Pwopriyete foto-pwotektif ak anti-melanogenic nan diferan ekstrè Kadsura Coccinea

Kontakte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Radyasyon iltravyolèt solè (UV), karakterize pa UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm), ak UVC (100-280 nm), se faktè ki pi enpòtan nan anviwònman an ki lakòz kansè po ak foto-aje ki soti nan sitotoksisite, jenotoksisite. , ak fototoksisite. Espesyalman, radyasyon UVA ak UVB genyen plis pase 95 pousan ak 3 pousan nan iradyasyon UV chak jou, respektivman [8]. UVA ak UVB iradyasyon ka pwovoke espès oksijèn reyaktif (ROS) endirèkteman oswa dirèkteman pa penetrasyon epidèm ak / oswa kouch po a nan po a, ki mennen nan domaj oksidatif ak lanmò selil. Nan dènye deseni ki sot pase yo, radyasyon UV te vin tounen yon enkyetid grav sante po epi li toujou gaye danjerezman atravè lemond [9-11]. UV iradyasyon se yon estimilan dirèk ak konsistan nan keratinosit, ki konte pou apeprè 95 pousan nan mas selil po epidèm. Keratinosit yo aji kòm premye baryè kont danje mikwòb, chimik ak fizik, epi ede defann kont radyasyon UVA ak UVB. Lè keratinosit yo ekspoze a UVA ak UVB, ROS entraselilè yo pwodwi, kidonk deklanche apoptoz [12-14].

Melanosit yo responsab pou pwodiksyon ak kantite pigman melanin, ki se jwè enpòtan nan defans byolojik epidèm po a; dysregulation yo ka lakòz ipèpigmantasyon oswa maladi ipopigmantasyon [15,16]. Melanosit yo distribiye nan stratum basal nan epidèm po a, ki afekte tou pa ekspoze limyè solèy la, espès oksijèn reyaktif (ROS), ak òmòn -melanocyte-stimulating (-MSH) [17,18]. Tirozinaz, yon manm nan fanmi pwoteyin tip-3 kwiv, se yon metaloprotein evolisyonèman konsève ki jwe yon wòl enpòtan nan melanogenesis ak nan aktivite monofenol monooksijenaz, katekolaz ak difenol. Regilasyon tirozinaz, pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz-1 (TRP-1), ak pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz-2 (TRP{-2) gen efè katalitik diferan. TRP-1 se yon 5,6-dihydroxyindole-2-oksidaz asid carboxylic, ak TRP-2 se yon DOPAchrome tautomerase [19,20]. Anplis de sa, faktè transkripsyon ki gen rapò ak myophthalmosis (MITF) ak cAMP-responsive element-binding protein (CREB) se faktè transkripsyon ki prensipalman kontwole melanogenesis ak kode enfòmasyon sou mòd ak entansite eksitasyon [17,21]. Plizyè etid yo te deklare ke MITF ak CREB chemen kontwole melanogenesis. MITF se yon faktè kle nan transkripsyon anzim ki gen rapò ak melanogenesis ak regilatè santral la nan melanogenesis. -MSH mennen nan ekspresyon MITF atravè yon mekanis siyal ki enplike pwoteyin obligatwa ki gen rapò ak cAMP (CREB). Lè sa a, MITF antre nan nwayo a ak sekans M-bwat la (AGTCATGTGCT) pou ankouraje transkripsyon jèn melanojèn espesifik ak anzim. Li konnen tou ke CREB fosforilate ankouraje pa -MSH, ki mare nan eleman konsansis CRE nan pwomotè Mitf la pou kontwole transkripsyon Mitf [21-24].

Nan etid sa a, ekstrè nan rasin KC (KCR), tij (KCS), fèy (KCL), ak fwi (KCF) yo te konplètman konpare ak evalyasyon miltip nan pwopriyete fotopwotektif ak anti-melanogenic yo te fèt.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Preparasyon Ekstrè KC

