Rewiring nan glikoz ak metabolis lipid pwovoke pa G Pwoteyin-kouple reseptè 17 silans pèmèt tranzisyon an nan progenitors oligodendrocyte nan selil myelinating Ⅱ
Jul 13, 2023
3. Rezilta yo
3.1. GPR17 silans nan diferansye OPC yo chanje anpil ekspresyon jèn ki enplike nan metabolis lipid ak glikoz.
Pou mete aksan sou pwosesis byolojik yo ki afekte anpil pa ekspresyon GPR17 pandan diferansyasyon OL, nou entèfere ak ekspresyon li lè nou transfè OPC rat ak siRNA SMART-pool espesifik pou rat GPR17. Apre w fin valide knockdown GPR17 ki gen siksè pa qRT-PCR (Figi S1), nou te fè yon analiz microarray de 30,584 transkripsyon rat nan GPR17-silans kont OPCs kontwòl ak analize jèn yo eksprime diferan (DEGs) pa zouti byoenfòmatik diferan. Premyèman, 640 DEG yo te etidye pa Meta-Core, pou fè yon analiz anrichisman chemen epi idantifye pwosesis yo prevwa yo dwe afekte anpil. Analiz sa a sijere chanjman nan siyal mTOR, ki te deja montre yo dwe lye nan fonksyon GPR17 [37], ak nan lòt pwosesis li te ye ki enpòtan pou spirasyon OPC, tankou "renovasyon sitoskelèt"epi"règleman metabolis lipid"(Tablo 1).
plis
Klike La a Pou Konnen Cistanche Pou Kwasans Zo
Tablo 1. Yo te itilize lojisyèl MetaCore pou fè yon analiz anrichisman chemen sou DEG yo apre silans GPR17. Tablo a montre chemen ki pi enpòtan ki soti nan analiz la, kantite jèn ki asosye yo ak jèn komen ki enkli nan seri done a.
Lè sa a, yo te itilize zouti Ingenuity pathway analysis (IPA) pou fè yon match analiz, ki otomatikman idantifye seri done IPA ki gen anpil resanblans ak diferans ki genyen konpare ak yon seri done rechèch. Analiz sa a ranfòse lyen ki prevwa ant ekspresyon GPR17 ak metabolis lipid, ki montre ke chanjman ekspresyon 38 jèn nan dataset nou an (Tablo S1) yo asosye ak sentèz asid gra ki chanje (Figi 1). Pami sa yo, GPR17 silans pwovoke upregulation nan LXR (fwa X reseptè alfa, NR1H3 nan Figi 2 ak Tablo S1, yon reseptè nikleyè ki reponn a oxysterols) ak SREBP1 (sterol regilasyon eleman obligatwa pwoteyin 1, SREBF1 nan Figi 1 ak Tablo S1), de jwè kle nan sentèz asid gra ak kolestewòl. Nan seri done nou an, nou te obsève tou ke plizyè jèn ki chanje, ki gen ladan PDH (pyruvate dehydrogenase), Ldha (lactate dehydrogenase alpha), ak Pdk1 (pyruvate dehydrogenase kinase 1), yo gen rapò ak metabolis glikoz ak sik Krebs ', sa ki sijere patisipasyon potansyèl nan reseptè a GPR17 nan règleman an nan pwosesis metabolik sa yo. Dapre sa a, yon analiz anrichisman jèn ki baze sou ontoloji (ToppGene suite) sou DEG yo te revele chanjman nan "pwosesis metabolik asid monokarboxylic" (GO:{{20}}032787, p- valè: 0.02), pi lwen pase lòt pwosesis ki gen rapò ak devlopman CNS ak metabolis selilè, tankou "règleman nan devlopman sistèm nève" (GO:0051960, p-valè: 0.033) ak "pwosesis metabolik sphingolipid" (GO:0006665, p-valè : 0.043) (Figi 2; lis konplè nan Tablo S2).
Globalman, chanjman sa yo sijere ke GPR17 silansman ka aji kòm yon deklanche pou adrese selil yo nan myelination, pa akor plizyè jèn ki enplike nan règleman transcriptional nan omeyostaz lipid ak glikoz, osi byen ke nan itilizasyon kolestewòl ak lipid pou pwodiksyon myelin.
