Transcriptomic yon sèl selil revele entèraksyon selil-selil filtè ren ki deranje apre blesi podosit bonè ak selektif
Jul 01, 2024
Maladi ren kwonik (CKD)afekte 700 milyon moun atravè lemond, ankòspesfiksec terapiyo manke.1 Anpilmaladi ren orijine in nanglorifye, lafikseinite filtraj nan ren an. Glomerulus la konsiste de (i) podosit, selil postmitotik espesyalize ak pwosesis pye elabore ki entèdijite fòme dyafragm fant ak vlope otou kapilè glomerulè yo; (ii) selil endothelial, ki kouche opoze podosit sou yon manbràn sousòl glomerulè pataje (GBM); (iii) selil mezanjyal, ki fòme yon matris ki bay sipò estriktirèl pou glomerulus la; ak (iv) selil epitelyal parietal (PECs), ki liy kapsil Bowman la.2 Blesi podocyte, an patikilye, mennen nan anpil maladi ren pwogresif trè répandus, tankou maladi ren dyabetik (DKD), glomerulosclerosis segmantal fokal (FSGS), ak sendwòm nefrotik (tou de idyopatik ak jenetik). Modèl kanonik nan aksidan rezilta nan pèt nan pwosesis podocyte interdigitating pye, ke yo rekonèt kòm effacement pwosesis pye, ki te koze pa yon rearanjman nan sitoskelèt la actin. Efaseman sa a mennen nan yon dezòd nan dyafram nan fant, baryè fizik la ki fonksyone kòm yonfikselter, ki te swiv pa detachman podocyte oswa lanmò.3,4 Nan lòt men an, nan adisyon a podocytes entak, fòmasyon an ak antretyen nan laglomerulèrfiksebaryè filtrasyonmandekominikasyon intraglomerular, byen kontwole pa yon seri de mekanis siyal otokrin ak parakrin. Pou egzanp, faktè kwasans endothelial vaskilè A (VEGFA) se yon siyal prosurvival pou selil endothelial sekrete pa podocytes, ak faktè kwasans ki sòti nan plakèt B (PDGFB) se yon siyal prosurvival pou selil mesangyal sekrete pa selil endothelial.5 Dezòd entèraksyon selil-selil sa yo souvan obsève nan yon pakèt maladi glomerulè, ki gen ladan FSGS ak DKD.6 Se poutèt sa, idantifye pi bonè chanjman deranje nan glomerulus la ka ofri nouvo objektif ak opòtinite pou optimize siksè terapetik poutretman maladi ren.
NOUVO ZÈB POUTRETMAN MALADI REN
Sipòte pa NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases sibvansyon DK103658, DK099465, ak DK095045 (AG). kominikasyon intraglomerular, byen kontwole pa yon seri de mekanis siyal otokrin ak parakrin. Pa egzanp, faktè kwasans andotelyo vaskilè A (VEGFA) se yon siyal pou siviv pou selil andotelyo podosit yo sekrete, ak faktè kwasans ki sòti nan plakèt B (PDGFB) se yon siyal pou siviv pou selil mezanjyal selil endothelial yo sekrete.5 Dezòd selil sa yo. entèraksyon selil yo souvan obsève nan yon pakèt maladi glomerulaire, ki gen ladan FSGS ak DKD.6 Se poutèt sa, idantifye pi bonè chanjman deranje nan glomerulus la ka ofri nouvo objektif ak opòtinite pou optimize siksè terapetik pou tretman maladi ren.
Sekans RNA yon sèl selil (scRNAseq) te revolusyone kapasite pou etidye kalite selil endividyèl tisi konplèks ak eta selil apre perturbasyon espesifik. echantiyon imen osi byen ke nan kèk eta maladi, ki gen ladan DKD ak nefrit lupus.9e12 Sepandan, etid detaye sou eta selil glomerulè yo te limite pa ti kantite selil ki disponib pou analiz. Anplis de sa, pi bonè chanjman nan kalite selil ki fèt nan tout selil glomerulè sou blesi podosit pa te kontwole epi yo poko defini.