Yon plant twazan KC 15 te grandi nan yon po plastik 9 L nan kanpis Miryang nan Inivèsite Nasyonal Pusan. KC te idantifye pa Pwofesè Young Whan Choi, otè etid sa a. Echantiyon sa yo te depoze kòm echantiyon bon (nimewo aksesyon KC-PDRL-1) nan èrbyòm Depatman Biosyans ortikultur, Kolèj Resous Natirèl ak Syans Lavi, Pusan ​​National University. Yo te wouze plant yo ase lè l sèvi avèk yon solisyon eleman nitritif konplè ki gen yon nivo konduktivite 1.0 mS·cm−1 epi ki gen eleman sa yo (nan me·L−1): NO3-N, 16; NH4-N, 1.34; P, 4; K, 8; Ca, 8; ak S, 4. KC ròb nan pò a te rekòlte an Desanm 2020 nan klasifye rasin, tij, fèy, ak fwi (Figi 1A). Echantiyon rekòlte yo te imedyatman lyofilize nan yon seche friz epi estoke nan sache vinil nan 20 ◦C jiskaske analiz. Rasin yo sèk, tij, fèy, ak fwi nan KC (20 g) yo te piye nan yon poud amann epi yo te ekstrè nan tanperati chanm ak alkòl etilik. Yon ti tan, filtraj ak evaporasyon nan ekstrè EtOH nan KC yo te fèt anba presyon redwi nan 45 ◦C ki te swiv pa lyofilizasyon. Finalman, ekstrè solid la (50 mg / mL) te fonn nan dimethyl sulfoxide (DMSO) pou plis eksperyans.

sistanchherba epimedium sagittatumekstrè

2.2. Total Polyphenolic ak Flavonoid Sa ki nan ekstrè KC

Jan sa te dekri deja [25], total polifenol ak flavonoid nan rasin KC, tij, fèy, ak ekstrè fwi yo te mezire lè l sèvi avèk Folin-Ciocalteu (total polifenol) ak klori aliminyòm (flavonoid) metòd kolorimetrik. Yo te mezire absorpsyon nan 700 nm (total polifenol) lè l sèvi avèk Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK) ak nan 510 nm (flavonoid) lè l sèvi avèk VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) .

Koub estanda yo te konstwi lè l sèvi avèk asid galik (total polifenol) ak quercetin (flavonoid) kòm estanda yo, ak rezilta yo te eksprime kòm ekivalan asid galik pou chak gram (GAE / g) nan rasin KC, tij, fèy, ak ekstrè fwi ak ekivalan quercetin. pou chak gram (QE/g) nan rasin KC, tij, fèy, ak ekstrè fwi, respektivman.

2.3. DPPH ak ABTS tès

Aktivite DPPH ak ABTS radikal scavenging nan KC rasin, tij, fèy, ak ekstrè fwi ({{0}}.5 mg/mL) yo te mezire dapre yon metòd ki dekri deja [25] ak modifikasyon ti tay. Rasin KC, tij, fèy, ak ekstrè fwi (0.5 mg/mL) yo te melanje ak solisyon DPPH (60 µM) nan mikroplak. Apre echantiyon yo te souke kouray, yo te kenbe yo nan fè nwa a 25 ◦C pou 0.5 èdtan. Yo te prepare solisyon stock nan 7 mM ABTS ak 2.6 persulfate potasyòm nan dlo distile nan tanperati chanm nan fè nwa a pou 18 èdtan. KC rasin, tij, fèy, ak fwi ekstrè (0.5 mg / mL) yo te melanje ak solisyon an k ap travay ak Lè sa a, pèmèt yo kanpe pou 0.5 èdtan nan tanperati chanm nan fè nwa a. Absorbans melanj echantiyon yo te kontwole nan 510 nm (DPPH) oswa 734 nm (ABTS).

2.4. Kilti Selil

Keratinocytes adhered (HaCaT) ak melanosit adhered (B16F10) yo te vaksinen nan solisyon kilti DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) ki gen 10 pousan FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) ak 1 pousan penisilin/streptomycin (Invitrogen). Corporation, Carlsbad, CA, USA) ak kiltive nan 37 ◦C ak 5 pousan CO2. Yo te obsève kwasans selil HaCaT ak B16F10 yo regilyèman, epi yo te chanje mwayen an chak de a twa jou. Selil ki soti nan faz kwasans logaritmik yo te itilize pou eksperyans ki vin apre yo.

