Rewiring nan glikoz ak metabolis lipid pwovoke pa G Pwoteyin-makonnen reseptè 17 silans pèmèt tranzisyon an nan progenitors oligodendrocyte nan selil myelinating

Résumé:Nan sistèm nève santral ki gen matirite (CNS), oligodendrocytes (OLs) bay sipò ak izolasyon axons gras a pwodiksyon yon djenn myelin. Pandan spirasyon yo nan selil myelinating, OLsmande enèji ak blòk bilding pou lipid, ki implique yon gwo envestisman nankonbistib enèjiepisous molekilè kabòn. Oligodendroglial G pwoteyin-makonnen reseptè 17 (GPR17) te parèt kòm yon jwè kle nan spirasyon OL; li rive nan ekspresyon maksimòm nan pre-OLs, men Lè sa a, li dwe entènalize pou pèmèt spirasyon tèminal. Nan etid sa a, nou vize pou elisid wòl GPR17 fizyolojik ladownregulation nan metabolis OLlè w aplike transcriptomics, metabolomics, ak lipidomics pou diferansye OLs. Apre silansman GPR17, nou te jwenn yon ogmantasyon siyifikatif nan makè OL ki gen matirite ak chanjman plizyè jèn ki enplike nanmetabolis glikozepibiosentèz lipid. Nou menm tou nou te obsève yon ogmantasyonliberasyon laktat, ki se pasyèlman responsab pou laogmantasyon spirasyonpwovoke paGPR17 downregulation. An menm tan, GPR17 rediksyon tou chanje sinetik yo nan myelin espesifikklas lipid. Globalman, etid sa a revele yon lyen fonksyonèl antekspresyon GPR17, liberasyon laktatepikonpozisyon myelin, ak sijere ke entèvansyon inovatè vize GPR17 ka ede ankouraje myelination andojèn nan maladi demyelinating.

KLIKE LA POU JWENN CISTANCHE KI GENYEN AKANKOVRE MYELINASYON ENDOGENE

Mo kle:selil progenitor oligodendrocyte; oligodendrosit;metabolis enèji; glikoliz; laktat; myelin lipid; transcriptomics;metabolomik; lipidomik; myelination

1. Entwodiksyon

Nan sistèm nève santral la (CNS), oligodendrosit (OL) se selil ki responsab pou pwodiksyon myelin, yon estrikti izolasyon ki karakterize pa yon kontni lipid eksepsyonèlman wo, ki prezève fonksyon axonal ak pèmèt kondiksyon newòn rapid [1]. Fonksyon espesyalize sa yo mande pou selil oligodendrocyte precursor (OPC) sibi yon pwogram diferansyasyon byen òkestre, pandan ke yo pwogresivman chanje metabolis yo epi modifye konpozisyon manbràn plasma yo lè yo fè sentèz lipid myelin tipik [2]. Yon sèl OL ka myelinate jiska 50 axons, ak otan ke 150 kouch manbràn myelin konpakte pou chak segman, kidonk mande pou yon demann enèjik sibstansyèl [3]. Etid en vitro yo te montre ke pousantaj glikoliz kont fosforilasyon oksidatif depann sou etap diferansyasyon OL [4,5], epi sijere ke OL ki fèk pwodwi / OPCs an reta yo se pi vilnerab a anpèchman konplèks I [6]. Anba kondisyon optimal, kiltive OPC apre akouchman ak OL konte sou fosforilasyon oksidatif pou sentèz ATP, pandan y ap OL granmoun preferansyèlman itilize glikoliz [7]. Enteresan, nan prezans yon anviwònman glikoz ki ba, devlopman OL ak myelination ka sipòte pa monokarboxylate, tankou kò ketonn ak laktat, ki gen trafik nan / soti nan selil la mande pou transpò monokarboxylate (MCTs). Nòt, Ichihara ak kòlèg li yo te montre ke laktat te kapab sove monte bisiklèt OPC ak diferansyasyon nan kondisyon ki ba glikoz e ke efè sa a te inibe pa yon inhibiteur transporteur laktat, sijere ke disponiblite laktat pèmèt OL yo kenbe fosforilasyon oksidatif ak sentèz lipid myelin [4] . Diferan klas lipid yo prezan nan manbràn OL ak myelin, ki gen ladan kolestewòl, fosfolipid, ak glikosfingolipid. Malgre ke pa gen okenn espès lipid ki egziste inikman nan myelin, chanjman ki konsistan nan pwopòsyon plizyè espès lipid yo te dekri nan manbràn OL la pandan diferansyasyon [8].

