pou plis information:ali.ma@wecistanche.com

Diskisyon

Molekilè anba fòmasyon gram yo te yon zòn nan gwo enterè. Isit la nou pran avantaj de modèl la sourit TRAP yo elimine dinamik yo nan aksè kwòm, 3-D achitekti jenomik, ak ekspresyon jenetik atravè lavi a nan yon selil gram. Premyèman, nou montre dirèkteman saMemwaankouraje gen yon efè vas ak long ki dire lontan sou aksè kwomatin. Yon fwa eta chromatin sa a etabli, evènman ki vin aprè tankouMemwakonsolidasyon ak sonje parèt gen yon efè minè sou jaden flè kwomatin lan. Li posib ke pwen an tan chwazi pou sonje pa ka konplètman pran evènman yo kromatin nan selil reyaktive ak chanjman kwomatin ki vin apre yo ta ka asosye akMemwarekonsolidasyon oswa disparisyon8. Sa ki enpòtan, nan liy ak piblikasyon yo anvan yo12, 13,23, done nou yo sijere keMemwafòmasyon se lajman yon fenomèn amelyore-kondwi.

Klike sou Cistanche UK pou memwa

Dezyèmman, etid nou an bay premye jaden flè konplè nan achitekti 3D-genome pandan faz diferan nanMemwafòmasyon, jan nou te montre re-lokalizasyon nan segman kwomatin gwo ak pwomotè espesifik -amelyore entèraksyon dinamik nan konpatiman sa yo ki pèmèt amann-melodi nan diferan pwogram transkripsyonèl. Anplis, nou montre ke pwomotè nan jèn ki gen reglemante pi souvan ak amelyore ki reprezante represyon transkripsyonèl ak vis vèrsa.

Denye, travay nou an bay premye prèv la pou yon evènman prim fonksyonèl, ki karakterize pa yon ogmantasyon premye nan aksè amelyore pandan kodaj, san yo pa espere chanjman transkripsyonèl. Analiz nou an revele ke avèk reyaktivasyon, gram ewonn itilize yon subset nan entèraksyon denovopromoter-amelyore, kote amelyorasyon prime yo te pote an kontak ak pwomotè respektif yo pou kontwole jèn ki enplike nan transpò MRNA ak pwoteyin lokal nan konpatiman synaptik. Chanjman sa yo koresponn ak espere chanjman mòfolojik ak fonksyonèl. Kolektivman, li parèt ke selil gram yo make nan nivo epigenetik la ak entèprèt la ant aksè kwomatin, achitekti 3D-jenere, ak ankouraje entèraksyon amelyore dekri yon sistèm ki byen kowòdone ki mennen nan yon vag transkripsyonèl reta pandan reyaktivasyon gram.

Menm jan ak nenpòt travay, te gen plizyè limit pou etid la. Itilize nan taks-depandan TRAP la pèmèt pou rezolisyon tanporèl men louvri yon fenèt etikèt sou 12 èdtan ki ta ka rezilta nan ki pa espesifik tagging nan ewonn ki pa yon pati nan eksperyans nan CFC. Anplis, kòm deja sijere37, ewonn yo Arc-tagged ta ka eterogene epi li gen ladan diferan ènmi ki kontwole tou deMemwadiskriminasyon ak jeneralizasyon. Anplis de sa, nenpòt ki pwen tan anvan 1.5 –2 hr (bonè), pa pral ase yo pran evènman transkripsyonèl ak tradiksyonèl ki te koze pa rekòmandasyon ADN, sa vle di ekspresyon an nan rekòmandasyon Kre ak ekspresyon final la nan jenetik EYFP. Pakonsekan, nou kwè ke anpil gwoup tranzisyon bonè nan DEG yo te rate, menm jan li te montre deja ke anpil IEG retounen nan nivo debaz apre 2h (eksepte Arc46). Anfen, byenke etid nou an konsantre sou ipokanp la, plastik estriktirèl ak synaptik yo te lye nan depo alontèm nan enfòmasyon nan lòt rejyon nan sèvo, tankou cortical la prefrontal, amygdala2. Etid nan lavni ta dwe detèmine si chanjman epigenetik sa yo ka reprezante yon pwosesis kritik mondyal ki enplike nan fòmasyon an alontèm ak retansyon nan memwa oswa si li inik nan sikwi ipokanp yo.

