Metòd jenetik konbinatoryal pou dekouvri konbinezon regilasyon wo-lòd ak chofè jenetik jeni pou diferansyasyon neral

Plonje nan rechèch la pou faktè efikas diferansyasyon selil

Chèchè yo toujou ap fè efò pou jwenn pi bon terapi pou retounen oswa ralanti pwogresyon maladi newolojik tankou maladi Parkinson, maladi alzayme ak maladi Huntington. Maladi sa yo se rezilta lanmò selil newòn nan diferan pati nan sèvo a. Medikaman oswa tretman yo itilize pou soulaje sentòm yo nan pasyan yo pa te byen etabli.

Klike sou poud cistanche tubulosa pou neuroprotection

Yo pa refè tisi neral ki domaje yo epi yo ka lakòz efè segondè vle. Se poutèt sa, yon nimewo ogmante nan syans gade selil souch kòm yon ka geri pwomèt, paske nan kapasite pwòp tèt ou-renouvèlman yo ak fleksibilite nan diferansyasyon nan liy selil vle pou engraftment nan pasyan an refè tisi yo pèdi neral.

Sepandan, anvan selil souch yo ka klinikman itilize nan trete maladi newolojik, toujou gen zòn ki mande pou yon pi bon konpreyansyon yo debloke tout potansyèl yo. Selil souch yo rejeneratif ak pèrmeabl, ak tandans pou yo vin nenpòt kalite selil yo bay bon konkoksyon faktè pou kondwi diferansyasyon. Sepandan, gen yon pwofondè nan konpleksite nan rezo a gwo faktè.

Li enpòtan pou detèmine konbinezon faktè transkripsyon (TF), molekil ti, ak/oswa faktè kwasans pou reyalize sinergism pi bon pou diferansye selil souch ki gen ladan selil souch anbriyon (ESCs) ak selil souch pluripotent pwovoke nan vitès ki pi rapid. nan popilasyon ki pi pwòp nan yon liy newòn. Sepandan, ta ka gen yon fason estratejik pou tcheke faktè sa yo nan yon fason ki pi efikas ak tan-efikas.

Sa a ta ede optimize pwotokòl yo deja etabli ki toujou travayè oswa pou plis karakterizasyon nan subtip newòn tankou newòn epinè mwayen, newòn sansoryèl, ak newòn serotonèrjik. Li rete yon defi pou pwofite chofè sò newòn yo konplè epi defini kijan eleman sa yo kominike youn ak lòt nan rezo regilasyon an.

Kèk gwoup te itilize nouvo apwòch tès depistaj wo-debi pou elicide rezo regilasyon sò selil yo epi yo te bay enfòmasyon enfòmatif sou faktè ki kondwi konvèsyon newòn ak siviv. Liu et al. (2018) te itilize deklanchman CRISPR (CRISPRa) pou fè rechèch pou TF oswa faktè ADN-obligatwa ki ankouraje sò newòn ESC yo. Sepandan, travay la te limite a etidye faktè sèl oswa konbinezon par.

Yon lòt tès depistaj sistematik te fèt pa Tsunemoto et al. (2018), ki te envestige relasyon ki genyen ant TF yo. Pifò nan TF sèl chwazi yo pa te montre okenn efè nan etid la, sepandan, yo te idantifye 76 konbinezon TF par pou ankouraje diferansyasyon fibroblast sourit nan newòn pwovoke.

Miyò, rezilta yo te manke kèk konsistans ak etid anvan yo, tankou pa detekte transpòtè aktif dopamine Slc6a3 nan newòn pwovoke, petèt akòz manke faktè adisyonèl. Yon lòt etid detèmine jèn esansyèl yo pou kenbe oswa amelyore siviv newòn yo lè li fè yon tès depistaj ki baze sou entèferans CRISPR (CRISPRi) (Tian et al., 2019). Epi ankò, yo te limite a tès depistaj sgRNA sèl.

Plis etid yo mande pou yon tès depistaj san patipri pou lòt faktè jenetik, ak ogmante kantite konbinezon faktè, kòm li te montre ke yon bwason ki gen plis pase de faktè ka obligatwa nan kontèks diferan pou kondwi efikasman diferansyasyon ak repwogram.

