Prekondisyone-aktive AKT kontwole tolerans newòn nan iskemi atravè chemen MDM2–p53Ⅰ

Résumé

Youn nan mekanis ki pi enpòtan nan prekondisyone-medyatè neropwoteksyon se diminisyon nan apoptoz selil, pwovoke tolerans nan sèvo apre iskemi blese ki vin apre. Nan kontèks sa a, chemen siyal antiapoptotik PI3K/AKT jwe yon wòl kle nan reglemante diferansyasyon selilè ak siviv.

Klike sou cistanche tubulosa poud pouneropwoteksyon

AKT aktif li te ye pou ogmante ekspresyon murin doub minit-2 (MDM2), yon E3-ubiquitin ligase ki destabilize p53 pou ankouraje siviv selil kansè yo. Nan newòn, nou dènyèman te montre ke entèraksyon MDM2-p53 potansye pa prekondisyone farmakolojik, ki baze sou eksitasyon subtoksik nan reseptè glutamate NMDA a, ki anpeche apoptoz newòn ischemi-induit.

Sepandan, si mekanis sa a kontribye nan tolerans newòn pandan ischemic preconditioning (IPC) se enkoni. Isit la, nou montre ke IPC pwovoke PI3K-medyatè fosforilasyon nan AKT nan Ser473, ki an vire fosforilasyon MDM2 nan Ser166. Fosforilasyon sa a te deklanche estabilizasyon nikleyè MDM2, ki mennen nan destabilizasyon p53, kidonk anpeche apoptoz newòn sou yon joure ischemik. Anpèchman nan chemen PI3K/AKT ak wortmannin oswa pa silansman AKT pwovoke akimilasyon cytosolic MDM2, anile IPC-induit neuroprotection.

Kidonk, IPC amelyore deklanchman chemen siyal PI3K/AKT la epi li ankouraje tolerans newòn nan kontwole entèraksyon MDM2-p53 la. Konklizyon nou yo bay yon nouvo chemen mekanis ki enplike nan IPC-pwovoke neropwoteksyon atravè modulasyon nan siyal AKT, sijere ke AKT se yon sib potansyèl terapetik kont aksidan ischemik. Mo kle: AKT; MDM2; p53; PI3K; tolerans ischemik; prekondisyone

1. Entwodiksyon

Nan imen, yo te revele egzistans la nan atak ischemik pasajè (TIA) kòm yon eta andojèn prekondisyone ak benefis ki genyen nan rezilta fonksyonèl nan pasyan konjesyon serebral [1-3]. Endogenous neuroprotection induit pa yon kout, subtoksik estimilis ischemic, ke yo rekonèt kòm ischemic preconditioning (IPC), konsidere kòm yon estrateji nan jaden émergentes nan neropwoteksyon kont aksidan ischemic [4-6].

Prèv yo montre ke IPC-pwomosyon neropwoteksyon depann sou transkripsyon, tradiksyon, ak mekanis post-tradiksyon, ki chanje fonksyon an nan pwoteyin kle apre iskemi [6-11]. Sepandan, mekanis ki enplike nan IPC-induced ischemic tolerans (IT) pa te konplètman klarifye nan sèvo imen an [12,13].

Devlopman nouvo apwòch eksperimantal pou konprann neropwoteksyon IPC-medyatè reprezante yon zouti pwisan dechifre mekanis andojèn ki kache nan sèvo IT [6], ki gen potansyèl pou revele nouvo objektif terapetik ki vize pou minimize domaj nan sèvo nan pasyan konjesyon serebral. Nan de dènye deseni yo, lanmò selil newòn apoptotik te pozisyone tèt li kòm yon mekanis esansyèl ki enplike nan aksidan ischemik serebral [14-16]. Nan sans sa a, pwoteyin kinaz B oswa AKT, yon serin/threonine kinase ki mande pou yon fosfoinositid kinase fonksyonèl (PI3K) yo dwe aktive, yo te konsidere kòm yon sib esansyèl pou terapi neuroprotective apre iskemi [17,18].

Dènyèman, nou te demontre ke anpèchman chemen siyal PI3K/AKT la ogmante sansibilite newòn nan eksitotoksisite [19]. AKT patisipe nan yon rezo siyal konplèks anti-apoptotik [20], ki gen eleman yo ka prezan nan diferan kote subselilè depann sou kalite tisi [21,22]. Nan kè a, AKT te patisipe nan kadyopwoteksyon prekondisyone-ankouraje [23].