Figi 1. Yo te itilize zouti analiz chemen entèlijans (IPA, Qiagen) pou analize done yo epi eksplore maladi ak pwosesis byolojik ki prevwa yo ap ogmante oswa diminye dapre modèl jèn yo eksprime diferan nan seri done a. Soti nan analiz sa a, nou ekstrè konplo a nan Figi a ki gen ladan jèn yo ki gen rapò ak sentèz lipid diferan eksprime nan done nou an (p-valè=9.67 × 10−4). Non konplè jèn sa yo, ansanm ak chanjman relatif pliye (rapò log2) yo rapòte nan Tablo S1. Nan wouj, jenere regilasyon; nan jèn vèt, downregulated
Figi 2. Yo te itilize Suite Toppgene pou analiz anrichisman ki baze sou GO sou DEG yo. Foto a montre kèk nan pwosesis byolojik enpòtan ki gen rapò ak sistèm nève santral la ak metabolis selil ki kapab chanje pa GPR17 silans. Ba ble yo endike jèn total ki asosye ak chak tèm; ba wouj yo endike jèn yo an komen ak done nou an pou chak tèm. Lis konplè pwosesis byolojik ki soti nan analiz sa a ak valè p relatif yo rapòte nan Tablo S2.
3.2. Analiz metabolomik pandan diferansyasyon OPC in vitro
Pou evalye korelasyon ki genyen ant ekspresyon GPR17 ak aktivasyon an nan chemen metabolik espesifik, nou fè yon analiz metabolomik nan OPC kiltive pandan spirasyon fizyolojik yo. Yo te kenbe OPC yo nan yon mwayen diferansyasyon epi yo te lysed nan kat pwen tan diferan (apre 0, 1, 3, ak 5 jou nan diferansyasyon, DID), ki koresponn ak diferan etap nan spirasyon OL. An paralèl, pou evalye ke nan tout eksperyans yo spirasyon ki te fèt ak distribisyon espere, OPC yo te kiltive ak tache pou GPR17 ak MBP. Rezilta yo te montre ke kantite GPR17-eksprime selil yo te rive nan maksimòm li yo nan 3 DID ak Lè sa a, tounen nan direksyon nivo fondamantal nan 5 DID, tandiske kantite selil MBP-pozitif ogmante pwogresivman pandan spirasyon (Figi 3a), konsistan avèk rezilta anvan yo [37]. Evalyasyon metabolomik OPC te fèt pa likid chromatografi-tandem mas spèktrometri (LC-MS/MS) jan yo dekri deja [38], konsantre sou metabolit enèjik ki enplike nan glikoliz, chemen an fosfat pentoz, sik Krebs, asid gra -oksidasyon, kofaktè yo. NADH, NAD plis, NADPH, NADP plis, ATP, ADP, AMP, asid amine ak kèk nan dérivés yo. Pwofil metabolomik nan pwen kat tan analize yo rapòte nan Figi 3b. Nan jou 0, nivo plizyè metabolit ki fè pati ak/oswa ki lye ak sik Krebs la (egzanp, succinate, malat, alfa-ketoglutarate, glutamate, aspartate, alanine, ak prolin) te pi wo, jan yo espere nan selil ki vini yo. soti nan yon eta trè pwopagasyon (Figi 3c). Nan etap entèmedyè (ki soti nan DID 1 a 3), OPC yo te montre yon regilasyon make nan molekil ki enplike nan sentèz asid gra ak kolestewòl. An konsekans, nou te obsève nivo ogmante nan asetil-CoA (Figi 3c), ki reprezante précurseur nan kolestewòl ak asid gra ak nan malonyl-CoA, yon entèmedyè espesifik nan sentèz asid gra. Nan DID 5, nou te obsève nivo ogmante nan plizyè acil-carnitines ak asid amine an paralèl ak yon ogmantasyon enpòtan nan glikoz gratis entraselilè (Figi 3c). Nou te obsève tou diminye nivo AMP ak ADP soti nan jou 0 rive nan DID 5 ak yon ogmantasyon pasajè nan ATP ant DID 1 ak DID 3. Done sa yo endike ke, soti nan jou 0 DID 3, ki koresponn ak fenèt la tanporèl pandan ki GPR17 rive nan ekspresyon maksimòm li yo, OPC yo sitou itilize glikoz ak asid amine pou kenbe kolestewòl ak byosentèz asid gra. Nan DID 5, jan ogmante nivo acil-carnitine, OPC yo gen anpil chans konte sou itilizasyon asid gra. Ansanm, done sa yo endike ke pandan diferansyasyon fizyolojik OPCs progresivman rewire metabolis enèjik yo vin matirite myelinating OLs.