Metòd

Sourit ak konpòtman

Kòm deja dekri6, ArcCreERT2 (+) mice te kwaze ak R26R-STOP-flox- jòn pwoteyin fluoresan (eYFP) liy omoseksyèl. ~ 140 desandan gason ki vin apre yo te genotype lè l sèvi avèk pwotokòl la Jackson Laboratory jenotype. Mice te kat a senk pou chak kaj nan yon 12 hr (06:00-18:00) chanm koloni limyè-nwa nan 22 °C ak 40-60% imidite. Yo te bay manje ak dlo. Tès konpòtman an te fèt pandan faz limyè a. 1h anvan tès konpòtman an, mice te resevwa yon dòz 4-Hydroxytamoxifen (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich), ki louvri yon ~ 12 hr fenèt etikèt. Yo nan lòd yo minimize etikèt la eYFP san ase, yon jou anvan travay konpòtman an (pa tankou CFC), mis yo te yon sèl kay nan yon 24h nwa / nwa. Anplis de sa, diminye nivo enkyetid, yo te ajoute yon tib nan kaj la pou abri ak nesesite. Nan demen, mis yo te sou fòm piki ak TAM 1h anvan CFC la. Apre travay konpòtman an, mis yo te swa etwat apre 1.5–2 h, ak sèvo yo te ranmase. oswa mete tounen nan sal la fènwa pou sa ki annapre yo 48 hr. Apre yo te fin retire yo nan fènwa a, yo te retounen nan nòmal 12 hr (06:00–18:00) sik limyè-nwa, nan menm chanm nan. 3 jou apre (total de 5 jou apre CFC a), mwatye nan kowòdone a mis yo te etwat ak sèvo yo te ranmase, pandan ke lòt mwatye a retounen nan chanm nan tès, kote yo te ekspoze a siyal la pè -ton ak kontèks). Tout travay sourit la te apwouve pa Komite pou Swen Animal divizyon Medikaman Konparatif nan Enstiti Massachusetts la nan Teknoloji. Cistanche ka amelyoreMemwa.

Cistanche ka amelyore memwa

Kontèks pè kondisyone

Aparèy kontèks pè (CFC) aparèy ak pwogram akizisyon an te soti nan TSE- Systems. Mice te prezante nan chanm CFC a, apre 3 minit nan premye abitid abitid 3 kilo Hz ton ak 80 DB entansite te prezante pou 30 segonn e li te ko-sispann ak 0.7 mA pye chòk pou 1 sec. 70% ispanol te itilize ant eksperyans yo netwaye kaj yo. 5 jou pita yo te prezante nan kontèks orijinal la kondisyone pè ak nivo yo ton ak friz nivo yo te mezire pou 3 min (TSE lojisyèl default paramèt itilize pou kontwole konpòtman friz), evalye kontèksMemwa. Kontèks B te yon kontèks modifye A. Ba asye pur yo te kouvri ak yon insert plastik blan, mi yo eksteryè nan chanm yo te kouvri ak fòm kasèt pou chanje aparans nan chanm lan. Chanm lan te santre ak vaniy, ekleraj la sal te pi klere ak mis la te transpòte nan aparèy la nan yon machin diferan soti nan kontèks A.

Dwòg

Rekòbinasyon nan ArcCreERT2 × R26R-STOP-Floxed-EYFP transgenic mice te pwovoke lè l sèvi avèk 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich). 4-OHT te fonn nan 2.5ml nan ETOH / 100% ak wòch sou yon tranbleman pou 30 min. Apre sa, 5ml nan lwil mayi te ajoute ak wòch sou yon tranblemanntè pou 1h. Finalman, yo te mete ti tib yo pou 30min nan 60 ° C pou pèmèt evaporasyon an plen nan ETOH. Yon sèl-piki nan 50 mg / kg te piki intraperitone (sètadi p.).

Immunohistochemistry (IHC)