Yon bon egzanp se konbinezon Oct4, Sox2, Klf4, ak c-Myc ki nesesè pou reglemante rezo siyal devlopman pou pluripotans ESCs (Takahashi and Yamanaka, 2006). Nan sistèm konplèks sa yo, gen yon bezwen konplè karakterize fonksyon yo nan konbinezon jenetik wo-lòd nan yon mòd debi segondè, ak metòd Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) ka jis kapab fè sa.

Metòd CombiGEM pou yon ekran gwo debi, gwo lòd ak sistematik nan konbinezon faktè

CombiGEM ofri pa sèlman yon fason sistematik pou fè ekran pisin gwo echèl, men tou gen kapasite pou asanble évolutive nan bibliyotèk jenetik konbinatoryal wo-lòd (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). Pwosesis la yon sèl-po pèmèt itilizatè a ekran pou yon foul moun nan konbinezon jenetik; 1-fason, 2-fason, 3-fason, ak nan teyori, bibliyotèk n-fason.

Sa a bay yon altènatif rapid nan pwosesis la konvansyonèl nan bati ak tès konbinezon kandida endividyèl nan enterè yo. Pandan ke yo te devlope plizyè lòt estrateji depistaj CRISPR konbinatoryal pou etidye konbinezon jenetik par (Han et al., 2017; Shen et al., 2017; Najm et al., 2018; Truong et al., 2019; DeWeirdt et al., 2020). ), CombiGEM ofri yon opòtinite inik pou evalye entèraksyon ant twa oswa plis konbinezon jenetik.

Pou egzanp, si itilizatè a vize sèvi ak CRISPRa oswa CRISPRi pou twòp eksprime oswa reprime, respektivman, yon lis konbinezon TF kandida, yon moun ta ka ekran yon bibliyotèk kòd bar nan konbinezon sgRNA ki vize TF lè l sèvi avèk CombiGEM-CRISPR v2.0 ( Wong et al., 2016; Zhou et al., 2020) jan yo montre nan Figi 1.

Lè w itilize etap ligasyon yon sèl-po, bibliyotèk sgRNAs ak kòd bar respektif yo enkòpore nan yon vektè destinasyon lentiviral ki rapòte ekspresyon yon pwoteyin fliyoresan lè deklanchman yon pwomotè espesifik kalite selil newòn, tankou tubulin 1. Bibliyotèk la. nan sgRNAs ak yon vektè lentiviral separe ki ebèje Cas9 a enzymatically ensufizant swa fusion ak yon activator transcriptional oswa repressor ka delivre nan selil yo vle kòmanse.

Apre yon tan, kòm selil yo kòmanse diferansye, sèlman selil ki sanble newòn pwovoke pral eksprime fliyoresans, epi selil sa yo ka izole lè l sèvi avèk klasman selil fluoresans aktive pou rekipere konbinezon TF ki genyen yo atravè sekans kòd bar.

Pou jwenn yon pi bon konpreyansyon sou konbinezon yo ki kondwi liy espesifik selil yo, selil sa yo kapab tou fè sonde pou repòtè yo li te ye oswa makè ki baze sou preferans etap diferansyasyon itilizatè a chwazi pou etidye. Yo ka itilize klasman selilè mayetik-aktive pou separe selil ki enterese yo depann sou ekspresyon makè sifas selil yo.

Sekans RNA yon sèl selil ta ka makonnen ak tès depistaj CRISPR konbinatoryal la kòm yon lekti pou pwofil kalite ak nivo jèn yo monte oswa downregulation ak konbinezon TF yo vize yo ka detèmine atravè lekti kòd bar yo (Replogle et al., 2020). D 'wo kontni yo ta ka itilize pou kontwole chanjman mòfoloji selil yo soti nan premye etap yo nan devlopman newòn.

Enpòtans fizyolojik oswa fonksyonalite selil ki sanble ak newòn yo ka detèmine pa etikèt imunositochimik espesifik pou spirasyon newòn, tankou NeuN, TUJ1, ak MAP2, ak mezi elektwofizyolojik. Kòm mansyone pi bonè, etid yo te konbine TF ak ti molekil pou manipile sò selil yo.

CombiGEM kapab tou itilize pou idantifye ti konbinezon molekil ki ka kenbe renouvèlman pwòp tèt ou nan selil souch, pwovoke diferansyasyon selil-liyay, oswa fasilite repwogram nan ogmante efikasite ak potansyèlman ranplase faktè jenetik. CombiGEM kapab aplike tou pa premye detèmine sib yo ti molekil nan chemen siyal, epigenetik, oswa faktè pwosesis selilè.

