PartⅡ: Dereplication-Gide Izolasyon nan nouvo Phenylpropanoid-ranplase Diglycosides soti nan Salsa Cistanche ak Aktivite Inhibitory yo sou NO Pwodiksyon nan Macrophage
Mar 04, 2022
Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com
Yon gwoup 3-methylbutenyl, yon substruktur aglikon, te sijere pa korelasyon COZY nan H-2 ak H-1a ak H-1b ak korelasyon HMBC ant H{{ 4}} ak H-5 ak kabòn olefinik yo, nan kC 120.7 (C{-2) ak 136.4 (C{-3). De moso sik yo te etabli pa analiz spectre NMR ak analiz spectre HPLC nan idrolysat asid la, ak modèl fragman MS. Yo te detèmine konfigirasyon absoli yo se D-glikoz ak L-ramnoz lè l sèvi avèk analiz HPLC nan idroliz asid la [17]. Mosyon sik sa yo te defini kòm yon -glikoz ak yon a-ramnose pa kouple konstan nan pwoton anomerik yo. Spectre 1H-1H COSY la te montre korelasyon sekans soti nan H-13 a H-63 ak nan H-133 a H-633 (Figi 4).
Yon pwoton glikoz ki desann nan kH 4.70 (H-43) sijere yon substituant acil sou glikoz. Soti nan spectre HMBC a, korelasyon ant H-43 ak C{-9333 konfime pozisyon substituent kafeyil la. Korelasyon HMBC ant H-13 ak C-1 (kC 64.5) ak ant H-33 (kH 3.68) ak C-133 (kC 101.2) sijere pozisyon chak substituent. . An konsekans, yo te detèmine estrikti 6 la kòm 3-methylbutenyl-O- - L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-kafeoyl- - D- glikoz-piranozid ak non cistansalside B.
Cistansalside C (12), yon poud amorphe mawon, te detèmine pou gen yon fòmil molekilè C26H38O13 pa (plis)-HR-ESI-QTOF-MS, ki te montre yon pik nan m/z 581.2213 [M plis Na] plis (calcd). . pou C26H38O13Na, 581.2205). Yon ion karakteristik nan m/z 163 sigjere ke yon substituent caffeoyl te egziste nan estrikti a. Iyon fragman nan m/z 325 ak m/z 471 sijere egzistans yon inite rhamnose ak yon inite glikoz.
Konparezon spectre NMR yo nan 12 ak sa yo ki nan 6 te montre ke yo te menm jan an eksepte pou estrikti a glikon. Nan espèk RMN 12 yo, yo te obsève de kabòn parafinik nan kC 38.0 (C-2) ak 24.4 (C-3) olye de de kabòn olefinik nan kC 12{{16. }}.7 (C-2) ak 136.4 (C{-3) nan aglikon nan 6. Gwoup methyl jèminal yo (kH 0.88) nan aglikon nan 12 yo te deplase anlè. parapò ak H-4 ak H-5 (kH 1.71 ak 1.63) nan aglikon 6 (Tablo 2). Aglycone nan 12 te sijere yo dwe yon 3-methyl butyl gwoup, ki te konfime pa spectre 1H ak COSY NMR yo. Pik gwoup 3-methyl butyl yo te obsève nan yon 3.81 (1H, m, H-1a), 3.48 (1H, m, H-1 b), 1.71 (1H, m). , H-3), 1.44 (2H, m, H-2), ak 0.88 (H{-4, 5).
De moyet sik yo te reafime pa analiz HPLC nan idrolysat asid la ak analiz spectre NMR la ak modèl fragman MS. Konfigirasyon absoli sik yo te idantifye kòm D-glikoz ak L-ramnoz lè l sèvi avèk analiz HPLC nan idrolizat asid la [17]. Yo te konfime yon moso -glikoz ak yon mwatye a-ramnoz pa kouple konstan pwoton anomerik yo. Spectre 1H-1H COSY la te montre korelasyon sekans soti nan H-13 rive nan H-53, soti nan H-133 rive nan H-333, ak soti nan H{{11} } pou H-433 (Figi 4).
Pozisyon ranplasan yo te konfime pa mwayen analiz HMBC. Nan spectre HMBC, korelasyon ant H-13 ak C-1 (kC 67.2), ant H-33 (kH 3.68) ak C-133 (kC 101.2) ak ant Yo te detekte H-43 (kH 4.70) ak C-9333 (kC 165.7). Kontinwe, estrikti 12 la te etabli yo dwe 3-methyl butyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glikoz-pyranoside ak yo rele cistansalside C.