2.5. UVA ak UVB iradyasyon

Keratinosit yo te ekspoze a iradyasyon UVA oswa UVB (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Almay) ak tib 5 8 W ki emèt pi fò nan enèji yo nan yon pik emisyon nan swa 365 nm ( UVA) oswa 312 nm (UVB). Dòz iradyasyon UVA yo te 20 J / cm2 ak dòz iradyasyon UVB yo te 50 mJ / cm2.

2.6. Mezi Viabilite Selil ak Sitotoksisite atravè CCK-8 ak Analiz LDH

Pou analiz viabilite selil yo, yo te ajoute solisyon Twous Konte selil-8 (CCK{-8) ki soti nan Twous Test CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) nan keratinosit HaCaT. ak sispansyon selil melanom B16F10 dapre enstriksyon manifakti a epi enkubasyon nan 37 ◦C pou 4 èdtan. Yon ti tan, selil 2 104 yo te simen nan chak pi nan yon plak 24-pi epi yo te enkube ak 5 pousan CO a 37 ◦C pou 24 èdtan. Yon ti tan, selil 2 104 yo te simen nan chak pi nan yon plak 24-po epi yo te enkube ak 5 pousan CO a 37 ◦C pou 24 èdtan. Apre 24 èdtan nan enkubasyon, yo te ajoute reyaktif CCK-8 nan chak pi, epi selil yo te plis enkubasyon pou 4 èdtan. Yo te itilize yon twous deteksyon cytotoxicity (Roche Applied Science, Swis) pou detèmine laktat dehydrogenase ekstraselilè (LDH) nan mwayen kilti keratinosit HaCaT. Absorbans te analize nan 450 nm (CCK-8) ak 490 nm (LDH) lè l sèvi avèk yon VICTOR Multilabel Plate Reader.

2.7. Evalyasyon Pwodiksyon Entraselilè ROS nan Keratinocytes

Nivo entraselilè ROS yo te analize lè l sèvi avèk {{0}}(ak-6)-chloromethyl-2′,7′-dichloride-hydrofluorescein diacetate asetil ester (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Etazini). Tout pwosedi yo te fèt dapre enstriksyon manifakti a. An brèf, apre yo fin KC lòt ekstrè pasyèl (0.5 mg/mL) tretman, Keratinocytes (HaCaT) yo te lave ak saline tampon fosfat (PBS) ak enkubasyon ak CM-H2DCFDA (5 µM) pou 0.5 èdtan nan. fè nwa a. Apre sa, jenerasyon ROS entraselilè yo te vizyalize lè l sèvi avèk mikwoskòp fliyoresan Carl Zeiss; entansite fliyoresan yo te mezire baze sou yon lank fluorescent (CM-H2DCFDA) lè l sèvi avèk yon sitomèt koule (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA).

2.8. Analiz de apoptoz

Apre ekspoze ak tretman, keratinosit HaCaT yo te trypsinize ak santrifuje. Imedyatman, yo te evalye apoptoz nan selil yo jwenn lè l sèvi avèk fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V/Dead CellApoptosis Twous (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, USA) dapre enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, keratinocytes yo te rense de fwa ak PBS, ak keratinocytes nan tanpon an obligatwa annexin yo te jwenn ak melanje ak FITC / Annexin V (konpozan A) ak propidium yodide (PI) solisyon k ap travay. Apre enkubasyon nan tanperati chanm pou 15 minit nan fè nwa a, yo te mezire apoptoz keratinosit epi yo te kalkile pousantaj selil apoptotik lè l sèvi avèk yon sitomèt koule (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA). Yo te detekte siyal pou chanèl FL1 (FITC/Nexin V) ak FL3 (PI), epi yo te etabli tach makè kadran ak trase pwen selil ki tache yo.