3.3. Analiz Metabolomik apre GPR17 Silans pandan OPC Matirite In Vitro
Pou revele kontribisyon reseptè GPR17 la nan kondwi chanjman metabolik enèji ki fèt pandan diferansyasyon selilè yo, nou te fè metabolomik sou GPR17- OPCs silans, an konparezon ak kontwòl OPCs k ap resevwa yon RNA brouye. Nou premye egzamine enpak silans GPR17 sou spirasyon OPC pa tach imunofluoresan pou GPR17 ak MBP. Kòm espere, apre silans reseptè, nou te jwenn yon rediksyon nan GPR17 tach, vizib klèman nan 3 DID. Nou te obsève tou yon ogmantasyon make nan kantite OL ki gen matirite MBP-pozitif nan tou de 3 DID (pa montre) ak 5 DID (Figi S2). An paralèl, analiz detaye qPCR te fèt nan senk fwa pwen (0, 1, 2, 3 ak 5 jou nan diferansyasyon, DID), revele, nan kontwòl OPCs, yon gwo ogmantasyon nan ekspresyon GPR17 apre 1 DID, ki rive nan nivo enpòtan yo kòmanse apre 2 DID, yon ogmantasyon pwogresif nan ekspresyon MBP jiska 5 DID ak yon diminisyon enpòtan nan makè bonè NG2 (Figi 4a). Kontrèman, apre silans GPR17 (Figi 4b), GPR17 mRNA te rive nan nivo ki pi ba nan DID1 ak Lè sa a, rete stab ba, ekspresyon MBP plis ogmante ak NG2 plis diminye. Yon konparezon dirèk nan ekspresyon NG2 ak MBP nan GPR17-silans kont OPC kontwòl nan chak pwen tan yo montre nan Figi 4c. Ansanm, rezilta sa yo sijere ke, nan kondisyon eksperimantal sa yo, GPR17 silans nan OPC akselere pwosesis diferansyasyon yo. Lè sa a, metabolomik OPC te fèt pa LC-MS / MS nan senk pwen yo tan chwazi. Konparezon done metabolomik yo jwenn nan GPR17-silans ak kontwòl OPC yo nan chak pwen tan pèmèt nou idantifye metabolit yo ki afekte siyifikativman pa silans GPR17.
Figi 3. (a) Grafik la montre chanjman nan pousantaj GPR17 plis ak selil MBP plis pandan diferansyasyon. n=3 pou chak gwoup; yon sèl-fason ANOVA ak tès Tukey a. * p < 0.05, ** p < 0.01) (b) Kat chalè a montre abondans metabolit nan chak echantiyon ki sispann nan 0, 1 , 3 oswa 5 te fè. Abondans metabolit yo analize reprezante pa yon echèl kromatik ki soti nan ble fonse (abondans trè ba) rive nan mawon fonse (abondans trè wo). n=4–5 pou chak gwoup. (c) Metabolit ak yon abondans siyifikativman diferan nan mitan kondisyon yo (0, 1, 3 ak 5 jou nan diferansyasyon, DID; yon sèl-fason ANOVA ak tès LSD Fisher a).