OL yo jwe tou yon wòl aktif ak dinamik nan metabolis newòn [9]. Yo pran glikoz ki soti nan san an epi fè glikoliz pou pwodui piruvat ak laktat, ki answit delivre nan lòj axonal la atravè MCT yo, kidonk pèmèt respirasyon mitokondriyo ak jenerasyon ATP [10].

Pandan diferansyasyon yo, OPC yo enfliyanse pa faktè ekstrèm ki dinamik modil fonksyon yo atravè entèraksyon ak reseptè espesifik [11]. Pami sa yo, G-pwoteyin makonnen reseptè 17 (GPR17) te parèt kòm yon sib remyelinating pwomèt nan paralezi miltip (MS). GPR17 se yon reseptè ki eksprime tanporèman nan OPC yo, ki rive nan nivo maksimòm li yo nan pre-OL nan etap diferansyasyon entèmedyè eksprime makè O4 frelikè a. Ekspresyon pasajè li nesesè pou yon spirasyon OPC alè ak fizyolojik; Vrèmanvre, apre etap O4-pozitif la, reseptè sa a dwe progresivman desann, pou pèmèt spirasyon tèminal ak myelination [12,13]. Nenpòt entèferans ak ekspresyon alè ak fizyolojik sa a lakòz malfonksyònman epi, evantyèlman, nan echèk myelination. Yo te dekri twòp ekspresyon nan GPR17 nan plizyè modèl maladi tankou ischemi nan sèvo [14], de myelination ki pwovoke cuprizone- ak lizolezitin [15,16], kondisyon ki sanble ak alzayme [17], esklewoz lateral amyotwofik [18] ak eksperimantal otoiminitè. ansefalomielit (EAE) [15,19]. Te make GPR17 upregulation ak / oswa akimilasyon nan GPR 17-eksprime selil nan fwontyè a nan blesi demyelinated yo te obsève tou nan pasyan ki afekte pa MS [19,20], blesi twomatik nan sèvo [21] ak leukoencephalopathy konjenital [22]. Nan prezans gwo kondisyon pro-enflamatwa, GPR17-eksprime selil yo akimile nan sit blesi yo, rete kole nan etap entèmedyè epi yo pa kapab kontribye nan remyelination, sijere ke dysregulation nan reseptè desann-règleman kontribye nan echèk remyelination ak maladi. pwogresyon. Malgre done sa yo, evènman molekilè ki konsekan GPR17 downregulation pa te konplètman elisid. Nan nòt, yo panse malfonksyònman metabolik yo jwe yon wòl enpòtan nan mekanis pwogresyon divès maladi neurodegenerative [23], ki gen ladan MS [24-26]. Prezans malfonksyònman metabolik nan MS mande nesesite pou pi byen konprann wòl metabolit byoenèjik ak mekanis ki asosye yo nan reglemante fonksyon OL. Dapre konsiderasyon sa yo, nan etid prezan an, nou vize pou konprann si wi ou non ak ki jan modulasyon GPR17 afekte dirèkteman bioenergetics OL pandan diferansyasyon pa mwayen transkripsyon, metabolit, ak pwofil lipid. Analiz transcriptomic te montre ke GPR17 silans nan diferansye OPC yo ogmante ekspresyon de makè ki gen matirite ak pwovoke chanjman nan plizyè jèn ki enplike nan règleman an transcription nan omeyostazi lipid ak glikoz. Anplis, analiz metabolomik nou an te montre ke, apre GPR17 downregulation, OLs rewire metabolis yo ak ogmante liberasyon an nan laktat, ki ka dirèkteman afekte pwogram nan diferansyasyon OL. Anplis de sa, pa mwayen analiz lipidomik, nou te montre tou ke GPR17 silansman chanje abondans nan myelin espesifik lipid. Ansanm konklizyon sa yo sijere ke GPR17 downregulation nan diferansye OLs pwovoke chanjman nan tou de metabolis enèji ak lipid manbràn ki nesesè pou diferansyasyon yo nan selil matirite myelinating e ke GPR17 vize ka eksplwate pou sove disfonksyon metabolik tipikman ki asosye ak maladi demyelinating.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Animal Care Entènasyonal (lwa Ewopeyen Dir. 2010/63/UE) ak nasyonal (lwa Italyen DL n. 26, 4 Mas 2014) direktiv pou swen ak itilizasyon bèt yo te swiv. Tout pwosedi yo te apwouve pa Ministè Sante Italyen an (5247B.N.L2Y pou MPA). Rat ansent yo te achte nan men Charles River Italia epi yo te loje anba yon 12-h limyè/{12-h fè nwa sik nan 21 ◦C, ak rejim alimantè ak dlo ad libitum, ak anrichisman anviwònman an.