2.9. Analiz de kontni Melanin Entraselilè ak Aktivite Tirozinaz

Kontni melanin entraselilè ak tès aktivite tirozinaz yo te mezire lè yo eksplike kote pwosedi a yon ti kras modifye diferan [24]. Melanosit yo te trete ak yon konsantrasyon final 0.5 µM -MSH ak 0.5 mg/mL KC lòt ekstrè pasyèl pou 48 èdtan. Melanocyte pellets te lysed ak 1 N NaOH nan 10 pousan DMSO nan 80 ◦C pou 1 h. Kontni melanin relatif yo te detèmine pa mezire absorpsyon nan 475 nm lè l sèvi avèk yon VICTORMultilabel Plate Reader. Aktivite tirozinaz intraselilè te detèmine pa mezire to pwodiksyon dopachrome lè l sèvi avèk L-DOPA. Melanosit yo te lave ak PBS glas frèt epi liz nan PBS ki gen 1 pousan (w/v) Triton X -100. Substra tirozinaz L-DOPA (2 mg/mL) te prepare nan menm tanpon lysis fosfat la. Chak ekstrè yo te mete nan yon plak 96-byen, epi yo te kòmanse analiz anzim lè yo ajoute yon solisyon L-DOPA. Apre enkubasyon pou 1 èdtan, yo te mezire absorbans nan 475 nm lè l sèvi avèk yon VICTOR Multilabel Plate Reader pou analize pwodiksyon dopachrome. Valè chak mezi te eksprime kòm yon pousantaj nan kontwòl la. Arbutin (A, 0.5 mg/mL) te itilize kòm yon kontwòl pozitif.

Cistancheechinacosidese yon inibitè tirozinaz.

2.10. Quantitative PCR an tan reyèl

Yo te izole RNA total nan chak gwoup melanosit lè l sèvi avèk RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Almay). Yo te fè transkripsyon ranvèse lè l sèvi avèk twous transkripsyon ranvèse cDNA ki gen gwo kapasite (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA), dapre enstriksyon manifakti a, pou jwenn premye fil cDNA. Lè sa a, seksyon yo te itilize kòm modèl pou PCR quantitative an tan reyèl (qRT-PCR) lè l sèvi avèk yon enstriman Bio-Rad Chromo4TM ak melanj mèt SYBR Green qPCR (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA). PCR te fèt anba pre-denaturasyon nan 95 ◦C pou 5 min, denaturasyon nan 95 ◦C pou 15 s, ak annealing nan 55-58 ◦C pou 30 s. GAPDH mRNA te itilize kòm yon referans entèn pou tyrosinase, TRP-1, ak TRP-2 mRNA. Valè relatif ekspresyon jèn sib=2−∆∆CT. Premye sekans yo te jan sa a: Tirozinaz-sans (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), Tirozinaz-anti-sans (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), TRP-1-sans (5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-anti-sans (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-sans (5′- tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP-2-anti-sans (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sans (5′-aggtggtctcctctgacttc{-3′), ak GAPDH-antisans (5′-taccaggaaatgagcttgac -3′).

2.11. Western Blotting

Melanosit yo te rekòlte ak lysed lè l sèvi avèk yon reyaktif ekstraksyon pwoteyin mamifè (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Tout pwosedi yo te fèt dapre enstriksyon manifakti a. Tout konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine lè l sèvi avèk yon twous tès pwoteyin Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Lè sa a, tanpon loading te ajoute nan supernatant nan pwoteyin ak melanje. Melanj lan te bouyi pou 10 minit, epi pwoteyin yo te separe lè l sèvi avèk Mini-PROTEAN Precast Gels (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) epi transfere sou yon manbràn Hybond polyvinylidene difluoride (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Iminodeteksyon te fèt lè l sèvi avèk tirozinaz (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), fosforil CREB (p-CREB 1: 1000), CREB(1:1000), ak -tubulin (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) lè l sèvi avèk SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Yo te enkube manbràn nan lannwit lan ak antikò prensipal yo nan 4 ◦C. Antikò segondè kabrit anti-lapen (IgG) (1:5000, Teknoloji siyal selilè) te ajoute nan manbràn nan epi enkube nan tanperati chanm pou 1 èdtan. Gwoup pwoteyin yo te obsève lè l sèvi avèk yon pierce ECL lwès blotting substrate améliorée (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ak quantifiée kòm rapò a nan entansite nan gwoup la pwoteyin sib ak entansite a nan gwoup la -tubulin.

2.12. Analiz estatistik

Tout tès yo te repete poukont yo omwen twa fwa. Tout paramèt estatistik yo prezante kòm erè estanda mwayèn nan mwayèn (SEM). Analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk analiz yon sèl-fason nan divèjans (ANOVA), ki te swiv pa tès pòs-hoc Dunn la. Yon valè p < 0.01="" oswa="" p="">< 0.05="" te="" konsidere="" kòm="">

tès pou flavonoid

3. Rezilta yo

3.1. Konparezon Pwopriyete Antioksidan nan Plizyè Ekstrè Pasyèl nan KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25.7 ± 2.1 pousan) > KCF (8.7 ± 1.1 pousan) (Figi 1E).