Nan DID 1 (Figi 5a), nou pa jwenn chanjman enpòtan. Nan DID 2 (Figi 5b), nou jwenn yon ogmantasyon siyifikatif nan kèk metabolit nan sik Krebs (malat, fumarate sitrat), yon ogmantasyon modès nan karnitin gratis (CO), asetil-karnitin (C2), propionyl-carnitine (C3: 0), butyryl-carnitine (C4:0), valeryl-karnitine (C5:{0), hexadecanoyl-carnitine (C16:{0ak yon rediksyon enpòtan nan glikoz). , laktat, kreatin, ak ornithine.Oilaktat la rediksyon ak kreatin ak ogmantasyon nan propionyl-carnitine (C3) te obsève tou nan DID3 (Figi 5c). Nan DID 5 (Figi 5d), nou toujou jwenn yon ogmantasyon nan karnitin gratis ( CO), asetilkarnitin (C2), propionil-karnitin (C3:0), butiril-karnitin (C4:{{30}}), valeryl-karnitin (C5:0 )tetradecanoyl-carnitine (C14:0), hexadecanoyl-carnitine (C16:0), octadecanoyl-carnitineC18:0), octadecanoyl-carnitine (C18:1), menm jan ak sa ki te obsève orijinal nan plis selil diferansye (gade Figi 3), yon ogmantasyon nan dihydroxyacetone-3-fosfat/gliseraldeyid3-fosfat (DHAP/GAP), fumarate ak sitrat, ak yon diminisyon nan asetil-CoA, Met-SOcreatine, taurin ak kanozin.
Figi 4. Efè silans GPR17 sou spirasyon OPC. Nivo ekspresyon GPR17 (vèt), NG2blue) ak MBP (wouj) te evalye pa PCR an tan reyèl pandan diferansyasyon nan kondisyon kontwòl (selil transfekte ak scramble RNA ak apre silans GPR17 (b), ak nòmalize kont ekspresyon nan T{{ 6}} (mete sou 0). n=6 pou chak pwen tan. ANOVA yon sèl ak tès konparezon miltip Tukey yo (a): ** p < {{10} }.001 VS FÈ 0-2-3-5, @ p < 0.{05 Vs. FÈ 3-5; ## p < 0.01 kont jou 0; SSS p < {{30}}.001 VS. DID{ {21}}; (b): *** p < 0.001 kont DID 0-2-3-5, @@@ p < 0 .001 kont jou 0, # p < 0.05, ### p < 0.001 kont jou 0.S p < 0.05, SS p < 0.01, SSS p < 0.001 V. DID 5. (C) Ekspresyon NG2 ak MBP nan GPR17-silans OPCsvs kontwòl OPCs (mete a 0) nan chak pwen tan. Yo rapòte chanjman pliye (FC) kòm LOG, (FC). Yon echantiyon t-tès, * p < 0.05, * p < 0.01, *** p < 0.001 vs relatif DID nan kontwòl OPCs.
Figi 5. Chanjman metabolomik pwovoke pa silans GPR17 nan OPC yo. (a–d) Abondans chak metabolit apre silans GPR17 te nòmalize nan echantiyon kontwòl relatif la. Chanjman pliye ki te lakòz yo te itilize pou jenere yon trase vòlkan pou chak pwen tan (1, 2, 3, 5 jou nan diferansyasyon). Pwen yo sou liy pwentiye orizontal la reprezante metabolit yo ki te montre yon chanjman estatistik enpòtan (LSD Fisher korije pa FDR; p.adj < 0.1). Nan vèt, metabolit ki gen pi ba ekspresyon, an wouj, sa yo ki gen pi wo ekspresyon, apre GPR17 silans. n=7–9 pou chak gwoup. DID: jou nan diferansyasyon.
3.4. GPR17 Modil Laktat Release pandan OPC Matirite
Dapre rezilta metabolomik ki dekri pi wo a, yo te jwenn silans GPR17 pou diminye nivo laktat intraselilè. Pou evalye si rediksyon sa a reflete yon diminisyon jeneral nan metabolis laktat oswa yon lage ogmante metabolit sa a, nou mezire nivo li yo nan lisat selil yo ak nan medya korespondan yo nan diferan moman. Jan yo montre nan Figi 6, nan kondisyon kontwòl, laktat entraselilè rive nan abondans ki pi wo nan DID 2 (Figi 6a) (lè ekspresyon GPR17 reseptè tou se maksimòm), ak Lè sa a, li redwi lè selil yo te vin matirite. Olye de sa, apre silans GPR17, ogmantasyon nan laktat entraselilè te aboli, ak nivo li yo pi lwen diminye nan direksyon diferansyasyon. Vreman vre, yon konparezon nan nivo laktat nan GPR17-OPCs silans kont OPC kontwòl nan chak pwen tan make yon rediksyon nan nivo li yo nan DID 2 ak 3 (Figi 6b). Laktat ekstraselilè a te swiv diferan sinetik, ki montre yon rediksyon siyifikatif konpare ak DID 1 nan DID 2-3-5 nan kondisyon kontwòl, tandiske nan GPR17-silans OPCs li te rete stab pi wo ak Lè sa a, siyifikativman diminye nan DID 5 (Figi 6c). ). Sepandan, lè w konpare nivo laktat nan diferan moman ant de kondisyon eksperimantal yo, silans GPR17 te anpeche rediksyon fizyolojik la,ogmante prezans laktatnan mwayen an nan DID 2 ak 3 (Figi 6d),sijere yon lage ogmante.