Mice yo te transfere ak glas-frèt 25 ml nan saline fosfat-afekte (PBS) ki te swiv pa 40 ml nan4% paraformaldehyde nan PBS. Sèvo yo te retire ak pòs-fiks nan 4% PFA lannwit lan nan 4 °C ak transfere nan PBS jouk seksyon. Sèvo yo te monte sou yon etap vibratome (Leica VT1000S) lè l sèvi avèk superglue ak seksyone ak yon epesè tranch nan 40 μm. Tranch yo te lave ak PBS ak bloke lè l sèvi avèk 1% Bovine Serum Albumin (BSA) prepare nan PBS ki gen 0.1% Triton-X100 (PBST) pou 2 h nan tanperati chanm. Bloke tanpon te aspire deyò ak tranch yo te enkyete ak antikò prensipal ki apwopriye (Tab siplemantè 11) lannwit lan nan 4 °C sou yon tranbleman tè. Tranch lè sa a yo te lave twa fwa 15 minit chak ak tanperati a bloke, ak Lè sa a, yo te inogire ak Alexa Fluor 488, 594, oswa 647 konjige antikò segondè pou 2 h nan tanperati chanm. Apre twa lave 15 minit chak ak bloke tanpon ak yon sèl final lave ak PBS pou 10minues, tranch yo te monte ak fluunt-G (Elektwonik mikwoskòp Syans). Cistanche ka amelyoreMemwa.

Nan Situ Hybridization (RNAscope®)

Echantiyon yo te prepare ki baze sou enstriksyon manifakti a pou RNAscope® miltip fluorescent v2 aza (avanse dyagnostik selil avanse, USA), ak kèk modifikasyon ak konbine avèk pwotokòl la Immunohistohim (IHC) pwotokòl. Premyèman, echantiyon yo te tache pou primè (Arc ak GFP) ak segondè (Alexa Fluor 488 ak 594, respektivman) antikò (jan sa dekri nan pwotokòl la IHC pi wo a). Tranch sèvo yo te entegre sou yon glise vè ak

dezidratasyon pou 30 min nan RT. Apre sa, yon baryè te trase alantou chak seksyon ak plim idwojèn imedyatman™ ak echantiyon yo te trete ak RNAscope® Hydrogen Peroxide pou 10 min nan RT (pa gen okenn sib rekival ak tretman pwoteyin yo te aplike). Baze sou enstriksyon manifakti a, seksyon yo te sibi pwobableman ibridizasyon (RNAscope® Probe- Mm-Gria1, 26241, dyagnostik selil avanse), anplifikasyon, ak HRP-C1 siyal devlopman siyal lè l sèvi avèk TSA® Plus Cyanine 5 chanèl. Cistanche ka amelyore memwa.

Imaj analiz

Imaj yo te akeri lè l sèvi avèk yon LSM 710 oswa LSM 880 mikwoskòp konfo (Zeiss) ak 10×, 20×, 40×, oswa 63× objektif nan anviwònman ki idantik pou tout kondisyon. Imaj yo te quantified lè l sèvi avèk Imaj 1.42q oswa Imarisx64 8.1.2 (Bitplane, Zurich, Swis). Pou chak kondisyon eksperimantal, senk seksyon kowonal soti nan omwen senk bèt yo te itilize pou quantifikasyon. Cistanche ka amelyore memwa.

Quantifikasyon nan selil atenn -Modil la sifas yo te itilize yo detekte Arc + ak eYFP + selil yo. Double selil pozitif (ko-lokalizasyon nan Arc +/eYFP +) yo te Lè sa a, konte lè l sèvi avèk modil la sifas-To-Sifas Xtension. Apre ou fin aplike filtre 'zòn nan' (>6μM) yo retire etikèt san espesifik, kalifikasyon nan selil yo doub-pozitif te pote nan CA1, CA3 ak DG. Cistanche ka amelyore memwa.

Quantifikasyon nan Eif ak Gria1 pwoteyin / MRNA-Modil sifas yo te itilize pou detekte ak 3D rann axons ki baze sou siyal GFP la. EiF2a, Eif4E, Eif3E, ak Gria1 -pozitif pozitif lè sa a yo te Konte lè l sèvi avèk modil yo tach. Finalman, Tach yo fèmen - To -Sifas Xtansion modil te kouri jwenn subset la nan tach ki pi pre objè yo sifas pase papòt yo defini 1uM, ak eksklizyon nan tach ki tonbe deyò ranje sa a.

Kolòn vètebral—Kolòn vètebral yo te klase nan twa kalite baz sou longè kolòn vètebral la (L), dyamèt tèt (Dh) ak dyamèt kou a (dn). Stubby zo - Dn = L, mens - L > Dn ak Dh ≥ Dn, djondjon zo rèl - Dhing ≥ 2Dn, elaji zo djondjon - Dh ≥ 2Dn.Cistanche ka amelyore memwa.