3.2. Konparezon Keratinosit solid ak domaje trete ak plizyè ekstrè pasyèl nan KC nan prezans UVA, UVB, oswa ki pa iradyasyon.

Nou te fè eksperyans sa yo pou eksplore efè onkeratinocytes KCR, KCS, KCL, ak KCF. Premyèman, tout ekstrè yo te aplike nan keratinosit HaCaT nan prezans UVA, UVB, oswa ki pa iradyasyon. Analiz CCK-8 te montre ke ekstrè yo pa t chanje siyifikativman viabilite keratinosit nan konsantrasyon 0.5 mg/mL. Apre sa, keratinosit yo te trete ak KCR, KCS, KCL, ak KCF nan prezans UVA oswa UVB iradyasyon. UVA ak UVB iradyasyon siyifikativman anpeche keratinosit viabilite, jan yo montre nan analiz CCK-8 nan Figi 2A. Sepandan, nou te jwenn ke rantabilite nan keratinosit UVA ak UVB-iradyasyon ogmante nan lòd sa a: KCL, KCR, KCS, ak KCF (Figi 2A). Nou menm tou nou kontwole keratinosit ki domaje yo lè nou mezire liberasyon LDH ekstraselilè a. Rezilta yo te montre ke UVA oswa UVB iradyasyon siyifikativman fasilite lage LDH; sepandan, KCL, KCR, KCS, ak KCF siyifikativman atenue liberasyon LDH ak ekspoze UVA oswa UVB nan lòd sa a (Figi 2B). Rezilta eksperimantal ki anwo yo te montre ke efè anti-proliferatif ak sitotoksik iradyasyon UVA oswa UVB sou keratinosit yo te soulaje nan lòd KCL, KCR, KCS, ak KCF. Miyò, KCL ka retabli viabilite selil yo pou kontwole nivo yo.

Figi 2. Vitabilite keratinosit yo ak efè sitotoksisite KCR, KCS, KCL, ak KCF ekstrè nan prezans UVA, UVB, oswa ki pa iradyasyon.

3.3. Konparezon pwodiksyon entraselilè ROS nan Keratinosit trete ak plizyè ekstrè pasyèl nan KC nan prezans oswa absans iradyasyon UVA ak UVB.

Kòm pwodiksyon entraselilè ROS lakòz gwo domaj keratinosit, yo konsidere yo kòm medyatè potansyèl de domaj radyasyon UVA oswa UVB. Plizyè etid yo sijere ke UVA oswa UVB iradyasyon pwovoke pwodiksyon ROS andojèn [12,14]. Nou te vize detèmine si te gen yon ogmantasyon nan nivo ROS andojèn nan keratinosit iradyasyon UVA oswa UVB. An konsekans, nou analize entansite fluoresans intracellular nan pwofonde CM-H2DCFDA lè l sèvi avèk mikwoskospi fliyoresan ak sikometri koule. Kòm rezilta nan mikwoskospi fliyoresan, imaj tach CM-H2DCFDA te montre yon ti tach nan kontwòl, KCR, KCS, KCL, ak KCF-trete keratinosit ak tach enpòtan nan UVA- oswa UVB keratinosit (Figi 3A). Dapre rezilta yo kantite sikometri koule, iradyasyon UVA ak UVB ogmante nivo ROS intraselilè nan keratinosit pa 27.2 ± 4.5 pousan ak 34.1 ± 4.2 pousan, respektivman, konpare ak sa ki nan kontwòl la (5.7). ±0.2 pousan). Anplis de sa, menm jan ak rezilta mikwoskospi fliyoresan yo, li te konfime ke nivo entraselilè ROS te siprime pa ekstrè KC nan lòd KCL> KCR> KCS> KCF nan prezans UVA oswa UVB iradyasyon (Figi 3B). Rezilta sa yo endike ke plizyè ekstrè pasyèl nan KC siyifikativman inibit domaj keratinocyte pa diminye nivo andojèn ROS.

Figi 3. Efè KCR, KCS, KCL, ak KCF ekstrè sou pwodiksyon entraselilè ROS nan UVA, UVB, oswa keratinosit ki pa iradyasyon.