Prèv yo montre tou ke fosforil AKT ankouraje siviv newòn nan kòmansman iskemi serebral [24]. Malgre ke aktivasyon AKT ka kontribye nan endiksyon IT nan sèvo a [25], mekanis egzak ki enplike deklanchman IPC li yo rete flotant. Nan selil timè yo, aktivasyon chemen siyal PI3K/AKT la mennen nan fosforilasyon MDM2 nan Ser166/186, ki ankouraje translokasyon nikleyè MDM2 [26,27] epi amelyore aktivite ubiquitination li yo [28].

Nan nwayo a, MDM2 mare ak p53 epi li ankouraje ubiquitination li yo ak degradasyon proteasomal ki vin apre, ki anpeche fonksyon p53 [29]. Anba kondisyon estrès, p53 ta ka tou deklanche MDM2 twòp ekspresyon, ki kontrèman siprime deklanchman p53 nan yon bouk fidbak negatif [30]. Anpèchman PI3K anpeche aktivasyon AKT [31] ak fosforilasyon MDM2 nan kè prekondisyone [32].

Nan kontèks sa a, nou te deja jwenn ke prekondisyone nan sèvo nan vivo redwi volim enfaktis apre okluzyon tranzitwa atè serebral mwayen (tMCAO) lè yo ogmante ekspresyon nivo pwoteyin MDM2. Kontinwe, konplèks MDM2-p53 a atenue aktivasyon ischemi pwovoke nan chemen siyal p53/PUMA/caspase-3 nan prensipal newòn cortical [33].

Isit la, nou fouye nan wòl nan chemen an siyal PI3K / AKT nan IPC-medyatè tolerans newòn kont yon aksidan ischemic ki vin apre, osi byen ke mekanis ki kache a, epi nou sitou konsantre sou lyen potansyèl ant aktivasyon AKT ak konplèks MDM2-p53. .

2. Rezilta

2.1. IPC-pwomouvwa neropwoteksyon

Se medyatè fosforilasyon AKT nan Ser473, fosforilasyon MDM2 nan Ser166, ak destabilizasyon p53 Nou te deja dekri enpak entèraksyon MDM2-p53 sou emotivite newòn nan iskemi [34] ak IT [33]. Isit la, nou eksplore wòl potansyèl AKT sou neropwoteksyon IPC kòm yon kandida pou patisipe nan chemen MDM2-p53 la.

Premyèman, nou konfime ke ischemi ankouraje aktivasyon AKT nan newòn, jan sa evidans fosforilasyon AKT nan Ser473. Jan yo montre nan Figi 1A, kout (20 min) OGD siyifikativman pwovoke p (Ser473) AKT ak MDM2 ekspresyon, tandiske nivo pwoteyin AKT rete san chanje (Figi S1A). Sepandan, fosforilasyon AKT pa te obsève lè newòn yo te sibi OGD pwolonje (90 min). Anplis, nivo pwoteyin MDM2 yo te pi ba, ki konsistan avèk ekspresyon ki pi wo nan pwoteyin p53 jan yo montre nan Figi 1A.

Regilasyon ki depann de tan nan ekspresyon Mdm2 apre OGD (Figi 1B) konfime ke iskemi subegi ka enpòtan pou pwovoke mekanis ki anpeche p53 estabilizasyon apre OGD, jan sa deja dekri [33]. Nou te itilize OGD kout (20 min) ki te swiv pa 2 h nan reoxygenation kòm yon modèl nan IPC (Figi S1B) [33]; konsa, nou analize ekstrè newòn yo kolekte nan 4 h nan reoxygenation apre OGD (OGD / R) oswa apre OGD anvan pa pwotokòl la IPC (IPC plis OGD / R). Nan paralèl, newòn yo te enkube nan anviwònman normoxia (Nx) oswa prekondisyone (IPC) (Figi S1B).