Figi 6. GPR17 silans nan OPCs chanje metabolis laktat. (a) Abondans laktat pandan spirasyon OPC nan kondisyon kontwòl (liy vèt) ak apre silans GPR17 (liy zoranj). n=7–9 pou chak gwoup. ANOVA yon sèl-fason ak tès konparezon miltip Tukey a. * p < 0.05, ** p < 0.01 kont DID2 CTL; §§ p < 0.01, §§§ p < {{30}}.001 kont DID1 siGPR17 (b ) Nivo laktat apre silans GPR17 yo te nòmalize kont echantiyon kontwòl (mete a 1) nan chak pwen tan (n=7-9). ** p <0.01; yon echantiyon t-tès. Medya kondisyone ki soti nan GPR17-silans ak kontwòl OPC yo te kolekte nan menm kilti yo itilize pou analiz metabolomik. Nivo laktat nan medya yo te evalye pa LC-MS/MS. (c) Abondans laktat nan espas ekstraselilè a pandan spirasyon OPC nan kondisyon kontwòl (liy vèt) ak apre silans GPR17 (liy zoranj). ANOVA yon sèl-fason ak tès konparezon miltip Tukey a. ** p <0.01, *** p <0.001 kont DID1 CTL; § p <0.05 kont DID5 siGPR17. (d) Nivo laktat ekstraselilè apre silans GPR17 yo te nòmalize kont echantiyon kontwòl (mete a 1) nan chak pwen tan. * p <0.05; ** p <0.01; yon echantiyon t-tès. Efè anpèchman MCT1 nan kontwòl (e,g) ak GPR17-silans (f,h) OPC yo te evalye lè yo analize ekspresyon MBP, nan echantiyon trete inhibitor kont kontwòl relatif (trete machin) , nan 3 ak 5 jou diferansyasyon. n=6 pou chak gwoup.
Youn nan mekanis yo pa kiOPC yo ka lage laktatse atravè transpòtè monokarboxylate MCT1 la. Anplis, etid resan rapòte ke OPC yo tèt yo ka jwenn laktat ekstraselilè atravè reseptè MCT ki ankouraje sikilasyon selil yo ak diferansyasyon [39]. Kidonk, nou te mande si wi ou non laktat ogmante nan silansman GPR17 ta ka medyatè pa MCT1 epi si sa a ka pasyèlman responsab pou efè a obsève sou spirasyon OPC nan menm kondisyon yo (Figi 4). Pou objektif sa a, nou te trete OPC yo ak AR-C155858, yon inibitè selektif nan MCT1, pandan diferansyasyon nòmal ak apre silans GPR17. Kòm espere, liberasyon laktat te avèk siksè inibe nan tou de kondisyon (Figi S3). Efè anpèchman MCT1 sou spirasyon OPC nan diferan kondisyon eksperimantal yo te evalye lè yo analize nivo ekspresyon MBP yo. Yon rediksyon modès nan ekspresyon jèn nan MBP, ki se tou pre siyifikasyon estatistik (p=0.07), yo te jwenn sèlman nan echantiyon transfekte ak siRNA espesifik pou GPR17 (Figi 6e-h); sepandan, pa gen okenn varyasyon enpòtan parèt nan echantiyon yo transfekte ak RNA kontwòl (siNEG). Rezilta sa yo sijere ke ogmantasyon nan laktat ekstraselilè medyatè pa GPR17 downregulation ankouraje spirasyon nan OPC yo; sepandan, ti limit la nan rediksyon MBP endike ke metabolit sa a se pa faktè a sèlman ki enplike nan pwosesis la.