3.4. Konparezon nan Apoptoz nan Keratinosit Trete ak Plizyè Ekstrè Pasyèl nan KC nan prezans oswa Absans UVA ak UVB iradyasyon

Pou detekte apoptoz, ki se yon endikatè serye nan domaj keratinosit, keratinosit yo te tache ak Annexin V nan konbinezon ak yòd propidium. Fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit te itilize pou teste pousantaj apoptoz nan keratinosit. UVA ak UVB iradyasyon fasilite aktivite tach Annexin V, tandiske KCR, KCS, KCL, ak KCF diminye pousantaj aktivite tach Annexin V nan prezans UVA ak UVB iradyasyon. KCR, KCS, KCL, ak KCF pou kont yo (0.5 mg/mL) pa t 'pwovoke aktivite tach Annexin V. Done kantifye ki soti nan sitometri koule te montre ke UVA ak UVB iradyasyon ogmante nivo apoptoz nan keratinosit pa 46.3.± 1.5 pousan ak 48.7 ± 1.0 pousan, respektivman, konpare ak kontwòl la (5.0 pousan ± 0.7 pousan). Sa ki enpòtan, li te konfime ke nivo apoptoz te siprime pa ekstrè KC nan lòd KCL> KCR> KCS> KCF nan prezans UVA oswa UVB iradyasyon (Figi 4A, B). An jeneral, iradyasyon UVA ak UVB te lakòz domaj keratinosit ak plizyè ekstrè pasyèl nan KC atenue domaj keratinosit pwovoke pa iradyasyon UV.

Figi 4. Efè KCR, KCS, KCL, ak KCF ekstrè sou apoptoz la nan UVA, UVB, oswa keratinosit ki pa iradyasyon.

3.5. Konparezon nan kontni Melanin Entraselilè ak Aktivite Tirosinaz Melanosit Trete ak Plizyè Ekstrè Pasyèl nan KC nan prezans oswa Absans -MSH Tretman

Anvan yo te envestige potansyèl byolojik KCR, KCS, KCL, ak KCF sou - MSH-pwovoke melanogenesis, yo te evalye viabilite selil la apre tretman KCR, KCS, KCL, ak KCF (0.5 mg/mL) lè l sèvi avèk tès CCK-8 nan melanosit B16F10 avèk oswa san -MSH. KCR, KCS, KCL, ak KCF (0.5 mg / mL) pa t chanje viabilite selil la nan prezans oswa absans -MSH (Figi 5A). -MSH se yon ajan melanogenic enpòtan ki ka ogmante kontni melanin entraselilè pa obligatwa nan melanocortin 1 reseptè a ak aktive adenylate cyclase. Pou envestige efè KCR, KCS, KCL, ak KCF sou melanogenesis nan melanosit, kontni melanin entraselilè a te detèmine pa obsèvasyon vizyèl ak mezi byochimik. Jan yo montre nan Figi 5B, kontni melanin entraselilè a te siyifikativman ogmante pa -MSH. Sepandan, ko-tretman ak KCR, KCS, KCL, ak KCF te montre yon rediksyon remakab nan kontni an melanin entraselilè konpare ak tretman an -MSH. Sekans nan mezi byochimik ki endike anpèchman nan kontni melanin entraselilè te jan sa a: KCL > KCR > KCS > KCF (Figi 5B). Yo te fè tès aktivite tirozinaz intraselilè dapre tès kontni melanin entraselilè. Aktivite tirozinaz entraselilè melanosit ki te ankouraje -MSH te ogmante, tandiske ke melanosit ki te ankouraje -MSH ki te trete ak KCR, KCS, KCL, ak KCF te diminye. Sekans nan mezi byochimik ki endike anpèchman nan intracellular tyrosinaseactivity te jan sa a: KCL > KCR > KCS > KCF (Figi 5C). Rezilta sa yo endike ke plizyè ekstrè pasyèl nan KC siyifikativman redwi kontni melanin entraselilè ak inibit aktivite tirozinaz san yo pa chanje viabilite selil.