Cistanche ka amelyore memwa

preparasyon tisi

Tisi ipokanp te ekstrè ak flanm dife. Apre ekstraksyon, echantiyon yo te imedyatman omojèn nan 0.5 mL glas pbs ak inibitè pwoteyin (Pi) (11836170001, Roche). Pou bese enpak klasman an otank posib, nan NC-RNAseq ak eksperyans kaptire-HiC sèlman, sispansyon an te fiks ak 1% (pou NC-RNAseq / HiC) oswa 2% (pc-HiC) paraformaldehyde pou 10 min, tranpe ak Glycine 2.5M pou 5 min, ak lave de fwa ak 5 mL nan PBS. Pwosesis sa a konsève jaden flè transkripsyonèl ak kromatin ak minimize patipri klasman. Pou ATACseq, RNAseq ak kaptire-HiC, sispansyon an te santrifye nan 1200 g, 4 °C, pou 5 minit ak pellet la te respekte nan 5 mL NF-1 ipotonik buffer (0.5% Triton X-100 / 0.1M Sucrose / 5mM MgCl2 / 1mM EDTA / 10mM Tris-HCL, pH 8.0, Pi). Apre sa, sispansyon te dounce-omojèn (ensèk nuizib A) ak 30 konjesyon serebral ak ensèk nuizib lave ak siplemantè 5mL NF-1 pou yon total de 10 mL. Sispansyon yo te ranmase tout nan yon tib konik 15 mL, filtre ak 70 μm filtre (08-771-2, Falcon) ak incubated yon fwa pou 30 min. Pelleted nikleyè (tout santrifij yo te 4 °C, 1,600 × g pou 15 min) yo te reyisi nan 10 mL PBS +1%BSA +Pi ak incubated yon fwa pou 1 h. Nuclei te desann ak plonje a te respekte nan 1 mL PBST +1%BSA +Pi ak enkyete ak NeuN, Arc ak GFP antikò prensipal pou lannwit lan nan 4 °C. Antikò san limit yo te lave de fwa ak 5 mL nan PBS epi finalman reyisi nan 1 mL PBS +1%BSA +Pi ak antikò segondè pou 2-4 h nan 4 °C. Apre de lave, nikleyè yo te reyisi nan 0.5 mL (PBS +1%BSA+Pi) ak filtre ak 40 μm filtre pou FACS klase. 4′,6-Diamidine-2′-fenomèn dihydrochloride (DAPI) te ajoute dirèkteman nan tib FACS yo (1:5000, 10236276001, Sigma-Aldrich). Cistanche ka amelyoreMemwa.

Koule sitim

Pou klimatri koule, nikleyè yo te bat premye lè l sèvi avèk pi devan ak dispèsyon batman kè zòn (FSC-A ak SSC-A) eskli debri, ki te swiv pa eksklizyon nan total lè l sèvi avèk batman kè (FSC-W ak SSC-W). Lè sa a, izotype kontwòl tach yo te itilize yo mete NEUN +, ARC +, ak GFP + pòtay. Pou sekirite yon popilasyon ewonn omojèn, popilasyon neuN + la te bat anvan gating popilasyon ki baze sou ARC + ak GFP + fluoresans. Nou klase kat popilasyon diferan soti nan twa pwen tan diferan; Apeprè 1.5 - 2 èdtan apre ekspoze a FS i) NeuN +/GFP+ ii) NeuN +/GFP-. Apre senk jou, nan absans la nan rekipe, nou ranmase III) NeuN +/GFP +. Nan yon kòwòt diferan, mis yo te re-ekspoze a estimulus la kondisyone. 1.5–2 èdtan apre re-ekspoze nou ranmase iv) NeuN +/ARC +/GFP+. Tout nwayo yo te klase nan 1.5 mL Eppendorf tib ki genyen; 500 μl PBS + 1%BSA +Pi pou ATCAseq, 200 μl nan dijesyon tanpon (Recoverall™ Total Asid Izolasyon Nikleyik Kit pou FFPE, Cat. AM1975, Envitrogen) pou RNAseq, 500 μl fresh glase-frèt lysis buffer (10mM Tris pH = 8, 10mM NaCl, 0.2% Igepal CA-630, Pi ak PCR klas dlo) pou Hi-C / kaptire-HiC. Done analiz te fèt ak Flowjo (v10).

