figi 2B, C).
Efè anti-enflamatwa verbascoside sou selil yo te evalye lè yo evalye deklanchman chemen NFKB, chemen ki pi enpòtan pro-enflamatwa nan selil sa yo [38]. Dapre analiz Western blot nou jwenn yon ekspresyon redwi nan inibitè nan faktè nikleyè kappa B (IKB) ak faktè nikleyè kappa-light-chain-enhancer (NFKB), ak yon diminisyon siyifikatif nan fosforilasyon NFKB nan selil pre-trete, apiye ipotèz la nan efikasite verbascoside pou diminye enflamasyon selilè (Figi 2D, E).
3.3. Verbascoside Module Repons Pwoteyin Depliye nan -Selil yo
Lè sa a, nou analize an pwofondè mekanis molekilè nan ki verbascoside egzèse wòl antioksidan ak anti-enflamatwa, konsantre sou retikul la andoplasmik ki ap parèt kòm yon detèktè kle nan metabolik ak siyal estrès nan selil yo. Anba kondisyon estrès, òganèl la monte yon repons omeostatik, ke yo rekonèt kòm repons pwoteyin depliye (UPR), ki vize refè fonksyon ER la; sepandan, aktivasyon an twòp nan chemen sa a rezilta nan apoptoz [39,40].
Makè ogmante estrès ER yo se regilasyon an nan pwoteyin chaperones ak aktivasyon repons UPR la. Analiz Western blotting nan selil trete ak verbascoside revele nivo diminye nan de chaperonin chalè chòk pwoteyin 70 (HSP70) ak pwoteyin obligatwa imunoglobulin (BIP) (Figi 3A, B). Anplis de sa, yo te detekte yon rediksyon siyifikatif nan ekspresyon ER kinaz (PERK) ki sanble ak pwoteyin kinaz RNA ak fosforilasyon diminye efèktè en li yo, faktè inisyasyon tradiksyon ekaryotik 2 (eIF2).