3.6. Konparezon Transkripsyon ak Nivo Tradiksyon Tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2 nan Melanosit Trete ak Plizyè Ekstrè Pasyèl nan KC nan Prezans oswa Absans-MSH Tretman

Pou eksplore efè KCR, KCS, KCL, ak KCF sou downregulation nan nivo ekspresyon pwoteyin ak mRNA nan makè melanogenesis (tirosinaz, TRP-1, ak TRP-2), melanosit yo te trete ak KCR. , KCS, KCL, ak KCF nan prezans oswa absans -MSH. Jan yo montre nan Figi 6A-C, nivo mRNA tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2 te ogmante siyifikativman pa tretman -MSH. Kontrèman, konpare ak tretman -MSH, KCR, KCS, KCL, ak KCF te kontwole ekspresyon mRNA tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2. Anplis de sa, KCR, KCS, KCL, ak KCF poukont yo pa te gen okenn efè enpòtan sou nivo mRNA tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2. Western blot analiz te fèt an koperasyon ak PCR an tan reyèl. Rezilta yo te montre ke tretman -MSH te ogmante nivo ekspresyon pwoteyin tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2 ak nivo sa yo te diminye pa ko-tretman ak KCR, KCS, KCL, ak KCF (Figi 6D). ). Sekans PCR quantitative an tan reyèl ak anpèchman lwès blotindicating nan tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2 mRNA ak ekspresyon pwoteyin te jan sa a: KCL > KCR=KCS > KCF (Figi 6). Rezilta sa yo sijere ke plizyè ekstrè pasyèl nan KC gen potansyèl pou ankouraje anti-melanogenesis, ki te montre pa downregulation nan makè melanogenesis.

3.7. Konparezon ekspresyon MITF ak fosforilasyon CREB nan melanosit trete ak plizyè ekstrè pasyèl nan KC nan prezans oswa absans -MSH Tretman.

Tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2 esansyèl nan melanogenesis. Ekspresyon yo reglemante pa MITFexpression ak CREB fosforilasyon [17,21]. Analiz Western blot endike ke KCR, KCS, KCL, ak KCFeffectively inibit ogmantasyon nan nivo pwoteyin MITF ki te koze pa -MSH tretman. Anplis de sa, KCR, KCS, KCL, ak KCF pou kont yo diman detekte ekspresyon pwoteyin MITF. Sekans rezilta kantite lwès blot ki endike anpèchman nivo ekspresyon pwoteyin MITF yo te jan sa a: KCL > KCR > KCS > KCF (Figure7A). Anplis, KCR, KCS, KCL, ak KCF ranvèse efè tretman -MSH sou fosforilasyon CREB. KCR, KCS, KCL, ak KCF pou kont yo te gen ti efè sou fosforilasyon CREB. Sekans rezilta kantite lwès blot ki endike anpèchman nivo fosforilasyon CREB yo te jan sa a: KCL > KCR > KCS > KCF (Figi 7B). Rezilta sa yo endike ke plizyè ekstrè pasyèl nan KC siprime melanogenesis inmelanocytes, omwen an pati, atravè ekspresyon MITF ak fosforilasyon CREB.