2.2. Rat OPC Izolasyon

Prensipal OPC rat yo te jwenn nan jou apre akouchman 2 (P2) Cortical serebral rat Sprague-Dawley yo mete ansanm jan sa te dekri anvan [27,28]. OPC yo te plake sou poly-D, L-ornithine-kouvwi (konsantrasyon final 50 µg/mL; Sigma-Aldrich, Milan, Itali) asyèt 10 cm (2-4 × 105 selil/kouvèt) pou analiz metabolomik, sou poly-D. , L-ornithine kouvwi 13-mm vè kouvri pou iminositochimi (1–2 × 104 selil/kouvèt), ak sou poly-D, L-ornithine-kouvwi 6-plak byen (7 × 104 selil/ coverslip) pou analiz lipidomik ak qRT-PCR. Selil yo te plake nan yon mwayen Neurobasal complétée ak 2 pousan B27 (Life Technologies, Monza, Itali), 2 mM L-glutamin, 10 ng / mL moun ki sòti nan plakèt faktè kwasans-BB (Sigma-Aldrich, Milan, Itali), ak 10 ng/mL imen debaz faktè kwasans fibroblast (Life Technologies, Monza, Itali) ankouraje pwopagasyon pou 3 jou.

2.3. siRNA Transfection

OPC yo te transfekte imedyatman apre yo te chanje soti nan pwopagasyon nan mwayen diferansye (medyòm Neurobasal complétée ak 2 pousan B27 (Life Technologies, Monza, Itali), 2 mM L-glutamin, ak 15 nM òmòn T3). Sou-sib plis SMARTpool siRNA espesifik pou rat GPR17 transkripsyon (Dharmacon, Lafayette, CO, USA) yo te transfekte nan konsantrasyon final la nan 50 nM ak reyaktif Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies, Monza, Itali), swiv pwotokòl manifakti a. Yo te itilize transfè yon pisin RNA ki pa vize kòm yon kontwòl negatif.