3.5. Analiz lipidomik apre GPR17 silans pandan OPC Matirite
Rezilta analiz transcriptomic apre silansman GPR17 tou te mete aksan sou yon lyen potansyèl ant fonksyon li yo ak chemen sentetik lipid ak kolestewòl, ki se eleman prensipal yo nan myelin. Pou plis envestige wòl GPR17 nan metabolis lipid, nou aplike LC-MS/MS nan analiz lipidomik nan GPR17-silans OPCs apre 2, 3 ak 5 jou nan diferansyasyon, konpare ak jou 0. Lis lipid yo analize, chanjman relatif pliye ak valè p yo rapòte nan Tablo S4. De klas lipid ki pi abondan nan gwoup eksperimantal yo te asid gra ak fanmi dyacil-fosfatidilkolin (PCaa). Pandan diferansyasyon kontwòl OPC yo, nou pa t jwenn okenn chanjman enpòtan nan abondans nenpòt klas lipid. Olye de sa, GPR17-OPC yo te silans te montre yon tandans pou chanje abondans asid gra gratis, seramid, acil-alkyl-fosfatidilkolin (PCae), ak fosfatidilinositol (PI) konpare ak OPC kontwòl, espesyalman nan DID 3 ak 5, men sèlman diacyl-phosphatidylethanolamine (PEaa) ak sphingomyelin (SM) te montre yon chanjman estatistik enpòtan (Figi 7).
Figi 7. Chanjman nan abondans klas lipidik pwovoke pa silans GPR17 pandan diferansyasyon OPC. Yo rapòte abondans chak klas lipid nan kondisyon kontwòl nan diferan pwen tan (a) Yo te analize sinetik chak klas lipid apre silans GPR17: (b) asid gra, (C) seramid (d) LysoPC (lysophosphatidyl-cholines), (e) LysoPE (lysophosphatidylethanolamines), (f) PCaa (diacil-fosfatidil-kolin), (g) PCae (acyl-alkyl-phosphatidyl-cholines), (h) PEaa (di-acylphosphatidyl-etanolamin), (i) PEae (acil-alkyl-fosfatidil-etanolamin), (i) PI (fosfatidilinositol), (k) PS (fosfatidil-serin), (D SM (esfingomyélin). n=5 pou chak gwoup. Sinetik: De-fason ANOVA ki te swiv pa tès konparezon miltip Tukey a. siGPR17: ANOVA de-fason ki te swiv pa tès konparezon miltip Sidak la. * p.adi < 0.05, ** p.adi < 0.01.
Konparezon done lipidomik yo jwenn nan GPR17-silans ak kontwòl yo nan chak pwen tan pèmèt nou idantifye lipid yo ki te siyifikativman afekte pa silans GPR17. Apre 2 DID, pa gen okenn chanjman enpòtan yo te jwenn (done yo pa montre). Apre 3 DID, diacylphosphatidylcholine (PCaa) C40: 4 te mwens abondan ak diacyl-phosphatidylethanolaminePEaa) C34: 3 te plis abondan nan GPR 17- OPCs silans (Figi 8a). Apre 5 jou diferansyasyon, GPR17 silansman mennen nan plizyè chanjman nan abondans lipid: rediksyon nan plizyè diacyl-PCs ak diacyl-PE ak yon ogmantasyon koncomitan nan plizyè plasmalogens (acyl alkyl-PC) ansanm ak sphingomyelin (SM) C18: 1 ak SM. (OH) C16:1 (Figi 8b). Done sa yo endike ke downregulation nan GPR17 chanje pwofil la lipid nan eleman prensipal la nan myelin kòm PC ak PE.
Figi 8.Chanjman lipidomik pwovoke pa silansman GPR17 nan OPC yo. (a, b) Abondans chak lipid apre silans GPR17 te nòmalize nan echantiyon kontwòl relatif la. Chanjman pliye ki kapab lakòz yo te itilize pou jenere yon trase vòlkan pou chak pwen tan (3, 5 jou nan diferansyasyon). Pwen yo sou liy pwentiye orizontal la reprezante metabolit yo ki te montre yon chanjman estatistik enpòtan (LSD Fisher korije pa FDR; p.adj < 0.1). Nan vèt, lipid ki gen pi ba ekspresyon, an wouj, sa yo ki gen pi wo ekspresyon, apre GPR17 silans. n=5 pou chak gwoup.
Mande plis:
Imèl:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel: plis 86 15292862950
SHOP:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