Chip-qpCR

Touswit apre klasman sa a, 10,000 selil yo te pelleted nan 4 °C, 1,600 × g pou 15 min, ak respekte nan SDS lysis. ChIP te fèt ki baze sou enstriksyon manifakti a pou ChIP-IT High Sansiblite® (HS) Kit (Katalòg No 53040, Aktif Motif, USA) lè l sèvi avèk anti-H3K4me1 (Abcam, ab8895, 1:100) ak anti-H3K27ac (Abcam, abb729, 1:100) antikò. ChIP asasinay yo te fèt nan yon Bio-Rad CFX96 konekte inite an tan reyèl PCR lè l sèvi avèk SsoFast™ EvaGreen® qPCR reagent melanje (Bio-Rad, 172–5202). Echantiyon yo te atake nan triplicates ak rezilta yo te nòmalize pou opinyon. Sekans nan pè prensipal pou ChIP -QPCR redaksyon yo ki nan lis nan Tab Siplemantè 12.

Cistanche ka amelyore memwa

ATAC-seq

preparasyon bibliyotèk-ATAC bibliyotèk seksyèl yo te prepare kòm deja dekri nan49 ak modifikasyon minè. 10,000 selil ki soti nan chak gwoup, yo te rale soti nan 8-10 diferan mis ak konsidere kòm N = 1. 3–4 replike byolojik (N = 3–4) yo te itilize pou preparasyon bibliyotèk. Touswit apre klasman sa yo, selil yo te desann (4 ° C, 1,600 × g pou 15 min) ak respekte nan fre 50 ul frèt lysis frèt (0.15% NP-40 olye pou yo Igpal) ak wòch yon fwa pou 10 min. Apre sa, reyaksyon segman (Nextera ADN echantiyon preparasyon twous 24 reyaksyon, FC-121–1030, Illumina) te pote soti nan 25 ulvolim (12.5 μl TD, 1.25 μl TDE1, 11.25 μl niklease-gratis dlo), pou 30 min nan 37c ak wòch dou. Fragman ADN ogmante yo te anplifye ak barkode lè l sèvi avèk reyaksyon PCR (1 sik; 5min - 72c, 30sec - 98c, 10 sik; 15sec - 98c, 30sec - 60c, 3min - 72c). Apre pwotokòl manifakti a, ADN anplifye te netwaye ak pirifye lè l sèvi avèk 1.8x AMPure pèl (AmpureXP pèl, Beckman Coulter, A63880). Apre bioanalyzer QC pou gwosè bibliyotèk ak distribisyon, bibliyotèk yo te sekans sou Illumina Nextseq 550 platfòm nan MIT BioMicro Center la. Cistanche ka amelyore memwa。

ATAC-seq analiz-Done yo rapid nan 40-bp pè-fen sekans li yo te aliyen nan referans sourit mm9 lè l sèvi avèk Bowtie 2.0 nan pè-fen mòd. Koleksyon Samtools yo te itilize sòt, retire PCR kopi (wouj moute), dosye endèks BAM (endèks), ak kalkile estatistik bibliyotèk (drapo, gade Tab Siplemantè 13). DOsye BAM yo te enpresyonan soti nan byen aliyen, pè, ak inik li nan 50M. Pik chromatin yo te analize lè l sèvi avèk MACS252 lojisyèl diferan rejyon diferansyèlman aksesib (DARS) yo te idantifye pa Diffbind v1.16.353 ak paramèt default ak anviwònman yo sèvi ak DESeq2 (cutoff; FDR< 0.01;="" fold="" changes="">1.5). Matris la plen nan konte nòmalize (RPKM54) te rekipere pa pake a DiffBind. Pou yon jenerasyon nan tren gwo, dosye siyal pil (fragman pil pou chak milyon li) nan fòma biyografi yo te konstwi lè l sèvi avèk fonksyon an MACS2 rele fonksyon pik ak -B - SPMR drapo yo. Lè sa a, nòmalize anrichisman pliye (FE) sou tren mouton opinyon yo te pwodwi lè l sèvi avèk fonksyon an bdgmp nanMACS2 ak anviwònman an - M FE. Lè sa a, dosye kabann yo te konvèti nan fòma gwo. Cistanche ka amelyore memwa

IGV55 zouti yo te itilize pou vizyalizasyon nan dosye gwo. ChromHM56 te itilize yo etabli yon modèl eta chromatin soti nan de etid endepandan ki itilize tisi esansyèl anvan ak apre pye chòk21,22 ak detèmine anrichisman pliye sou modèl eta a. Analiz anrichisman motif57,58 ak anotasyon pik te fèt pa zouti HOMER59. Tout kòd yo disponib nan yon dosye lojisyèl siplemantè