Cistansalside D (17), yon poud mawon amorphe, te detèmine gen yon fòmil molekilè nan C31H38O14 pa mòd pozitif segondè-rezolisyon ESI-QTOF-MS, ki te montre yon pik ion adduct nan m/z 657.2147 [M plis Na] plis. (kalkile pou C31H38O14Na, 657,2154). Fragman iyon ki gen ladan yon [M plis H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] plis ion nan m/z 147, yon [M plis H x Aglycone x Rha] plis ion nan m/z 351 ak yon [M plis H x Aglycone] plis ion nan m/z 497 yo te detekte tou. Yon ion karakteristik nan m/z 147 sijere ke yon substituent coumaroyl te prezan nan estrikti li yo. Iyon fragman yo nan m/z 351 ak m/z 497 sijere egzistans yon inite rhamnose ak yon inite glikoz asetil-ranplase.
Cistansalside soticistanche zèb
Spectre 13C-NMR la te revele prezans 31 atòm kabòn. De pwoton anomerik nan kH 4.61 (1H, m, H-13) ak 4.60 (1H, s, H{{1{0}}) yo te obsève nan spectre 1H ak HSQC. . Spectre 1H-NMR a endike prezans yon gwoup methyl nan yon 1.97 (3H, s, acetyl-CH3), yon trans-olefin nan kH 7.55 (1H, d, J=15.9 Hz, H{{ 25}}) ak 6.34 (1H, d, J=15.9 Hz, H{-8333) ak de bag benzèn para-ranplase nan kH 7.53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) ak 6.79 (2H, d, J=6.9 Hz, H{-2333, 6333)/kH 6.98 (2H, d, J {{5 0}}.0 Hz, H{-2, 6) ak 6.65 (2H, d, J=8.0 Hz, H{-3, 5) (Tablo 2) . Soti nan spectre HMBC NMR, korelasyon ki genyen ant yon kabòn kabòn nan kc 165.5 (C-9333) ak H-8333 ak ant H{-2333, 6333, ak C-7333 (kc). 145.4) sijere yon gwoup (E)-koumaroyl. Korelasyon HMBC ant yon pik methyl pwoton ak yon kabònil kabòn nan kc 169.0 konfime prezans nan yon gwoup asetil.
Yo te sigjere yon gwoup 4-idroksifenil ki baze sou korelasyon HMBC ant H-3, 5, ak kabòn aromat kwatènè nan kC 155.6 (C-4) ak 128.6 (C-1) . Yon gwoup etil idroksilatè te konfime pa siyal COSY RMN yo nan kH 2.66 (2H, t, J=6.1 Hz, H{-7), 3.90 (1H, m, H-8a). ) ak 3.54 (1H, m, H-8b). Korelasyon HMBC ant H-7 ak C-1 (kC 128.6) ak C-2, 6 (kC 129.7) sijere yon gwoup 4-hydroxyphenylethyl, kòm yon substruktur aglikon.
De moyet sik, sijere nan modèl MS fragman, yo te rekonfime pa analiz HPLC nan idrolizat asid la ak espèk NMR. D-glikoz ak L-ramnoz yo te elisid lè l sèvi avèk analiz HPLC nan idrolysat asid la [17]. Yo te etabli yon moso -glikoz ak yon mwatye a-ramnoz pa kouple konstan nan pwoton anomerik yo. Spectre 1H-1H COSY la te montre korelasyon sekans soti nan H-13 a H-53 ak soti nan H-133 a H-633 (Figi 4).
Soti nan spectre 1H-NMR, chanjman nan anba tè H-23 (kH 4.69) ak H-43 (kH 4.8{0) sijere pozisyon acil-ranplase sou glikoz. Koneksyon ant glikoz ak de gwoup acil yo te konfime pa korelasyon HMBC ant H-43 (kH 4.80) ak C-9333 ak ant H{-23 ak kabònil kabòn nan yon gwoup asetil (kC 169.0). ). Pozisyon yon aglikon ak ramnose te bay nan korelasyon HMBC ant H-33 (kH 3.95) ak C-1333 ak ant H-8 ak C-13. An konsekans, estrikti 17 la te asiyen kòm 4-hydroxyphenylethyl-2-O-acetyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- koumaroyl- -D-glucopyranoside epi yo rele cistansalside D.
Cistansalside E (18) te izole kòm yon poud mawon amorphe. Fòmil molekilè li yo te detèmine yo dwe C31H38O14 pa done 13C-NMR ak mòd pozitif segondè-rezolisyon ESI-QTOF-MS pik nan m/z 657.2166 [M plis Na] plis (kalkid. pou C31H38O14Na, 657.2154). Anplis de sa, iyon fragman ki gen ladan yon iyon kafeyil nan m/z 163, yon [M plis H x Aglycone x Rha] plis ion nan m / z 367 ak yon [M plis H x Aglycone] ion nan m / z 513 yo te detekte tou. Iyon fragman yo sijere egzistans yon inite rhamnose ak yon inite glikoz asetil-ranplase.