Podocyte ablasyon atravè podocyte-espesifik sipresyon inductible nan yon pwoteyin esansyèl andojèn, CTCF, mennen nan pwogresis maladi ren proteinuric ak CKD. refèr chanjman mekanik sekansyal. Efase CTCF, yon molekil esansyèl andojèn, mennen nan pèt rapid podosit, albuminuri grav pwogresif, chanjman metabolis mineral zo, ensifizans ren, ak lanmò twò bonè. chanjman nan entèraksyon selil-selil intraglomerular kòm yon konsekans blesi podocyte pwovoke. Ekspresyon Podocyte CTCF se endeslabl nan moman ki pi bonè, nan 1 semèn nan endiksyon Cre ki te medyatè nan doxycycline nan iCTCFpod / sourit.13 Pèt podocyte enpòtan ak pwogresif, jan yo mezire pa analiz histolojik, kòmanse nan 2 semèn apre endiksyon Cre. Nan etid aktyèl la, yo te fè yon analiz detaye nan moman 1-semèn nan pou idantifye premye chanjman ki fèt nan entèraksyon selil-selil intraglomerulè ki te lakòz blesi podosit ki finalman mennen nan CKD.
Materyèl ak Metòd
Swen bèt
Etid sa a te apwouve pa Komite pou swen ak itilizasyon bèt nan Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School. Tout etid sou bèt yo te fèt an akò ak direktiv ki etabli ak apwouve pa Komite Swen ak Itilizasyon Animal nan Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School. Sourit iCrepod-Ctcfwt/fl yo te pwodwi jan sa te dekri deja13 ak enbred pou jenere sourit iCrepod-Ctcfwt/fl (iCTCFfl/fL) ak iCrepod-Ctcfwt/wt [wild-type (WT)]. Tou de sourit gason ak fi yo te itilize nan etid sa a. Doxycycline (4 g/L) (Sigma D9891) te kontinyèlman administre nan dlo pou bwè ki gen sikwoz (50 g/L) (VWR BDH0308) nan tou de iCTCFfl/fL (jenere iCTCFpod / sourit) ak sourit kontwòl WT littermate (6 a 8). semèn ki gen laj nan kòmansman itilizasyon doxycycline) pou kondwi ekspresyon Cre espesyalman nan podosit.
Glomerular anrichisman nan ren antye
iCTCFpod / ak sourit WT yo te sakrifye apre 1 semèn nan tretman doxycycline, ak ren yo te byen vit diseke ak lave ak glas-frèt Hanks solisyon sèl balanse (nimewo katalòg 14170112, Thermo Scientific, Waltham, MA). Apre yo fin retire kapsil ren yo, glomeruli yo te anrichi nan 4 C lè l sèvi avèk teknik tamisage14 ak tami 180-mm, 75-mm ak 53-mm. Fraksyon glomerulè anrichi yo te kolekte nan Van 53-mm yo te rense ak 1 solisyon sèl Hanks ekilibre epi yo te mete yo sou glas.
Preparasyon nan sispansyon sèl-selil
Preparasyon Bibliyotèk ak Sekans yon sèl selil
Selil sèl yo te trete atravè platfòm 10 Chromium 30Single Cell lè l sèvi avèk Chromium Single Cell 30Library, Gel Bead, ak Chip Kits (10 Genomics, Pleas Anton, CA), swiv pwotokòl manifakti a. Yon ti tan, 10,000 selil yo te ajoute nan chak chanèl nan yon chip yo dwe divize an pèl jèl nan emulsyon nan enstriman an Chromium, ki te swiv pa liz selil ak kòd bar transcription ranvèse nan RNA nan ti gout yo. Kraze nan emulsyon an te swiv pa anplifikasyon, fwagmantasyon, ak adisyon nan adaptè ak endèks echantiyon. Bibliyotèk yo te mete ansanm ak sekans sou Illumina HiSeq.