Jan yo montre nan Figi 1C ak Figi S1C, IPC pwovoke aktivasyon bonè nan AKT, jan fosforilasyon nan Ser473 [35] te revele, ki te swiv pa estabilizasyon pwoteyin MDM2 ak fosforilasyon nan Ser166. IPC tou anpeche p53 estabilizasyon pwovoke pa OGD / R (Figi 1C). Enteresan, imaj imunofluoresan yo montre nan Figi 1D revele ke IPC ankouraje fosforilasyon AKT nan Ser473 nan newòn, ki majorite akimile nan nwayo a, ak diminye estabilizasyon p53 apre OGD / R (IPC plis OGD / R) lè yo konpare ak newòn ki pa prekondisyone (OGD). /R).

Kontinwe, IPC anpeche apoptoz newòn ak kaspas -3 aktivasyon ki te koze pa OGD/R, jan yo mezire pa sikometri koule (Figi S1D) ak tès fliyometri (Figi S1E), respektivman. Pou konfime wòl p53 nan IPC-medyatè neropwoteksyon, nou te itilize newòn eksprime (tip sovaj; wt) oswa ou pa (knockout; ko) p53 pwoteyin. Rezilta nou yo montre ke newòn ki manke p53 (Figi S1F) yo te pi rezistan a apoptoz OGD-induit pase p53 wt newòn.

Anplis, nivo apoptoz nan newòn p53KO yo te menm jan ak sa yo obsève nan newòn wt prekondisyone (IPC plis OGD / R) (Figi S1G), konsa konfime wòl kle nan destabilizasyon p53 nan IPC-medyatè neuroprotection [33]. Rezilta nou yo montre ke IPC pwovoke neropwoteksyon kont yon joure ischemik atravè yon mekanis ki enplike fosforilasyon AKT nan Ser473, estabilizasyon MDM2 ak fosforilasyon nan Ser166, ak destabilizasyon p53.

2.2. IPC deklanche fosforilasyon MDM2 nan Ser166 atravè chemen PI3K/AKT

Se chemen siyal PI3K/AKT ki enplike nan IT newòn tou de nan vitro [36] ak nan vivo [37]. Sepandan, wòl nan deklanchman IPC-medyatè nan chemen an PI3K / AKT nan règleman an nan konplèks la MDM2-p53 rete enkonu. Pou klarifye sa a, newòn yo te enkube ak inibitè irevokabl ak espesifik nan chemen an PI3K / AKT, wortmannin [19].

Jan yo montre nan Figi 2A, wortmannin anile fosforilasyon IPC-enhanced (Ser473)AKT ak destabilizasyon p53, jan yo montre nan Figi 1D. Rezilta sa yo sijere yon lyen dirèk ant aktivasyon AKT ak anpèchman p53-medyatè apoptoz newòn (Figi S1D) ak aktivasyon kaspas-3 (Figi S1E) pwovoke apre OGD/R. Regilatè prensipal la nan estabilizasyon p53, MDM2, se yon sib nan AKT [26], ki fosforil MDM2 nan Ser166 ak Ser186 [26]. Anpèchman PI3K ak wortmannin anpeche fosforilasyon tou de (Ser473) AKT ak (Ser166) MDM2 pwovoke pa IPC (Figi 2B).

Fosforilasyon espesifik Akt-medyatè nan MDM2 nan Ser166 pwovoke pa IPC te konfime lè l sèvi avèk yon ti RNA entèfere (siRNA) ki fèt espesyalman kont pwoteyin AKT1 (siAkt), ki trè eksprime nan newòn kortikal, e ki gen aktivite esansyèl pou siviv newòn apre iskemi. 38]. Jan yo montre nan Figi 3, siAkt redwi nivo pwoteyin total AKT ak p (Ser473) AKT nan jou 3 apre transfeksyon, tou de nan selil HEK -293 T (Figi 3A) ak nan newòn cortical (Figi 3B).

Anplis, AKT knockdown (siAkt) anpeche fosforilasyon (Ser166) MDM2 (Figi 3B). Rezilta sa yo demontre ke IPC-aktive PI3K/AKT siyal chemen an ankouraje fosforilasyon MDM2 nan Ser166, ki ka responsab pou estabilizasyon MDM2 ak konsekan p53 destabilizasyon apre aksidan iskemik.