4. Diskisyon

Popilarite blanchiman po a ap ogmante atravè lemond akòz ogmantasyon nan iradyasyon UV, epi li gen anpil chans rive nan gwo pwopòsyon nan deseni kap vini yo pou rezon estetik [8]. Plizyè kalite klowòks, tankou asid kojik ak arbutin, yo te itilize nan mache kosmetik ak pharmaceutique. Anplis, ekstrè natirèl yo ap resevwa plis atansyon akòz potansyèl antioksidan, anti-enflamatwa, anti-timè, anti-bakteri, ak lòt aktivite [26,27]. Ki baze sou karakteristik sa yo nan antioksidan ak photoprotective ak anti-melanogenesis, plizyè kandida kosmetik ak pharmaceutique yo te devlope. Li se byen li te ye ke pwopriyete sa yo nan kandida blanchiman se kontribitè endispansab nan rechèch kosmetik ak pharmaceutique ak devlopman [28]. TDM gen milti-konpozan ak milti-sib pwopriyete ak anpil amelyore efikasite byolojik imen ak kalite lavi [29]. Rechèch fitochimik modèn montre ke KC gen yon varyete engredyan, ak lignans ak tèrpenoid yo se engredyan prensipal yo [30]. Yo te idantifye plis pase 202 konpoze, ki gen ladan lignan dibenzocyclooctadiene, Spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadien lignans, Arylnaphthalene lignans, Kadlongilactone triterpenoids, ak sesquiterpenoids [31,32]. Driedroots yo, tij, ak fèy nan KC gen yon tradisyon laj nan itilize nan TDM nan trete atrit rimatoyid, ilsè duodnal, maladi gastwoentestinal, ak pwoblèm jinekolojik. Rasin yo sèk nan KC, ak aksyon nan netwaye chalè ak elimine toksin, pwovoke dyurèz pou retire èdèm. Fwi KC yo sitou konsome nan fòm fwi fre, ji, ak diven fwi, ki endike ke yo benefisye sante moun [7,33,34]. Etid anvan yo te montre tou ke li rich nan engredyan byoaktif tankou lignan, triterpenoid, flavonoid, asid fenolik, estewoyid, ak asid amine, ki gen gwo valè nitrisyonèl ak medsin [3,35]. Nan etid sa a, yo te ekstrè diferan pati nan KC. Miyò, kontni total polifenòl ak flavonoid fèy ak rasin KC yo te pi wo pase tij ak fwi. Fèy ak rasin yo gen plis pase de fwa plis polifenol ak flavonoid pase tij ak fwi. Kòm yon rezilta, nou konsidere ke polifenol total ak flavonoid fè yon kontribisyon siyifikatif nan efè photoprotective ak anti-melanogenic nan KC.

Fototoksisite kutane ki te koze pa radyasyon UV se sitou akòz sitotoksisite selil, akimilasyon ROS intraselilè, ak apoptoz nan keratinosit. Se poutèt sa, li pi rezonab pou konsantre sou anpèchman cytotoxicity selilè, akimilasyon entraselilè ROS, ak apoptoz nan keratinosit UVA-ak UVB-iradyasyon [36,37]. Jan sa dekri nan etid sa a [10,38], entèvansyon an ak ekstrè KC sou foto-sitotoksisite (UVA: 20 J / cm2, UVB: 50 mJ / cm2) rezilta yo te montre ke ekstrè KC siyifikativman redwi sitotoksisite selil la, akimilasyon ROS intraselilè ak apoptoz. Konfòm ak rezilta anvan yo, efè foto-pwotektif fèy ak rasin KC yo te pi wo pase tij la ak fwi. Anplis de sa, rezilta nou yo te endike ke ekstrè KC montre efè yo mansyone pi wo a pa ankouraje aktivite antioksidan. Melanogenesis souvan obsève apre iradyasyon UV epi li prensipalman asosye ak pigmantasyon oswa ipèpigmantasyon [39]. Dapre etid anvan yo, metòd pou pwovoke melanogenesis lè l sèvi avèk -MSH te lajman rekonèt ak aplike. Se poutèt sa, etid sa a te baze sou konstriksyon an nan yon modèl melanosit ankouraje ak -MSH [24,39]. Nou te jwenn ke KC ekstrè siprime -MSH-stimulé melanincontent entraselilè ak aktivite tirozinaz. Anplis de sa, ekstrè KC te kontwole transkripsyon ak tradiksyon makè melanogenesis tankou tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2 nan melanosit ki ankouraje -MSH. Anplis de sa, nou te envestige ekspresyon pwoteyin MITF ak fosforilasyon CREB nan melanosit -MSH-stimile. Menm jan an tou, nan etid sa a, nou te jwenn ke KC ekstrè siprime -MSH-medyatè ekspresyon pwoteyin MITF ak fosforilasyon CREB nan melanosit. Konfòm ak rezilta photoprotective, efè anti-melanogenic nan fèy KC ak rasin yo te pi wo pase sa yo ki nan tij yo ak fwi.

tranch cistanche

Pou plis enfòmasyon, tanpri klike isit la.

5. Konklizyon

An jeneral, yo te jwenn efè potansyèl fotoprotective ak anti-melanogenic ekstrè KC nan etid sa a. Ekstrè KC ak kontni segondè polifenol ak flavonoid ka egzèse efè foto-pwotektif ak anti-melanogenic sou keratinosit ak melanosit. Etid sa a bay yon rezon ak estrateji rechèch pou entèvansyon kosmetik ak pharmaceutique pou blanchi natirèl ak ajan fotopwotektif.