Spectre 1H-NMR sijere prezans de pwoton anomerik nan kH 4.63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) ak 4.60 (1H, s, H-133 ) ak de pwoton glikoz acil-ranplase nan kH 4.71 (1H, dd, J=8.9, 8.2 Hz, H{-23) ak 4.81 (1H, dd, J=9}.7 , 9.5 Hz, H-43). Spectres 1H ak HMBC sijere egzistans yon gwoup asetil nan kH 1.94 (3H, s, acetyl-CH3), yon (E)-kafeoyl moety nan kH 7.48 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7333), 7.02 (1H, d, J=1.6 Hz, H{-2333), 6.98 (1H, dd, J=8.1, 1.6 Hz, H-6333), 6.76 (1H,d, J=8.1 Hz, H{-5333) ak 6.21 (1H, d, J=15.9 Hz, H{ {67}}) ak yon bag benzèn mono-ranplase nan kH 7.29 (2H, m, H-3, 5), 7.21 (2H, m, H-2, 6) ak 7.20 (1H, m, H-4) (Tablo 2). Yon gwoup fenilmetil, yon substruktur aglikon, te sijere pa korelasyon HMBC ant H-7 (2H, kH 2.80, m) ak C-1 (kC 138.8) ak ant H-7 ak C. -2, 6 (kC 128.9) ak siyal COSY RMN H-7 ak H-8a (1H, kH 3.99, m) ak H-8b (1H, kH 3.63, m).
De moyet sik yo te reafime pa analiz HPLC nan idrolysat asid la ak analiz espèk NMR. Konfigirasyon absoli sik yo te elisid lè l sèvi avèk analiz HPLC nan idrolysat asid la, ki te konfime yo dwe D-glikoz ak L-ramnoz [17]. Yo te etabli yon moso -glikoz ak yon mwatye -rhamnose pa kouple konstan pwoton anomerik yo. Spectre 1H-1H COSY la te montre korelasyon sekans soti nan H-13 rive nan H-53, soti nan H-133 rive nan H-233, ak soti nan H{{11} } pou H-333 (Figi 4).
Soti nan spectre HMBC, korelasyon ant H{{0}} ak C-8 (kC 69.4), ant H-23 ak kabònil kabòn nan yon gwoup asetil (kC 169.1), ant H-33 (kH 3.95) ak C-133 (kC 102.0) ak ant H{-43 (kH 4.81) ak C-9333 (kC 165.6) konfime pozisyon substituants nan estrikti a. Se poutèt sa, yo te detèmine estrikti 18 la se phenylethyl-2-O-acetyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranoside ak yo te rele cistansalside E.
Pifò nan substituants trans-cinnamoyl yo te izomerize pou cis-isoform nan vitro. Limyè yo te rapòte konvèti dérivés asid trans-cinamik nan cis-izoforms [18,19]. Yo te obsève ekilib konvèsyon trans-cis substituents cinnamoyl yo pou kenbe apeprè 70 pousan izolat yo nan trans-isoform la. Pou pwoton olefin fòm cis, pik nan apeprè 6.90 ppm (d, J=12 ~ 13 Hz, H-7333) ak 5.80 ppm (d, J=12 ~ 13 Hz, H-8333) te ka bay nan spectre 1H-NMR, tandiske pik nan apeprè 7.55 ppm (d, J=15.8 Hz, H-7333) ak 6.40 ppm (d, J=15). {28}}.8 Hz, H-8333) yo te obsève pou transfòme [20]. Nan spectre 1H-NMR nan melanj trans-cis, pik pou de pwoton olefinik (H-7333 ak H{-8333) yo te obsève nan rapò 7:3 (trans:cis). 13C-NMR pik nan fòm cis la te sanble ak sa yo ki nan transfòme a.