Lè sa a, atravè desine yon bibliyotèk nan sgRNA aktive oswa inaktive sib yo dwòg, yon moun ka Lè sa a, idantifye konbinezon yo efikas nan molekil ti amelyore diferansyasyon an oswa repwogram. Konsèp sa a byen reflete nan etid nou te fè pi bonè yo dekouvri konbinezon sib dwòg kont kansè ak maladi Parkinson la (Zhou et al., 2020).

Itilizasyon CombiGEM pa sèlman limite a perturbasyon ki baze sou CRISPR, men li ta ka aplike tou nan lòt faktè regilasyon ADN oswa RNA pou etidye ekran pèt fonksyon yo ak entèferans RNA, osi byen ke sa ki genyen nan fonksyon ak ekspresyon an. nan microRNAs (Wong et al., 2015) ak sekans-verifye ankadreman lekti moun ouvè tankou sa yo rapòte nan bibliyotèk la imen Tfome (Ng et al., 2020).

Metòd CombiSEAL pou jeni wo-debi nan faktè transcription

Jwenn konbinezon ideyal la nan faktè jenetik ki rive natirèlman ka toujou poze defi, tankou limite a sa sèlman TF karakterize nan genòm nan ak konesans anvan sou ekspresyon yo ak wòl nan diferansyasyon. Etid yo te demontre ke TF jeni oswa jenere faktè transkripsyon atifisyèl ouvè yon nouvo avni opsyon pou akselere pousantaj diferansyasyon atravè lòt chemen, depase depandans ekspresyon anvan kondisyon lòt ko-faktè andojèn nan rezo regilasyon jèn yo, oswa ranplase tout ansanm. TF natirèl ak TF ki pi efikas (Jauch, 2018).

Sa a pèmèt chèchè yo adapte faktè ki nesesè yo selon bezwen eksperimantal yo. Nou pwopoze ke si youn vize fè gwo mutagenèz debi sou plizyè sit nan yon TF ki gen diferan domèn, CombiSEAL ta ka pwouve ke yo dwe yon platfòm itil (Choi et al., 2019). Metòd CombiSEAL rasanble fragman ADN ki kode asid amine ki make ak kòd bar (Figi 1).

Figi 1 ｜ Metòd CombiGEM ak CombiSEAL pou fè tès detekte pou faktè jenetik efikas nan diferansyasyon. Yon egzanp metòd CombiGEM se asanble plizyè sgRNA ki eksprime nan menm konstriksyon an, epi konbinezon sgRNA yo reprezante pa kòd bar konkatenasyon yo. Metòd CombiSEAL la gen ladan mitasyon yo prezante nan divès pati nan yon pwoteyin, tankou faktè transcription, ki endike kòm P1, P2, P (n), ak P (n plis 1). Ak konbinezon yo nan mitasyon yo reflete pa kòd bar konkatèn korespondan yo. Itilizatè a ka aplike konfigirasyon yo nan lòt sistèm livrezon ADN, epi nan reprezantasyon sa a, yo itilize vektè lentiviral yo. Estrateji tès depistaj yo ka fèt pa yon fòma pisin, epi nan egzanp sa a, idantifye popilasyon selil ki diferansye ak yon liy newòn espesifik yo detekte pa aktivasyon nan pwomotè a pou ekspresyon pwoteyin fliyoresan, ki make kòm X-fluoresans nan dyagram nan. Sekans pwochen jenerasyon (NGS) kòd bar ki soti nan pisin selilè a pral dekode sib ADN yo oswa varyant transcription (yo). Analiz sevè de faktè ki kondwi diferansyasyon diferan kalite newòn ta ka itilize metòd ki baze sou etalaj tankou sonde selil yo ak makè liy selil yo ki te swiv pa klasman selil aktif mayetik (MACS) nan plak milti-byen, ki ka swiv ak D 'wo kontni. Altènativman, sèl-selil RNA sekans (RNA-Seq) pèmèt itilizatè a pwofil ekspresyon jèn selil yo ak fenotip yo vle epi yo ta kapab rekipere kòd bar yo pou idantifye konbinezon sgRNA oswa konbinezon mitasyon nan variant kle a (yo). FACS: Fluoresans aktive selil klasman.