2.4. Transcriptome Profiling ak analiz Microarray

Ekstraksyon RNA ak analiz transcriptome yo te fèt dapre pwotokòl pibliye [27]. Yon ti tan, OPC yo te lysed ak tanpon RLT (Qiagen, Milan, Itali) 2 jou apre transfeksyon siRNA ak RNA total yo te ekstrè pa mwayen RNeasy Micro twous (Qiagen, Milan, Itali), swiv pwotokòl manifakti a. Kalite RNA yo te evalye ak Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Milan, Itali). RNA ak nimewo entegrite RNA (RIN) > 7 te itilize pou analiz microarray. Te gen etikèt cRNA sentèz soti nan 100 ng nan RNA total lè l sèvi avèk Low Input Quick-Amp Labeling Kit la, yon koulè (Agilent Technologies, Milan, Itali) nan prezans Cyanine 3-CTP. Total RNA te hybridized sou SurePrint G3 Rat Gene Expression Microarrays (#G4858A-074036, Agilent Technologies, Milan, Itali). Microarray sa a konsiste de sond ADN 60-mer sentèz in situ, ki reprezante 30,584 transkripsyon rat. Ibridizasyon te fèt nan 65 ◦C pou 17 èdtan nan yon fou wotasyon (Microarray Etablisman, Laboratorio per le Tecnologie delle Terapie Avanzate, LTTA, Ferrara, Itali). Te analiz ekspresyon jèn yon sèl koulè fèt dapre pwosedi manifakti a. Lojisyèl Extraction Feature 10.7.3 (Agilent Technologies, Milan, Itali) te itilize pou jwenn done kri microarray. Yon chanjman pli nan ± 1.5 ak yon FDR-ajiste p-valè <0.07 yo te konsidere jwenn lis la nan jèn diferan eksprime ant de kondisyon eksperimantal yo.

2.5. Analiz byoenfòmatik

Lojisyèl Metacore™ (Clarivate Analytics, London, UK) ak QIAGEN's Ingenuity® Pathway Analysis (IPA®, QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity, jwenn aksè nan dat 14 me 2017) yo te itilize pou fè yon gwoupman ki baze sou chemen an. diferan eksprime jèn apre GPR17 silans nan OPC yo, yo idantifye pwosesis byolojik komen. ToppGene Suite la te itilize pou fè analiz anrichisman ki baze sou ontoloji jèn [29].

2.6. Metabolomik vize ak lipidomik

Done metabolomik yo te jwenn pa likid kwomatografi makonnen ak espektrometri mas tandem (LC-MS/MS), jan sa te dekri deja [30,31], ak kèk modifikasyon ki dekri anba a. Nou te itilize yon espektwomèt mas API-3500 trip quadrupole (AB Sciex, Framingham, MA, USA) makonnen ak yon sistèm AC ExionLC™ (AB Sciex). Selil OPC ki soti nan diferan pwen tan epi oswa transfekte ak siRNA yo te kraze nan yon lazè tisi pou 1 min nan vitès maksimòm nan 250 µL metanol/dlo/acetonitrile frèt 55:25:2{{5{{ 66}}}}. Lysates yo te file nan 15,000× g pou 15 min nan 4 ◦C. Apre sa, echantiyon yo te seche anba N2 parèy nan 40 ◦C epi yo te resispann nan 125 µL MeOH/H20/ACN 55:25:20 pou analiz ki vin apre yo. Kantifikasyon asid amine te fèt atravè derivasyon anvan an. Yon ti tan, 25 µL sou 125 µL echantiyon yo te kolekte epi seche separeman anba koule N2 nan 4{{80}} ◦C. Rezid sèk yo te resispann nan 50 µL nan fenil-isothiocyanate (PITC), EtOH, piridin, ak dlo 5 pousan: 31.5 pousan: 31.5 pousan: 31.5 pousan, ak Lè sa a, enkubasyon pou 20 minit nan RT, seche anba N2 parèy nan 40 ◦C pou 90 min epi finalman resispann nan 1{{1{{1{{1{{1{{110}} 9}}6}}5}}1}}0 µL 5 mM asetat amonyòm nan MeOH/H2O 50:50. Kantifikasyon diferan asid amine yo te fèt lè l sèvi avèk yon kolòn C18 (Biocrates, Innsbruck, Otrich) kenbe nan 50 ◦C. Faz mobil yo pou analiz mòd ion pozitif yo te faz A: 0.2 pousan asid fòmik nan dlo ak faz B: 0.2 pousan asid fòmik nan asetonitrile. Gradyan an te T0: 100 pousan A, T5.5: 5 pousan A, T7: 100 pousan A ak yon pousantaj koule 500 µL/min. Kantifikasyon metabolit enèji ak kofaktè yo te fèt lè l sèvi avèk yon kolòn LUNA cyano-faz (50 mm × 4.6 mm, 5 µm; Phenomenex) pa yon kouri 5.5 min nan mòd iyon negatif ak de kouri separe. Pwotokòl A; faz mobil A te dlo ak faz B te 2 mM asetat amonyòm nan MeOH ak gradyan an te T0: 80 pousan B 0.5 mL / min; T1: 80 pousan B 0.5 mL/min; T1.01: 20 pousan B 0.5 mL/min; T2.0: 20 pousan B 0.5 mL/min; T2.01: 80 pousan B 0.5 mL/min; T5.5: 80 pousan B 0.5 mL/min. Pwotokòl B; faz mobil A te dlo ak faz B te 2 mM asetat amonyòm nan MeOH ak gradyan an te T0: 50 pousan B 0.5 mL / min; T1: 50 pousan B 0.5 mL/min; T1.01: 0 pousan B 0.5 mL/min; T2.0: 0 pousan B 0.5 mL/min; T2.01: 50 pousan B 0.5 mL/min; T5.5: 50 pousan B 0.5 mL/min. Yo te fè quantification Acyl-carnitines sou menm echantiyon yo lè l sèvi avèk yon kolòn C18 (Biocrates, Innsbruck, Otrich) kenbe nan 50 ◦C. Echantiyon yo te analize pa yon kouri 5.5 min nan mòd ion pozitif. Faz mobil yo te A: 0.1 pousan asid fòmik nan H20 B: 0.1 pousan asid fòmik nan MeOH ak gradyan an te T0: 30 pousan B, T0.8: 30 pousan A, T2: 100 pousan B, T3: 100 pousan B, T3 .01: 30 pousan B, T5.5: 30 pousan B ak yon to flflow de 500 µL/min.