Reyaksyon chèn ibridasyon
Tout reyaksyon chèn ibridizasyon (HCR) v3 (sond, epingl, ak tanpon) yo te achte nan men Molecular Technologies (Pasadena, CA). Seksyon mens nan tisi (10 m) yo te monte nan 24-plak anba vè byen (nimewo katalòg 82050-898, VWR, Radnor, PA) kouvwi ak yon 1:5{{38} } dilution (3-aminopropyl)triethoxysilane (nimewo katalòg 440140, Sigma-Aldrich). Solisyon sa yo te ajoute nan tisi a: 10% formalin (nimewo katalòg 100503- 120, VWR) pou 15 minit, de lave nan 1 PBS (nimewo katalòg AM9625, Thermo Fisher Scientific), glas-frèt 70% EtOH nan 20. C pou 2 èdtan (nan lannwit lan), twa lave nan 5 sitrat sodyòm saline ak 0.2% Tween-20 (SSCT) (nimewo katalòg 15557044, Thermo Fisher Scientific), tanpon ibridizasyon (Teknoloji Molekilè) pou 10 minit, sond nan tanpon ibridizasyon lannwit lan, kat lave tanpon lave (Teknoloji Molekilè) pou 15 minit, twa lave 5 SSCT, tanpon anplifikasyon (Teknoloji Molekilè) pou 10 minit, ak twa lave 15 minit ak 5 SSCT (1:10,{31). }} DAPI, nimewo katalòg TCA2412-5MG, VWR) nan dezyèm lave a. Epingl yo te denatire chalè nan tanpon anplifikasyon lannwit lan. Echantiyon yo te estoke ak imaj nan 5 SSCT. Imaging te fèt sou yon konfokal disk k ap vire (Yokogawa W1 sou Nikon Eclipse Ti) opere lojisyèl AR NIS-elements. Analiz ak pwosesis imaj yo te fèt sou ImageJ Fiji lojisyèl vèsyon 2.1.0/1.53c (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij).
Pwosesis done ak kontwòl kalite
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >Yo te retire 75% nan selil ki klase kòm doubt ki gen gwo konfyans nan analiz plis. Selil ki rete yo klase kòm doubt segondè konfyans yo te retire tou nan plis analiz. Analiz la te enplike downsampling kantite selil pou kont pou diferans sa a. Pou egzanp, si te gen mwens selil WT nan yon kalite selil bay, yo te itilize yon echantiyon o aza nan selil iCTCF ki egal a kantite selil WT pou analiz ekspresyon diferans lan.
Clustering san sipèvizyon ak Rediksyon dimansyon
Anviwònman default yo nan Seurat R package16 vèsyon 3.0 yo te itilize pou nòmalizasyon (NormalizeData) nan konte ekspresyon jèn yo, idantifye jèn varyab (FindVariableGenes), jwenn lankr entegrasyon (FindIntegrationAnchors), ak entegre echantiyon yo (IntegrationData) . Varyasyon endezirab te fèt akòz kantite UMI ak rapò kat lekti ak jèn mitokondriyo (ScaleData). Yo te fè rediksyon dimansyon lè l sèvi avèk analiz eleman prensipal yo (RunPCA) sou jèn yo trè varyab. Yo te itilize fonksyon PCElbowPlot() pou fè distenksyon ant eleman prensipal yo pou plis analiz. Pou gwoupe tout selil yo, premye 40 eleman prensipal yo ase te kaptire tout divèjans la. Yo te idantifye grap distenk molekilè lè l sèvi avèk paramèt default yo (FindClusters) ak yon rezolisyon 0.4 (FindNeighbors). Done yo te trete ak echèl jan sa dekri pi wo a apre yo fin mete selil glomerulè yo. Yo te itilize yon total de 30 eleman prensipal pou gwoupman en nan yon rezolisyon 0.3 (FindNeighbors).
Klasifikasyon Kalite Selil
Yo te kalkile jèn ki anrichi grap oswa makè lè l sèvi avèk tès sòm ran Wilcoxon (FindAllMarkers) pou ekspresyon diferan nan jèn nan selil grap yo kont tout lòt selil yo epi chwazi jèn sa yo ki pase valè P ajiste (pousantaj dekouvèt fo) nan {{1. }}.05 kòm reprezantan gwoup. Yo te bay idantite gwoup la lè yo konpare jèn ki baze sou done ak yon lis jèn ki gen literati pou kalite selil ren ki gen matirite.