CombiSEAL kòmanse ak premye pati seksyon pwoteyin nan kote mutagenezis vle. Itilizatè a ka jenere nenpòt kantite varyant pou chak seksyon, Lè sa a, tag yo ak kòd bar yo idantifye pozisyon an ak konbinezon nan mitasyon. Lè sa a, chak pisin nan seksyon reyini sekans pa mete yo nan yon vektè destinasyon ebèje sekans pwoteyin nan kalite sovaj modifye ak anzim IIS ki antoure nan rejyon an nan mutagenezis entansyon.

Konplo fizyon san mak sa a ki lye plizyè pati nan yon pwoteyin enpòtan pou evite ajoute asid amine vle nan pwoteyin lan. Metòd CombiSEAL la pèmèt pou detèmine sekans asid amine yo nan pisin lan chwazi nan varyant nan enterè pi efikas ak pri-efikas, evite bezwen an pou sekans lekti long sou pwoteyin nan tout pou idantifye kalite mitasyon yo ak kote yo sitiye atravè tout la. pwoteyin.

Konfigirasyon metodik sa a pèmèt analiz pi fasil lè li fè yon sekans wo-debi nan pisin kout kòd bar konkatenasyon ki dedui konbinezon kalite ak pozisyon mitasyon asid amine, oswa lòt modifikasyon vle tankou echanj domèn, ensèsyon, ak efase, ki te fèt. okòmansman fèt ak enstale sou TF la

Konklizyon

An konparezon ak metòd esè ak erè, pwogrè yo te fè nan anplwaye apwòch plis sistematik pou detèmine faktè esansyèl oswa konbinezon ki nesesè pou konvèti yon sèl kalite selil nan yon liy newòn. Sepandan, kapasite pou idantifye konbinezon ki pi wo yo te manke, epi isit la nou pwopoze ke metòd CombiGEM ka kapab adrese limit sa yo.

CombiGEM sèvi ak yon sistèm ligasyon kòd bar, yon sèl-po pou mete ansanm konbinezon pi wo lòd nan faktè obligatwa ADN yo vize ADN nan yon sèl kou, kontourne pwosesis la nan plizyè jij nan tès depistaj diminye kantite frape nan yon gwosè jere pou validasyon en. . Anplis de sa, TF natirèl mwens efikas yo ka ranplase ak TF atifisyèl oswa enjenieri pou pi byen kontwole ekspresyon jèn. Nou dekri yon metòd mutajenèz pwoteyin, CombiSEAL, ki pral pèmèt itilizatè yo kreye gwo pisin varyant faktè transkripsyon lè yo rasanble dirèkteman plizyè mitasyon sit ki make ak kòd bar nan pwoteyin nan ak diferan domèn yo.

Sa a pral akselere ak diminye pri pwosedi tès depistaj yo pou rekipere enfòmasyon sou kalite mitasyon varyant ki enterese yo. Nou espere ke metòd yo pwopoze yo ka ede ak plis konpreyansyon ak elaji posiblite yo pou ankouraje rejenerasyon neral epi yo ka lajman aplikab nan lòt domèn rechèch.

Mekanis nan efè neuroprotective Cistanche

Cistanche yo te montre gen efè neropwotektif atravè plizyè mekanis:

1. Efè anti-enflamatwa: Cistanche gen konpoze ki te montre yo anpeche enflamasyon nan divès pati nan sèvo a, ki ka ede pwoteje newòn kont domaj.

2. Efè antioksidan: Cistanche gen konpoze ki gen pwopriyete antioksidan fò. Antioksidan ede pwoteje newòn kont domaj ki koze pa radikal gratis ak estrès oksidatif.

3. Règleman nan nerotransmeteur: Cistanche yo te montre kontwole sèten nerotransmeteur, tankou serotonin ak dopamine, ki ka ede pwoteje newòn ak amelyore fonksyon mantal.

4. eksitasyon faktè nerotwofik: Cistanche yo te montre nan estimile pwodiksyon an nan faktè nerotwofik, tankou faktè neurotrophic ki sòti nan sèvo (BDNF), ki ka ankouraje kwasans lan ak siviv nan newòn.

An jeneral, mekanis sa yo travay ansanm pou pwoteje newòn kont domaj, ankouraje kwasans yo ak siviv, ak amelyore fonksyon mantal.

Referans

Choi GCG, Zhou P, Yuen CTL, Chan BKC, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong ASL (2019) Combinatorial mutagenesis an masse optimize aktivite koreksyon genomic SpCas9. Metòd Nat 16:722-730.

DeWeirdt PC, Sanson KR, Sangree AK, Hegde M, Hanna RE, Feeley MN, Griffith AL, Teng T, Borys SM, Strand C, Joung JK, Kleinstiver BP, Pan X, Huang A, Doench JG (2020) Optimizasyon AsCas12a pou ekran jenetik konbinatwa nan selil imen. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K, Jeng EE, Hess GT, Morgens DW, Li A, Bassik MC (2017) Konbinezon dwòg sinèrjik pou kansè yo idantifye nan yon ekran CRISPR pou entèraksyon jenetik par. Nat Biotechnol 35:463- 474.

Jauch R (2018) Reprogramasyon sò selilè atravè jeni faktè transkripsyon natif natal. Opinyon Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ, Strand C, Donovan KF, Hegde M, Sanson KR, Vaimberg EW, Sullender ME, Hartenian E, Kalani Z, Fusi N, Listgarten J, Younger ST, Bernstein BE, Root DE, Doench JG (2018) Orthologous CRISPR- Cas9 anzim pou ekran jenetik konbinatwa. Nat Biotechnol 36:179-189.

Ng AHM, Khoshakhlagh P, Rojo Arias JE, Pasquini G, Wang K, Swiersy A, Shipman SL, Appleton E, Kiaee K, Kohman RE, Vernet A, Dysart M, Leeper K, Saylor W, Huang JY, Graveline A, Taipale J, Hill DE, Vidal M, Melero-Martin JM, et al. (2020) Yon bibliyotèk konplè sou faktè transkripsyon imen pou jeni selil sò. Nat Biotechnol doi: 10.1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, Meer EJ, Terry JM, Riordan DP, Srinivas N, Fiddes IT, Arthur JG, Alvarado LJ, Pfeiffer KA, Mikkelsen TS, Weissman JS, Adamson B (2020) Ekran CRISPR yon sèl selil konbinatè pa gid dirèk RNA kaptire ak sekans vize. Nat Biotechnol 38:954- 961.

Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, BojorquezGomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN , Kreisberg JF, Krogan N, Qi L, et al. (2017) Konbinatoryal CRISPRCas9 ekran pou kat de novo nan entèraksyon jenetik. Metòd Nat 14:573-576.

Takahashi K, Yamanaka S (2006) Endiksyon nan selil souch pluripotent ki soti nan kilti fibroblast anbriyon sourit ak granmoun pa faktè defini. Selil 126:663-676.

Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, Laurie MT, Hong JY, Nathaniel D, Prabhu AV, Fernandopulle MS, Patel R, Abshari M, Ward ME, Kampmann M (2019) CRISPR platfòm ki baze sou entèferans pou ekran jenetik multimodal nan iPSC imen. -derive newòn. Newòn 104:239-255.

Truong VA, Hsu MN, Kieu Nguyen NT, Lin MW, Shen CC, Lin CY, Hu YC (2019) CRISPRai pou deklanchman jèn similtane ak anpèchman pou ankouraje chondrogenesis selil souch ak rejenerasyon zo kalvaryal. Asid Nukleik Res 47:e74. Wong AS, Choi GC, Cheng AA, Purcell O, Lu TK (2015) Gwoup paralèl jenetik konbinezon segondè nan selil imen. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS, Choi GC, Cui CH, Pregernig G, Milani P, Adam M, Perli SD, Kazer SW, Gaillard A, Hermann M, Shalek AK, Fraenkel E, Lu TK (2016) Multiplexed barcoded CRISPR-Cas9 screening enabled by CombiGEM . Proc Natl Acad Sci USA 113:2544-2549.

Zhou P, Chan BKC, Wan YK, Yuen CTL, Choi GCG, Li X, Tong CSW, Zhong SSW, Sun J, Bao Y, Mak SYL, Chow MZY, Khaw JV, Leung SY, Zheng Z, Cheung LWT, Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) Yon ekran CRISPR konbinatwa twa-fason pou analize entèraksyon nan mitan sib dwòg. Rep selilè 32:108020.

Dawn GL Thean, Alan SL Wong*