Nivo fosfolipid ak asid gra yo te evalye pa mwayen (LC)-MS/MS dapre yon pwotokòl pibliye [32,33] ak kèk modifikasyon ki dekri anba a. Fosfolipid yo te analize nan tou de iyonizasyon negatif ak pozitif sou ekstrè MeOH/H20/ACN atravè yon espektwomèt mas API-4000 trip quadrupole (AB Sciex, Framingham, MA, USA) makonnen ak yon sistèm HPLC (Agilent). ) ak CTC-PAL HTS autosampler (PAL System). Pou analiz iyonizasyon negatif, lipid yo te separe atravè yon kolòn LUNA cyano-faz (50 mm × 4.6 mm, 5 µm; Phenomenex) nan yon kouri 5 minit, ak faz mobil la te 5 mM asetat amonyòm nan MeOH. Pou ionizasyon pozitif la, analit yo te separe sou yon kolòn XTerra RP18 3.5 µm 4.6mm × 100 mm (Dlo) nan yon kouri 8 min, ak faz mobil la te 0.1 pousan asid fòmik nan MeOH. Asid gra gratis yo te analize nan mòd iyon negatif sou yon kolòn Hypersil Gold C8 (Life Technologies) ak yon faz mobil ki gen ladan 10 mM diisopropylethylamine ak 15 mM asid acetic nan H2O/MeOH 97:3. Tout metabolit yo analize nan pwotokòl ki dekri yo te deja valide ak estanda pi bon kalite, eksepte pou fosfolipid, kote sèlman reprezantan sa yo nan diferan klas yo te valide. Lojisyèl MultiQuant™ (vèsyon 3.0.3, AB Sciex) te itilize pou analiz done ak revizyon pik nan kwomatogram. Pou pwosesis done, zòn anvan tout koreksyon yo te nòmalize pa medyàn nan tout zòn metabolit nan menm echantiyon an. Espesyalman, nou defini abondans metabolit relatif la (ma N) kòm:

kote Xn reprezante zòn pik metabolit n pou echantiyon a, b, . . . , z, ak Ma n =1 a reprezante medyàn zòn pik metabolit n pou echantiyon a, b, . . . , z. Lè sa a, done yo te jwenn yo te transfòme pa log10-transfòmasyon ak Pareto echèl pou korije heteroscedasticity, diminye skewness nan done yo epi redwi efè mask [34]. An detay, yo te transfòme valè yo jwenn pa log10 ak Lè sa a, echèl pa metòd Pareto a jan sa a:

kote xi se valè transfòme nan matris done (i (metabolit), j (echantiyon)) ak si se devyasyon estanda valè metabolit transfòme [35]. Valè yo te jwenn yo te konsidere kòm nivo metabolit relatif. Se MetaboAnalyst 5. 0 zouti entènèt [36] ki te fè tretman ak analiz done yo.