2.3. IPC-aktive AKT deklanche Estabilizasyon Pwoteyin MDM2 nikleyè apre iskemi

Aktivasyon AKT te enplike nan translokasyon nikleyè MDM2 nan selil timè [26]. Lè nou konsidere enpòtans estabilizasyon nikleyè MDM2 pou siviv newòn apre iskemi [34] epi, plis espesyalman, wòl neuroprotective li nan IPC [33], nou te deside plis envestige enpòtans chemen siyal PI3K/AKT nan règleman lokalizasyon subselilè MDM2. pwoteyin.

Kidonk, yo te transfekte newòn oswa selil HEK-293T ak pwoteyin imen MDM2-tagged (MDM2-GFP). Figi 4A ak Figi S1H montre tach reprezantan selil HEK-293T transfekte ak imaj ki soti nan newòn ki eksprime pwoteyin MDM2 imen apre kat kondisyon eksperimantal diferan (Nx, IPC, OGD/R, ak IPC plis OGD/R). , respektivman.

Ekspresyon ektopik MDM 2- GFP konfime ke IPC ankouraje akimilasyon nikleyè MDM2 konpare ak newòn ischemik ki pa prekondisyone (OGD/R) oswa normoxic (Nx) (Figi 4A, B), jan yo revele nan quantifikasyon rapò fluoresans nikleyè/sitosol. (Figi S2B) ak entansite fluoresans nikleyè nan MDM 2-GFP (Figi S2C).

2.4. IPC ankouraje p (Ser473) AKT ak entèraksyon MDM2, ki amelyore Estabilizasyon MDM2 nan nwayo a epi redwi apoptoz newòn ki pwovoke sou iskemia.

Apre demonstrasyon wòl IPC-enhanced activation nan chemen PI3K/AKT nan estabilizasyon nikleyè MDM2, nou plis envestige si p (Ser473) AKT ak MDM2 kominike nan nwayo a (Figi 6A). MDM2 immunoprecipitation soti nan ekstrè pwoteyin nikleyè, ki te swiv pa immunoblotting kont MDM2 ak p (Ser473) AKT, revele ke IPC ankouraje entèraksyon ki genyen ant p (Ser473) AKT ak MDM2, apre OGD / R, konsa anpeche OGD / R-induit nikleyè p53 estabilizasyon, jan yo montre nan opinyon nwayo a (Figi 6A).

Anfen, nou etidye efè prejidis nan dezòd chemen PI3K / AKT sou apoptoz newòn (Figi 6B). Anpèchman AKT te kontrekare efè pwoteksyon IPC anvan OGD, ki konfime wòl neuroprotective AKT-MDM2 nan kontèks IT. Rezilta nou yo, kidonk, demontre ke IPC pwovoke fosforilasyon ak aktivasyon AKT, ki ankouraje fosforilasyon MDM2 nan Ser166 ak translokasyon nikleyè, kote li reyaji ak p (Ser473) AKT. Mekanis sa a ka kontribye nan estabilizasyon nikleyè amelyore nan MDM2, ki jwe yon wòl esansyèl nan IPC-induit tolerans ischemic.

Ki jan Cistanche pwoteje newòn yo?

Gen kèk prèv ki sijere ke Cistanche ka pwoteje newòn nan diminye apoptoz (pwograme lanmò selil) ak ankouraje siviv newòn. Apoptoz se yon pwosesis natirèl ki fèt nan kò a pou retire selil ki domaje oswa ki pa vle, men li ka danjere lè li rive twòp oswa yon fason ki pa apwopriye. Yo te jwenn Cistanche anpéché apoptoz nan syans laboratwa, ak efè sa a ka ede pwoteje newòn kont domaj.

Anplis de sa, Cistanche gen yon kantite konpoze byoaktif ki te montre yo gen efè neuroprotective. Pou egzanp, li gen echinacoside, ki te montre pwoteje newòn nan estrès oksidatif ak enflamasyon. Li gen ladan tou acteoside, ki te jwenn gen pwopriyete anti-enflamatwa ak antioksidan.

A kontinye...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 ak Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Enstiti Biyoloji Fonksyonèl ak Genomic, University of Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Espay; eibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Enstiti pou rechèch byomedikal nan Salamanca, University Hospital of Salamanca, University of Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Espay

3 Depatman byochimik ak biyoloji molekilè, University of Salamanca, 37007 Salamanca, Espay 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Espay * Korespondans: mdesteban@usal.es ; Tel.: plis 34-923-29-4908