Engredyan efikas soti nan cistanche: acteosides
Tout izolat yo te teste pou efè inhibition yo sou pwodiksyon LPS-pwovoke NO nan RAW
Tout izolat yo te teste pou efè inhibition yo sou pwodiksyon LPS-pwovoke NO nan selil RAW 264.7. Dexamethasone te itilize kòm yon kontwòl pozitif ak IC5 li yo 0 te 7.0 uM. Nan konpoze tès yo, konpoze 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC{50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC{50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) ak 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) te montre aktivite inhibition modere sou NO synthase endivizib, pandan ke lòt konpoze yo te inaktif nan tès sa a (IC50). valè > 100 uM). Pou verifye si konpoze sa yo te gen cytotoxicity, yo te mezire viabilite selil yo ak tès MTT. Kòm yon rezilta, okenn nan yo pa montre sitotoksisite enpòtan (Figi Siplemantè S 6-1). Yo te chwazi kat konpoze sa yo pou evalye aktivite inhibitor yo kont chemen NF-λB nan selil RAW 264.7 ki ankouraje LPS yo. Stimulasyon nan selil RAW 264.7 ak LPS pwovoke fosforilasyon I入B ak NF-入B (p65) apre 0.5 èdtan nan enkubasyon. Fosforilasyon NF-入 B (p65) te siyifikativman redwi pa pretretman ak konpoze 11, 13 ak 18 jan yo montre nan analiz Western blot (Figi 5). Se poutèt sa, konpoze 11, 13 ak 18 ta ka egzèse efè anti-enflamatwa atravè anpèchman nan NF-入B nan makrofaj.
Figi 5.Efè kat konpoze sou fosforilasyon I入B ak NF-入B (p65) nan selil RAW 264.7 ki ankouraje LPS. (A) blots lwès yo te fèt nan LPS ak echantiyon trete RAW 264.7 selil; (B, C) Siyal imunoblot yo te kwantifye lè l sèvi avèk lojisyèl densitometri Molecular Analyst/PC (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Yo rapòte analiz densitometrik izoform fosforil. NF-入 B nan selil RAW 264.7 te nòmalize nan kontni an nan -aktin.
3. Materyèl ak Metòd
3.1. Eksperyans Jeneral Pwosedi
Wotasyon optik yo te mezire ak yon polarimèt dijital Jasco P-2000 (Jasco, Tokyo, Japon). Spectre UV yo te anrejistre sou yon espektwomèt Chirascan plis sikilè Dichroism (Chirascan, APL, UK). Yo te anrejistre espèk IR lè l sèvi avèk espektrofotomèt Jasco FT/IR-4200. Gwo rezolisyon electrospray ionizasyon quadrupole-time-of-flight spectrometri mas (HR-ESI-qTOF-MS) te fèt sou yon Agilent 6530 Precision-Mass Q-TOF LC/MS ekipe ak seri Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA), ak kolòn yo te itilize se te yon kolòn Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4.6 mm, 5 um). Lojisyèl MassHunter Workstation te itilize pou akizisyon done.
1D (1H ak 13C) ak 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) spectre RMN yo te jwenn ak yon Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japon), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 ak Bruker AVANCE 800 HD espektwomèt makonnen ak yon kriyosond (Bruker, Ettlingen, Almay). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Nan Cistanche Andover, MA, USA) te itilize kòm sòlvan NMR ak pik referans (kH 2.50 ak kC 39.5). Kwomatografi kolòn (CC) te fèt lè l sèvi avèk Sephadex LH -20 (25-100 um; Pharmacia, Upsala, Syèd) oswa Kieselgel 60 jèl silica (40-63 um, 230-400 may, Atizay 9385; Merck, Darmstadt). , Almay). Chromatografi kouch mens (TLC) te fèt sou plak pre-kouvwi Kieselgel 60 jèl silica F254 (Ati. 5715; Merck). Tach sou TLC yo te detekte lè l sèvi avèk yon lanp UV nan 254 nm ak 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Frans). Kwomatografi likid presyon mwayen (MPLC) te fèt sou yon kolòn RediSep 120 g silica (Isco, Lincoln, NE, USA) ak Kiesegel 60 jèl silica (40-63 um, 230-400 may, Art. 9385; Merck) lè l sèvi avèk yon konpayon Combiflash (Isco). Sistèm segondè-presyon likid kromatografi (HPLC) la se te yon Gilson HPLC ekipe ak yon ponp Gilson 321 ak UV.VIS 151 detektè (Gilson, Middleton, WI, USA), lè l sèvi avèk kolòn ODS semi-preparatif (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Almay; Inno C18 kolòn 120 Å, id 250: 10 milimèt, 5 um, Young Jin Biochrom co, Ltd., Seongnam, Kore di). Sistèm RP-HPLC analitik la se te yon sistèm alyans Waters 2695 ak detektè a996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, USA), epi kolòn yo te itilize se te yon kolòn Hypersil™ BDS C18 (130 Å, id 150: 4.6). mm, 5 um, Thermo Scientific™). Asid fòmik te achte nan men Daejung Chemicals & Metals Co, Ltd (Seoul, Kore di). Solvang klas HPLC yo te achte nan Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Kore di). H2SO4, Na2CO3, ak solvang premye klas pou fè ekstraksyon, fraksyon, ak izolasyon yo te achte nan men Daejung Chemical & Metals Co Ltd (Seoul, Kore di). L- ak D-cysteine methyl ester idroklorid ak o-tolylisothiocyanate yo te achte nan Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japon).