2.7. Iminositochimi ak konte selil

Selil yo te fikse nan yon solisyon 4 pousan paraformaldehyde fosfat-tanpon ki gen 4 pousan sikwoz. Yo te itilize antikò prensipal sa yo: lapen anti-GPR17 (1:100; Cayman Chemical), ak rat anti-MBP (1:200; Merck Millipore, Milan, Itali). Enkubasyon antikò prensipal yo te fèt pou 2.5 èdtan nan tanperati chanm oswa lannwit lan nan 4 ◦C. Lè sa a, selil yo te enkube pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak antikò segondè konjige ak swa AlexaFluor 488 oswa AlexaFluor 555 (1: 600; Life Technologies, Monza, Itali). Tout antikò yo te dilye nan yon solisyon bloke fosfat ki gen tanpon (pH 7.4) ki gen 0.3 pousan Triton X-100. Nwayo yo te make ak lank fluorescent UV Hoechst 33258 (1:10, 000; Life Technologies, Monza, Itali). Lè sa a, Coverslips yo te monte nan yon mwayen aliye fluorescent (Dako). Selil pozitif pou makè yo chwazi yo te konte nan 20 jaden o aza pou chak kouvèti (0.07 mm2/Fifield). Rezilta a te eksprime kòm yon pousantaj nan kantite nwayo ak Lè sa a, nòmalize kont kontwòl yo mete nan 100 pousan.

2.8. Tretman ak AR-C155858

Yon jou apre transfeksyon siRNA (jou nan diferansyasyon 1), yo te trete OPC kontwòl ak GPR17-silans ak AR-C155858 (Tocris, UK; konsantrasyon final: 1 µM) oswa machin (0.04 pousan). DMSO). Apre de jou (jou nan diferansyasyon 3), OPC yo te lysed pou analiz RNA ki vin apre oswa trete ankò ak Lè sa a, kolekte nan jou nan diferansyasyon 5.

2.9. Ekstraksyon RNA total, Retrotranscription, ak analiz qPCR

Selil yo te lysed ak Trizol reaktif (Life Technologies, Monza, Itali) nan 1, 2, 3 oswa 5 jou apre transfeksyon. Total RNA te ekstrè lè l sèvi avèk yon twous Direct-zol RNA mikwo-prep (Zymo Research, Almay). Pou analiz ekspresyon jèn yo, yo te fè sentèz cDNA apati de 400-800 ng total de RNA lè l sèvi avèk yon twous sentèz SensiFAST™ cDNA (Bioline, London, UK). Ekspresyon tout jèn yo te analize ak SensiFAST™ SYBR Supermix (Bioline, London, UK) epi nòmalize nan ekspresyon GAPDH lè l sèvi avèk sistèm PCR an tan reyèl CFX96 (Bio-rad, Milan, Itali) swiv pwotokòl manifakti a.

2.10. Analiz estatistik

Done yo prezante kòm mwayen ± SEM epi yo analize ak lojisyèl GraphPad Prism 8.0.1. Pou tout konparezon ant de gwoup ki gen yon distribisyon nòmal, yo te fè tès t Elèv ki pa pè de ke. Yo te itilize Egzamen t Elèv ki gen de-ke pou analiz sou echantiyon imen yo. Pou konparezon miltip nan gwoup ak yon distribisyon nòmal, yon sèl-fason oswa de-fason analiz de divèjans (ANOVA) akonpaye pa Tukey a oswa tès miltip post hoc Sidak la. Sòf si sa presize, p <{9}}.05 te konsidere kòm estatistik enpòtan.

Mande plis:

Imèl:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plis 86 15292862950

SHOP:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop