Aksyon pwomitotik Oenothera Biennis sou fibroblasts po moun senesan Pati 1

Résumé: Akimilasyon fibroblasts po senesan kondwi aje po. Reyaktivasyon pwopagasyon se yon estrateji pou modile senesans selil. Dènyèman, nou te rapòte konpozisyon chimik egzak ekstrè idrofil nan kilti selil Oenothera biennis (ObHEx) epi nou te montre pwopriyete anti-aje po li yo. Travay sa a gen pou objaktif pou evalye efè byolojik li espesyalman sou senesans selil. Yo te evalye aksyon ObHEx sou fibroblast nòmal imen po moun ki sibi senesans prematire estrès (SIPS) atravè yon analiz pwoteomik ultra-fon, ki mennen ale nan pwoteòm ki pi mondyal ki asosye ak senesans byen lwen tèlman. Done espektometri mas montre ke tretman an ak ObHEx re-etabli nivo nan pwoteyin mitotik enpòtan, fòtman downregulated nan selil senesan. Pou valide konklizyon proteomik nou yo, nou pwouve ke ObHEx ka, an pati, retabli aktivite 'senescence-asosye-ß-galactosidase', mak ki pi komen nan selil senesan yo. Anplis de sa, pou evalye si regilasyon nan nivo pwoteyin mitotik tradwi nan yon sik selil re-antre, eksperyans FACS yo te pote soti, demontre yon ti men siyifikatif reyaktivasyon nan pwopagasyon selil senesan pa ObHEx. An konklizyon, pwofil pwoteòm mondyal ki gen rapò ak senesans pwofon ki te pibliye isit la bay yon panèl dè santèn de pwoteyin deregleman pa SIPS ki ka itilize pa kominote a pou plis konprann senesans ak efè nouvo modulateur potansyèl yo. Anplis, analiz pwoteomik montre yon efè espesifik pro-mitotik ObHEx sou selil senesan. Kidonk, nou sijere ObHEx kòm yon adjuvant pwisan kont senesans ki asosye ak aje po.

Glycoside nan cistanche ka ogmante tou aktivite SOD nan kè ak tisi fwa, ak siyifikativman redwi kontni an nan lipofuscin ak MDA nan chak tisi, efektivman scavenging divès kalite radikal oksijèn reyaktif (OH-, H₂O₂, elatriye) ak pwoteje kont domaj ADN ki te koze. pa OH-radikal. Cistanche phenylethanoid glikozid gen yon gwo kapasite scavenging nan radikal gratis, yon pi wo kapasite diminye pase vitamin C, amelyore aktivite a nan SOD nan sispansyon espèm, redwi kontni an nan MDA, epi yo gen yon sèten efè pwoteksyon sou fonksyon manbràn espèm. Cistanche polisakarid ka amelyore aktivite SOD ak GSH-Px nan eritrosit ak tisi nan poumon sourit eksperimantal senesan ki te koze pa D-galaktoz, osi byen ke diminye kontni an nan MDA ak kolagen an nan poumon ak plasma, ak ogmante kontni an nan elastin, gen yon bon efè scavenging sou DPPH, pwolonje tan an nan ipoksi nan sourit senesan, amelyore aktivite a nan SOD nan serom, ak retade koripsyon fizyolojik nan poumon nan sourit senesan eksperimantal Avèk koripsyon selilè mòfolojik, eksperyans yo te montre ke Cistanche gen bon kapasite antioksidan. epi li gen potansyèl pou yo dwe yon dwòg pou anpeche ak trete maladi po aje. An menm tan an, echinacoside nan Cistanche gen yon kapasite siyifikatif pou retire radikal gratis DPPH epi li ka retire espès oksijèn reyaktif, anpeche degradasyon kolagen an gratis radikal-induit, epi tou li gen yon efè reparasyon bon sou domaj anyon radikal gratis timin.

Klike sou Cistanche Tubulosa Supplement

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Mo kle: Oenothera biennis ekstrè idrofil; senesans; fibroblasts; pwoteomik; espektometri mas; diaPASEF; mitoz; aje po

1. Entwodiksyon

Senesans se kòz prensipal aje ak maladi ki gen rapò ak laj. Selil senesan yo sibi arestasyon pwopagasyon kòm yon repons a ewozyon telomè fizyolojik (senesans repwodui) oswa nan deklannche estrès ki gen ladan domaj ADN, estrès oksidatif, souch òganèl, ak deklanchman onkojèn (senesans twò bonè estrès, SIPS) [1]. Malgre ADN Damage Response (DDR) pwovoke kwasans kwasans, selil senesan yo montre yon eta metabolik segondè ak aktivite lizozomal, enpòtan anpil pou ogmante aktivite sekretè yo, ke yo rekonèt kòm fenotip sekretè ki asosye ak senescence (SASP) [2,3]. Faktè SASP gen ladan plizyè fanmi idrosolubl (interleukins, chemokines, faktè kwasans, sekrete proteaz) ak ensolubl (sekre pwoteyin ensolubl ak eleman matris ekstraselilè) pwoteyin ki afekte negatif tisi ki antoure a, jenere yon eta enflamatwa kwonik ki ba-klas.

Akimilasyon nan fibroblast senesan nan dèrma a kondui aje po a, afekte entegrite nan matris la ekstraselilè (ECM) ak fonksyon an nan selil vwazen mikwovaskilè endothelial, melanosit epidèm, ak keratinosit [4-6]. Twa estrateji prensipal yo pou kontrekare senesans gen ladan (i) clearance nan selil senesan pa endiksyon nan apoptoz oswa aktivasyon iminitè; (ii) modulation SASP ak (iii) reyaktif pwopagasyon selilè. Vreman vre, byenke senesans yo te dekri orijinèlman kòm yon arestasyon sik selil irevokabl, prèv aktyèl sijere ke pwopagasyon ka retabli [7-9].

Nan senaryo sa a, engredyan ki kapab anpeche ak / oswa modile senesans selilè yo nan gwo enterè nan jaden an kosmetik kòm zam ki gen anpil valè pou kontrekare aje po. An patikilye, ekstrè ki sòti nan espès Oenothera biennis (O. biennis, Evening Primrose), ki fè pati fanmi Onagraceae, yo tradisyonèlman itilize pou aplikasyon kosmetik akòz aktivite anti-enflamatwa ak antioksidan yo [10]. Ekstrè metanolik prepare nan pati ayeryen ak ekstrè fèy akeuz sitou gen asid fenolik ak flavonoid, tandiske ekstrè metanolik yo jwenn nan rasin sitou gen sterol ak triterpèn [11]. Malgre ke aktivite byolojik nan ekstrè pati ayeryen alkòl ak idroalkolik yo te demontre [12-14], ekstrè ki pi souvan itilize nan O. biennis yo se lwil yo jwenn nan grenn, ki trè rich nan asid gra. Vreman vre, depi kontni segondè yo nan asid linoleik (LA) ak asid -linolenik (GLA), lwil grenn O. biennis amelyore fonksyone apwopriye nan po a epi, an patikilye, yo te montre efè benefik nan pasyan ki gen dèrmatoz kwonik [11, 15].

Plis dènyèman, ekstrè yo te jwenn nan kilti selil O. biennis yo te pwopoze konplètman ranplase ekstrè soti nan plant espontane kòm yo se bio-dirab, san kontaminan, ak estanda metabolit segondè melanj [16]. Li se jisteman konbinezon an nan konpoze yo ak efè sinèrjik yo ki responsab pou aktivite an jeneral nan ekstrè botanik [17].

Isit la, nou te konsantre sou ekstrè idrofil nan kilti selil O. biennis (ObHEx), moun rich nan lignans ak triterpenes, jan li te montre pwopriyete anti-aje po lè yo teste nan modèl in vitro ak ansyen vivo [18]. Mass spectrometri ki baze sou karakterizasyon chimik nan ekstrè sa a revele ke li gen plizyè klas nan metabolit segondè enteresan. Yo fè pati lignans (salvadoraside ak liriodendron) ak triterpenes (asid muryatik, asid arjunolik, asid aspartik, ak hederagenin), kèk nan yo ki te deja asosye ak pwodiksyon pro-kolagen I nan fibroblast imen [19,20]. An patikilye, nou te deja pwouve ke ObHEx ankouraje kontraksyon matris kolagen an, aktin polymérisation, ak pwodiksyon an nan pwoteyin ECM, kidonk amelyore determinasyon po ak elastisite, atravè yon ogmantasyon nan ekspresyon jèn Myosin limyè chèn kinaz (MYLK).

Pou dat, mekanis molekilè efè ObHEx sou aje po ak senesans selilè, an patikilye, pa te envestige. Travay sa a gen pou objaktif pou eksplore aktivite ObHEx sou fibroblasts po moun senesan. Nou te itilize yon apwòch pwoteomik ultra-pwofonde espektrometri mas done-endepandan pou jwenn sijesyon sou mekanis aksyon ak metòd bio-ortogonal pou valide ak mennen ankèt sou li (Figi 1).

2. Rezilta

Estrès-induit twò bonè senesans (SIPS) te fèt nan nòmal fibroblasts po imen (NHDF) pa tretman ak oksijene idwojèn (H2O2). Selil senesan estrès oksidatif yo se yon modèl ekselan nan vitro pou rechèch aje ak H2O2 lajman itilize pou reyalize li [21,22].

Pou konprann chemen byolojik yo chanje pa ObHEx sou selil senesan NHDF, nou te itilize yon apwòch pwoteomik ultra-fon. SIPS ak selil kontwòl yo te trete oswa ou pa pou 48 èdtan ak ekstrè a nan 0.01 pousan (p/v) depi, nan tès MTT la rapòte nan [18], sa a rezilta nan konsantrasyon ki pi wo a ki pa lakòz. nenpòt toksisite selil apre 48 èdtan enkubasyon.

Lè sa a, lisat selil yo te sibi dijesyon triptik ak nano-UPLC MS / MS analiz. Pou jwenn pwofondè optimal nan pwoteyòm nan, done espektrometri mas yo te akeri nan mòd Done Endepandan Akizisyon (DIA), ki te pèmèt quantification solid nan 9650 pwoteyin (Tablo S1), ak done konplè nan 98 pousan. Etid nou an rapòte analiz pwoteòm ki pi konplè sou selil senesan jiska dat.

2.1. Evalyasyon Prematire Senesans Estrès-Enduit (SIPS).

Premye a tout, nou verifye si endiksyon senesans nan NHDF te reyisi, analize pwoteòm mondyal H2O2-trete NHDF pa mas spectrometri (MS) epi egzamine mòfoloji yo pa flow cytometry.

2.1.1. Evalyasyon SIPS pa Mass Spectrometry (MS)

Pou evalye endiksyon SIPS, nou konpare pwoteòm total selil NHDF H2O2-trete yo ak selil ki pa trete yo. Pami 3256 pwoteyin yo ki te deregleman, yo te jwenn plizyè byomarkè nan senesans siyifikativman chanje (Figi 2A, B). Premyèman, nou te obsève regilasyon an nan biomarker ki pi lajman itilize nan selil senesan, 'senescence-asosye-ß-galactosidase' (SA- -gal, GLB1). Nivo ogmante nan anzim lizozomal GLB1 ak Tisi alfa-L-fukozidaz (FUCA1), ki te jwenn tou regilasyon pa MS, reflete ogmantasyon karakteristik nan kontni lizozomal selil senesan [23,24]. Vreman vre, lizozòm favorize pwosesis katabolik, ki bay enèji ak matyè premyè ki nesesè pa sekresyon senesans ki asosye [25].

Dezyèmman, nivo pwoteyin serin / treonin-pwoteyin kinaz ATR ak serin-pwoteyin kinaz ATM, tou de ki enplike nan siyal DDR, yo te jwenn tou ogmante [26]. DDR aktive pa domaj ADN nikleyè, jeneralman ki asosye ak etablisman senesans selilè, epi li konvèje nan aktivasyon an nan timè suppressor p53. Anplis de sa, yo te obsève regilasyon nan varyant 2A histon MACROH2A1 ak MACRO2A2. Pwoteyin sa yo patisipe nan fòmasyon ATR-depandan nan Senescence Associated Heterochromatin Foci (SAHFs), estrikti kwomatin dans ak represif karakteristik selil senesan [1,2,27].

Anfen, nivo déréglementées de Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1A oswa p21 (CDK1NA) ak pwopagasyon makè pwoteyin Ki -67 (MKI67) reflete arestasyon sik selil senesan nan faz G2 [28,29]. Vreman vre, p21 ogmante nivo yo, ankouraje pa yon chemen p53 domaj ADN pwovoke, ak inibit CDK2-cyclin E konplèks la. Sa lakòz dephosphorylation nan pwoteyin retinoblastoma (RB), ki nan eta ipo-fosforile li yo sequesters E2F, yon faktè transcriptional ki favorize pwogresyon nan sik selilè a [2].

Pi lwen pase makè sa yo deja li te ye nan senesans, yon analiz anrichisman pi laj nan pwoteyin ki pi regilasyon nan H2O2 trete kont selil kontwòl pwen nan deklanchman wout p53 / p21 pwovoke pa domaj ADN (Figi 2C, Tablo S2). Olye de sa, pwoteyin ki asosye ak pwopagasyon ak mitoz yo downregulated, lonje dwèt sou arestasyon pwopagasyon konsekan (Figi 2D, Tablo S3).

2.1.2. Evalyasyon SIPS pa Flow Cytometry

SIPS te konfime tou pa analiz sikometri koule. Nou te obsève yon ogmantasyon nan granularite sitoplasmik selil H2O2-trete yo (Figi S1A, B), akòz ogmantasyon nan kantite ak gwosè lizozom yo nan selil senesan yo. Sa a se rezilta nan balans ki genyen ant akimilasyon gradyèl nan lizozom disfonksyonèl ak pwodiksyon an nan nouvo [25]. Anplis, nou menm tou nou detekte yon akimilasyon intra-lysosomal agresom lipofuscin: kwasans sa a, ki asosye ak yon ogmantasyon nan otofluoresans nan kanal la 525/50 nm bandpass nan sitomèt koule a, se yon lòt makè nan senesans ki gen rapò ak yon fonksyone byen lizozomal (Figi S1C, D) [30].

2.2. ObHEx pasyèlman retabli Pwoteyin Mitotik Downregulated nan selil senesan NHDF

Tretman ObHEx te kapab pasyèlman retabli nivo 71 pwoteyin déréglementé nan kondisyon senesan (de-fason tès ANOVA q-valè <{3}}.05). Plis jisteman, 46 pwoteyin yo te downregulated pa ekstrè a ak 25 yo te upregulated (Figi 3A, Tablo S4 ak S5).

Reactome analiz anrichisman nan 46 pwoteyin yo ki gen nivo yo te diminye pa ObHEx sijere ke ekstrè a ka diminye deklanchman wout p53 ak afekte metabolis fosfatidilinositol ak siyal Lerison, ki gen chanjman yo te jwenn nan aje [31,32] (Figi 3B, Tablo S6).

Konsènan 25 pwoteyin regilasyon yo, analiz anrichisman montre reaktivasyon mitotik selil sik selil yo ak, an patikilye, dewoulman ADN ak replikasyon, kondansasyon kwomozòm, ak rezolisyon chromatid sè yo (Figi 3C, Tablo S7).

Yon analiz apwofondi montre ke 18 nan 25 pwoteyin retabli gwoupe fòtman ansanm (Figi 4A). Nan grap sa a, li posib pou disène CDK1, tout sou-inite konplèks kondensin I (SMC2, SMC4, NCAPD2, NCAPH, ak NCAPG), twa pwoteyin ki gen rapò ak kinetokore (KNTC1, NUF2, ak TRIP13), tout sis inite yo. Konplèks Replicative Minichromosome maintenance (MCM) (MCM2-7) ansanm ak IQGAP3, PBK, ak DHFR.

Kapasite ObHEx pou retabli pasyèlman nivo pwoteyin sa yo montre byen nan trase pwofil yo nan Figi 4B: nivo ekspresyon pwoteyin yo te sitou pa chanje nan selil yo pwopagasyon trete oswa ou pa trete ak ekstrè a, tonbe nan selil senesan yo, ak pasyèlman ogmante apre. ObHEx tretman.

2.3. Egzamen byolojik konfime Mekanis Aksyon ObHEx Promitotic la

Karakteristik ki pi komen nan selil senesan yo se ogmante aktivite SA{{0}}gal ki ka evalye pa yon tès tach. Rezilta nou yo montre ke tretman H2O2 pwovoke yon ogmantasyon enpòtan nan kantite selil pozitif SA- -gal (ble), soti nan 4.7 pousan a 22.9 pousan (Figi 5A, B). Enkubasyon ObHEx te redwi anpil aktivite SA- -gal ak yon diminisyon 38.4 pousan (p <0.01).

Anplis, pou evalye si restorasyon ekspresyon pwoteyin mitotik pa ObHEx tradwi nan reaktivasyon nan sik selilè a, kontwòl la, ak selil senesan yo te trete oswa ou pa ak ekstrè a pou 72 èdtan ak eksperyans Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) yo te fèt. Rezilta selil senesan yo te montre yon blòk nan faz G2/M nan sik selilè a (36.8 pousan), pandan ke sèlman yon fraksyon pi ba nan selil kontwòl yo (7.2 pousan) te nan faz sa yo depi yo te rive nan konfluans, kòmsadwa literati a [ 33] (Figi 5C, D). Tretman an nan selil senesan ak ObHEx te kapab redwi popilasyon an G2 / M pa 4.3 pousan (p <0.05). Nan avi, lè gen rapò ak pòsyon selil senesans apre SIPS (22.9 pousan), yo ta ka estime G2/M chape nan 18.9 pousan. Yo te fè menm tretman ObHEx pou 48 èdtan, men rezilta yo pa t estatistik enpòtan.

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】