3.2. Plant Materyèl
Plant yo antye nanCistanche salsa, ki te kolekte nan Shinjang Uyghur la, yo te enpòte atravè Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Kore di). Se Prof. Dr Jehyun Lee (Dongguk University, Seoul, Kore) ki te idantifye yo. Yo te depoze echantiyon bon an (SNUPH2016-03) nan Èrbyòm nan Jaden Plant Medsin, College of Pharmacy, Seoul National University.
3.3. Ekstraksyon ak An karantèn
Plant yo cheche antye nanCistanche salsa(5.7 kg) yo te koupe ak ekstrè twa fwa ak MeOH (2 0 L) nan tanperati chanm ak sonication pou 99 min. Apre yo fin retire sòlvan an nan vacuo, Ekstrè brit la (1.35 kg) te sispann nan H2O (5 L), Lè sa a, patisyon ak EtOAc (5 L). Te EtOAc rezidi a (55.3 g) separe an 16 fraksyon (E01-16) sou kwomatografi jèl silica eluye ak CHCl3/MeOH (50:1-0:1, sistèm etap-gradyan).
E08 (611.7 mg) te sibi jèl silica medyòm-presyon likid kromatografi (25 g) ak eluye ak CHCl3/MeOH (18:1–0:1, sistèm etap-gradyan) ak bay 11 fraksyon (E08a-k). Soti nan E08g, konpoze 13 (0.7 mg) ak 18 (0.6 mg) yo te pirifye lè l sèvi avèk yon kolòn Luna 5 um HPLC ak elisyon izokratik ak 28 pousan aq. MeCN. Pirifikasyon HPLC (Hypersil GOLD, 25 pousan aq. MeCN) nan E08h (138.5 mg) founi konpoze 7 (10.6 mg), 8 (17.2 mg), 14 (13.4 mg) ak 17 (4.9 mg).
E09 (1.15 g) te pirifye plis sou yon kolòn silica-MPLC (2{0 g) eluye ak CHCl3/MeOH (10:1-0:1, etap- sistèm gradyan) pou bay 11 soufraksyon (E09a-k). E09e (398.7 mg) te sibi Sephadex LH -20 (MeOH) epi li bay uit subfraksyon (E09e1-8). Apre sa, E09e6 te pirifye lè l sèvi avèk yon kolòn Hypersil GOLD HPLC (22 pousan aq. MeCN) pou peye konpoze 11 (0.4 mg). Soti nan E09e7, konpoze 5 (0.6 mg) te pirifye pa eliksyon izokratik nan yon kolòn Luna 5 um HPLC ak 40 pousan aq. MeOH.
E10 (1.20 g) te separe an nèf fraksyon (E10ai) sou kolòn Sephadex LH-20 ki eliye ak MeOH. Soti nan E10g (147.5 mg), konpoze 4 (13.4 mg), 9 (8.0 mg) ak 15 (5.0 mg) yo te izole pa separasyon HPLC (Inno, 23 pousan aq. MeCN). Fraksyon E10h (470.0 mg) te pirifye sou yon kolòn Hypersil GOLD pa elisyon izokratik (40 pousan aq. MeOH) pou bay konpoze 1 (3.8 mg), 10 (42.1 mg) ak 16 (3.0 mg).
E11 (2.96 g) te sibi Sephadex LH-20 elution ak MeOH bay nèf fraksyon (E11a-i). E11e te separe pa katouch Sep-Pak C18 ki eliye pa etap ak 10 pousan, 20 pousan, 30 pousan, 50 pousan ak 100 pousan aq. MeOH bay sèt fraksyon (E11e1-7), ki te swiv pa Luna 5 um HPLC (28 pousan aq. MeCN) bay konpoze 3 (3.4 mg), 6 (1.4 mg) ak 12 (1.2 mg).
E12 (19.0 g) te sibi MPLC silica (120 g) lè l sèvi avèk yon sistèm etap-gradyan CHCl3/MeOH pou bay sis fraksyon (18:1–0:1). , E12a-f). E12f te chromatographed sou yon kolòn Sephadex LH-20 (MeOH), ki bay sèt fraksyon (E12f1-7). Pirifikasyon HPLC (Hypersil GOLD, 25 pousan aq. MeCN) nan konpoze E12f7 furnished 2 (3.3 mg). Tout solvang yo itilize pou HPLC yo te 0.05 pousan tanpon asid fòmik. Pousantaj koule komen pou HPLC ak MPLC kwomatografi te 3 ak 40 mL / min, respektivman.