Analiz ekspresyon jenetik diferans
Yo te itilize analiz ekspresyon diferans nan Seurat (FindMarkers) ak papòt chanjman pliye boutèy la mete sou {{0}}.01 ak paramèt default pou analize ekspresyon diferans ant iCTCFpod / ak selil WT nan yon gwoup espesifik. Nan FindMarkers, ident.1 yo te mete sou clusterspecific iCTCFpod / selil yo, epi ident.2 te mete sou selil WT ki koresponn ak gwoup espesifik yo. Jèn ak yon P ajiste <0.05 yo te konsidere kòm enpòtan.
Analiz surreprezantasyon
Yo te itilize analiz de surreprezantasyon pou detèmine si nenpòt fonksyon byolojik oswa pwosesis li te ye yo te surreprezante oswa anrichi nan lis jèn ki eksprime diferan.17 R package clusterProfiler,18 espesyalman fonksyon enrichGO a, te itilize pou analiz surreprezantasyon an. Yo te itilize paramèt default yo, ak eksepsyon de ont Z BP, pvaluecutoff Z 0.25, ak qvaluecutoff Z 0.25. Lè sa a, yo te itilize R package enrichplot (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot, dènye aksè 30 Out 2021), espesyalman fonksyon emapplot la, pou visualiser rezilta anrichisman yo lè w trase tèm anrichisman an tèt yo.
Analiz reseptè ligand
iTALK19 te itilize pou kat reseptè ligand ki te eksprime diferan nan iCTCFpod / podocytes. Espesyalman, rawParse te itilize pou kalkile ekspresyon an mwayèn nan chak jèn, lè l sèvi avèk done echèl ki soti nan Seurat. FindLR itilize datatype Z meancount te itilize pou idantifye pè ligand ak reseptè. Ligand ak pè enterè reseptè yo te trase lè l sèvi avèk paramèt default nan LRPlot. Epesè liy yo endike ekspresyon relatif an mwayèn nan ligand la, ak gwosè a nan pwent flèch la endike ekspresyon relatif la vle di nan reseptè a.
NicheNet analiz
Pake R NicheNet20 yo te itilize pou predi entèraksyon ligandreceptor ki ta ka mennen chanjman nan ekspresyon jèn nan kalite selil enterè a. Tout grap podocyte ak tout grap andothelial yo te konbine pou analiz sa a. Tout paramèt default yo te itilize eksepte pou yo tabli yon papòt pi ba 0.11 pou prepare_ligand_sib_vizyalizasyon. Yo te trete imaj HCR ak Quantification yo lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ2 (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij). Pou fichye ImageJ, yo te itilize vèsyon 2.1.0/1.53c (http://imagej.net/ Contributors (dènye aksè 2 Out 2020). Yo te soustraksyon background anvan tout koreksyon fichye ND2 lè l sèvi avèk metòd Rolling Ball (woule Z 50 glisman pile) Lè sa a, yo te pwojte entansite mwayèn nan imaj Z-pile yo, epi yo te divize chanèl imaj yo epi yo te sove CellProfiler vèsyon 3.1.5 (Broad Institute of MIT ak Harvard, Cambridge, MA)21 pou segmentasyon selil ki baze sou entansite fluoresans la. nan chanèl DAPI ak pou mezire entansite fluoresans nan rès chanèl yo te evalye Kat WT ak kat iCTCFpod / sourit pou analiz estatistik tout glomeruli soti nan twa 40 imaj yo te fè yon tès Welch-korije.
Sèvis sipò Wecistanche-Pi gwo ekspòtatè cistanche nan Lachin nan:
Imèl:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Achte pou plis detay espesifikasyon:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-boutik
KLIKE LA POU JWENN ÒGANIK NATIRÈL ÈKSTRÈ CISTANCHE AK 25% ECHINACOSIDE AK 9% ACTEOSIDE POU Fonksyon ren.