3.4.Karakterizasyon
Cistansalside A (5): mawon amorphe poud; [ |20 x33.7 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 332 (3.18); IR (pwòp) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; Done 1H-NMR (800 MHz) ak 13C-NMR (200 MHz), gade Tablo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plis Na] plis 645,2146 (kalki pou C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalside B (6): mawon amorphe poud; [ |20 x72.9 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 333 (3.32); IR (pwòp) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; Done 1H-NMR (500 MHz) ak 13C-NMR (125 MHz), gade Tablo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plis Na] plis 579,2054 (kalki pou C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalside C (12): mawon amorphe poud; [ |20 x61.6 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 337 (3.25); IR (pwòp) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; Done 1H-NMR (800 MHz) ak 13C-NMR (200 MHz), gade Tablo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plis Na] plis 581.2213 (kalki pou C26H38O13Na, 581.2205).
Cistansalside D (17): mawon amorphe poud; [ |20 x51.1 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 221 (3.53), 315 (3.52); IR (pwòp) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; Done 1H-NMR (400 MHz) ak 13C-NMR (75 MHz), gade Tablo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plis Na] plis 657,2147 (kalki pou C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalside E (18): mawon amorphe poud; [ |20 x59.2 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 336 (3.22); IR (pwòp) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; Done 1H-NMR (800 MHz) ak 13C-NMR (200 MHz), gade Tablo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plis Na] plis 657.2166 (kalki pou C31H38O14Na, 657.2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analiz
Yo te fè analiz kwomatografi-mass espektometri sou yon sistèm LC seri Infinity Agilent 1260 (Agilent Technologies, Inc., USA). Kolòn analyse a se te yon kolòn SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}} : 4.6 mm, 5 um, Jasco, Japon). Faz mobil la konsiste de 0.1 pousan (v/v) asid fòmik nan MeCN (A) ak dlo (B) lè l sèvi avèk yon elisyon gradyan nan 0-35 min (23 pousan A), 35-45 min ( 23-28 pousan A), 45-75 min (28 pousan A) ak 75-80 min (90 pousan A). Pousantaj koule a te kenbe nan 0.3 ml / min. Absorbans la te mezire nan 320 nm. Kondisyon yo nan sous ESI a te jan sa a: siye gaz (N2) vitès koule, 10 L / min; tanperati gaz siye, 350 degre; nebilizè, 30 psig; pousantaj koule gaz djenn, 12.0 L/min; tanperati gaz djenn, 350 degre; kapilè, 4000 V; ekreme, 60 V; oktapol RF, 750 V; vòltaj fragmantè, 180 V; mòd pozitif. Sistèm nan te opere anba lojisyèl Masshunter estasyon travay. Ranje mas la te fikse nan m/z 50-1000.
3.6.Asid Idwoliz
Konpoze yo te idrolize lè l sèvi avèk 1 N H2SO4 (100 uL) chofe ak yon beny dlo nan 90 degre pou 2 èdtan, apresa netralize ak solisyon akeuz satire Na2CO3. Apre yo fin cheche solisyon yo anba yon kouran N2, pwodwi yo ak sik estanda (D-Glc, L-Glc, L-Rha) yo te fonn nan piridin (100 uL) ki gen L-cysteine methyl ester hydrochloride (0.5 mg). Yon echantiyon L-rhamnose te fonn nan piridin (100 uL) ki gen D-cysteine methyl ester idroklorid (0.5 mg). Apre sa, yo te chofe a 60 degre pou 1 èdtan. Solisyon yo te trete ak 1 uL (1.11 mg) nan o-tolylisothiocyanate, ki te chofe ankò nan 60 degre pou 1 èdtan. Chak melanj final yo te analize dirèkteman pa analyse RP-HPLC (Hypersil™ BDS C18 kolòn, 17 pousan aq. MeCN, 0.8 mL/min, 40 min, 35 degre). TR nan pik la nan 21.9 ak 40.4 min kowenside ak sa yo ki nan derive thiocarbamoyl thiazolidine nan D-glikoz ak L-ramnoz, respektivman.
3.7. Selil Kilti
Murine macrophages, RAW 264.7, yo te jwenn nan Enstiti Kore di Rechèch nan Biosyans ak Biotechnologie (Daejeon, Kore di), ak grandi nan mwayen RPMI ki gen 10 pousan fetis serom bovin ak 100 U / mL silfat penisilin / streptomycin. Selil yo te enkube nan yon atmosfè imidite 5 pousan CO2 a 37 degre.
3.8.Dwòg ak pwodwi chimik yo
RPMI, penisilin ak streptomycin te achte nan men HyClone (Logan, UT, USA). Albumin serik bovin ak LPS te achte nan men Sigma (St. Louis, MO, USA).
3.9.Mezi nan NO Pwodiksyon
Yo te mezire konsantrasyon nitrit nan mwayen kilti a kòm yon endikatè pwodiksyon NO dapre reyaksyon Griess la. Selil yo te simen nan 2: 105 selil/pou nan 96-plak kilti byen yo. Apre pre-enkubasyon nan selil RAW 264.7 yo pou 18 èdtan, selil yo te pretrete ak konpoze (50 uM, 10 uM, 5 uM, oswa 1 uM) ak ankouraje ak LPS (500 ng/mL) pou 24. h. Konpoze tès yo fonn nan DMSO. Selil yo te trete tou ak 0.05 pousan DMSO kòm kontwòl machin. Selil RAW 264.7 (2: 105 selil/pi) yo te kiltive nan 96-plak byen lè l sèvi avèk RPMI san wouj fenol ak pretrete ak echantiyon pou 0.5 èdtan. Pwodiksyon selilè NO te pwovoke pa adisyon a nan 500 ng/mL konsantrasyon final LPS ak yon enkubasyon 24 h. Apre enkubasyon, yo te melanje 100 uL medya kondisyone ak menm volim reyaktif Griess ak enkubasyon pou 15 min. Yo te mezire absorbans melanj lan nan 540 nm ak yon lektè microplate ELISA (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). Valè yo jwenn yo te konpare ak sa yo ki nan konsantrasyon estanda nan nitrite sodyòm ki fonn nan RPMI, ak konsantrasyon yo nan nitrite nan medya yo kondisyone nan echantiyon-trete selil yo te kalkile.
3.10.3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,{5-diphenyltetrazolym Bromur (MTT) Test for Cell Viaability
Selil yo te simen nan {{0}}plak byen nan yon dansite 5: 104 selil/pi epi yo te enkube ak medya san serom nan prezans echantiyon yo. Konpoze tès yo fonn nan DMSO. Selil yo te trete tou ak 0.05 pousan DMSO kòm kontwòl machin. Apre enkubasyon pou 24 èdtan, yo te ajoute 10 uL MTT (5 mg / mL nan saline) epi yo te kontinye enkubasyon pou yon lòt 4 èdtan. Mitokondrial succinate dehydrogenase nan selil vivan konvèti MTT nan kristal formazan vizib pandan enkubasyon. Lè sa a, kristal formazan yo te solubilize nan dimethyl sulfoxide epi yo te mezire absorpsyon an nan 540 nm lè l sèvi avèk yon lektè mikwoplak (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Relatif viabilite selil yo te kalkile konpare ak absòbe gwoup kontwòl la ki pa trete. Tout eksperyans yo te fèt an triple.
3.11.Immunoblot analiz
Ekspresyon pwoteyin yo te evalye pa Western blotting dapre pwosedi estanda. Yon ti tan, selil RAW264.7 yo te kiltive nan asyèt kilti 6{{20}} mm (2: 1{06/mL), ki te swiv pa pretretman 5{{0 uM nan konpoze. . Selil yo te lave de fwa nan glas frèt PBS (pH 7.4), granules selil yo te resuspende nan tanpon lysis sou glas pou 15 minit, epi debri selil la te retire nan santrifujasyon. Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine lè l sèvi avèk reyaktif tès pwoteyin Bio-Rad dapre enstriksyon manifakti a. Pwoteyin (20-30 ug) te melanje 1:1 ak 2: echantiyon tanpon (20 pousan gliserin, 4 pousan SDS, 10 pousan 2- ME, 0.05 pousan bromophenol ble, ak 1.25 M Tris [pH 6.8]), chaje sou 8 oswa 15 pousan jèl SDS-PAGE, epi kouri nan 150 V pou 90 min. Pwoteyin selilè yo te transfere sou manbràn Immunoblot polyvinylidene difliyorid (Bio-Rad) lè l sèvi avèk yon sistèm transfè semi-sèk Bio-Rad dapre enstriksyon manifakti a. Lè sa a, manbràn yo te enkube lannwit lan ak respektif p-NF-入B, NF-入B, pI入B ak -actin antikò prensipal yo (Abcam, Cambridge, UK) nan Tris-tampon saline ki gen 5 pousan lèt ekreme ak 0.1 pousan Tween. 20. Nan jou ki vin apre a, yo te lave tach yo twa fwa ak saline tampon Tris (0.1 pousan Tween 20) epi yo te enkube pou 1 èdtan ak yon antikò segondè anti-IgG ki konjige HRP (dilye 1:2000-1). :20,000). Blots yo te lave ankò twa fwa ak Tris-tampon saline (0.1 pousan Tween 20), ak gwoup imunoreaktif yo te devlope lè l sèvi avèk chemiluminescent substra ECL Plus la (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
3.12.Estatistik analiz
Done eksperimantal yo prezante kòm mwayen o SEM. Nivo siyifikasyon estatistik yo te detèmine pa analiz divèjans (ANOVA) ki te swiv pa tès t Dunnett pou plizyè konparezon.p Yo te konsidere valè ki pi piti pase 0.05.
Cistanche salsa ekstrè
4. Konklizyon
Nan etid sa a, nou izole ak elisid estrikti senk nouvo phenylpropanoid-ranplase glikozid, yo te rele cistansalside AE (5, 6, 12, 17, ak 18), anplis izole ak idantifye 13 konpoze li te ye, lè l sèvi avèk yon estrateji dereplication. Konpoze yo konnen yo te detèmine lipedozid AI (1) [21], 23-acetylatteoside (2) [22], isocistanoside C (3) [15], osmanthuside B (4) [21], epimeridinoside A ( 7) [15], cistanoside D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubuloside E (10) [16], cistanoside M (11) [15], isomartynoside (13) [24], salsaside C (14) [6], jionoside C (15) [25] ak salsaside F (16) [6]. Estrikti yo te etabli atravè analiz done espektroskopik vaste ak konparezon ak done rapòte nan literati a. Yo te konfime ke estrikti glikozid ki ranplase fenilpropanoid ki te prevwa yo te kòrèkteman matche ak estrikti reyèl yo.
Benefis nan ekstrè salsa Cistanche
Referans
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Suppression nan SOS-Inducing Aktivite nan Trp-P-1 pa asid gra soti nan salsa Cistanche nan Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 Tès la umu. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; Yon, H.-J. Efè anti-proliferasyon nan salsa Cistanches sou Pwogresyon nan ipèrplazi Benign Prostatic. Kapab. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Solèy, S. Diskriminasyon rapid nan Herba Cistanches pa makro-anprent enfrawouj milti-etap konbine avèk modèl modle endepandan klas analoji (SIMCA). Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Différenciation Herba Cistanches pa anprent ak segondè-pèfòmans likid chromatographie-dyòd etalaj deteksyon-mas spectrometri. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Etid sou konstitiyan yo nan Cistanchis Herba. V. Izolasyon ak estrikti de nouvo glikozid Phenylpropanoid, Cistanosides E ak F. Chem. Pharm. Toro. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6.Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Nouvo glikozid ki soti nan salsa Cistanche. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Etid konpozisyon nan konpoze fenolik nan salsa Cistanche (CA Mey) G. Beck, ap grandi nan Repiblik Kazakhstan. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Amelyore akimilasyon nan glikozid phenylethanoid pa manje précurseur nan kilti sispansyon nan salsa Cistanche. Byochim. Eng. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, H. Cistanche salsa ekstrè aji menm jan ak pwoteyin-liye
polisakarid-K (PSK) sou plizyè kalite liy selilè. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Glikozid phenylethanoid soti nan salsa Cistanches anpeche apoptoz pwovoke pa 1-methyl-4- iyon fenilpiridinyòm nan newòn. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11.Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Nouvo Konsèp, Apwòch Eksperimantal, ak Estrateji Dereplication pou Dekouvèt Nouvo Phytoestrogens soti nan Sous Natirèl. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Dereplication-gide izòlman depsides theaflavins ST ak lecanora DF soti nan chanpiyon andofitik Setophoma sp. Phytochemistry 2015, 111, 154-162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Konpoze antiproliferatif ak antiplasmodial ki soti nan espès Streptomyces chwazi. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14.Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Dereplication-gide izòlman nan saponin triterpenoid nouvo epatoprotective soti nan Celosiae Semen pa segondè-pèfòmans likid chromatografi makonnen ak elektwospray ionizasyon tandem quadrupole-time-of-flight spectrometri mas. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15.Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. Estrateji ki baze sou LTQ-Orbitrap pou medikaman tradisyonèl Chinwa vize dekouvèt klas, idantifikasyon ak rechèch omik li yo: Yon etid ka sou glikozid fenilethanoid nan twa espès diferan Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Konstitiyan yo nan Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Izolasyon ak estrikti yon nouvo glikozid Phenylethanoid ak yon nouvo glikozid Neolignan. Chem. Pharm. Toro. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Diskriminasyon fasil nan enantiomère aldoz pa faz ranvèse HPLCistancheChem. Pharm. Toro. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Etid asid cis-cinnamic nan Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Byochim. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Trans-Cis-Ekilib nan asid idroksicinamik pandan iradyasyon nan solisyon akeuz nan pH diferan. Phytochemistry 1967, 6, 755-758. [CrossRef]
