Stx2 pwovoke ekspresyon jenetik diferans epi deranje jèn ritm sirkadyèn nan tubul pwoksimal Ⅱ

3. Diskisyon

3.1. Patoloji Echafodaj Proksimal la nan Pasyan STEC ak Modèl Animal

Oliguria se yon siy deegi nekwoz tubulaires(ATN). Akòz ATN, selil epitelyal ki dekonpoze yo obstrue lumèn tubul yo pou diminye koule likid ki parèt tankou oliguria. Nan pasyan STEC, oliguria ak anuria yo souvan jwenn ki sijere ATN. Rediksyon nan fonksyon tib proximal la pandan premye etap STEC maladi enfektye yo te montre kòm ogmantasyon nan 2MG urin ak NAG [3,33]. B2MG se yon ti pwoteyin 12 kDa ki filtre libreman nan glomeruli epi ki konplètman absòbe tubul proximal yo nan yon eta an sante. Sepandan, yon fwa tib proximal yo domaje, kantite 2MG nan pipi ogmante konsa sèvi kòm yon biomarker pou fonksyon proximal tubulaires. NAG se yon gwo anzim lizozomal ki gen 130 kDa ak pi gwo glikozidaz nan tubul proximal la. Akòz gwo gwosè a, glomerulus la pa ka filtre NAG tandiske tubul proximal domaje sekrete NAG nan pipi a. Kidonk, yon ogmantasyon nan NAG urin se yon lòt biomarker pou domaj tubulaires proximal. Glomerulè istopatoloji tankou fibrin-obstrue kapilè se yon konklizyon souvan nan pasyan STEC; sepandan, done pipi ki anwo yo sijere domaj proximal tubulaires nan maladi a pi bonè. Epitou, pipi ki soti nan pasyan STEC yo gen jete ki fòme ak epithelium Echafodaj ki se yon rezilta nan sloughing nan selil ki domaje tubulaires proximal [1]. Nan modèl bèt yo, yo souvan jwenn dekonpozisyon selil tubulèr proximal yo tou de nan enfeksyon STEC ak modèl piki Stx [25-27,34]. Nan etid aktyèl la, nou te jwenn sloughing nan selil tubulaires proximal yo nan Stx2-enjekte ren murin ki sijere Stx2-pwovoke chanjman tubulaires proximal (Figi 1). Epitou, nou detekte Stx2 reseptè Gb3 nan tou de sourit aktubul proximal ren imenak ekspresyon bò luminal ki endike yon entèraksyon dirèk Stx2 ak tib proximal yo (Figi 2 ak 3). PDK4 fosforil pyruvate dehydrogenase pou anpeche aktivite li yo, sa ki lakòz yon diminisyon nan itilizasyon glikoz ak yon ogmantasyon nan metabolis grès an repons a jèn pwolonje ak grangou. Li pwoteje selil epitelyal ki detache kont lanmò selil ki pwovoke detachman (anoikis) [35]. PDK4 okòmansman te gen yon pik nan 4 h, Lè sa a, yon lòt pik nan 8 h (Figi 5A). Li te redwi nan 12 h, men apati de la li te gen yon ogmantasyon gradyèl jiska 72 h ak yon log2-pliye chanjman epi li te fini ak 3 (12-pliye chanjman) (Figi 5A). Detachman nan selil epitelyal ki te fèt nan Stx2-silil tubulaires sourit proximal (sloughing) ak mòfoloji relativman entak (Figi 1), sa ka reflete regilasyon PDK4.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT POUD POU REN

Kòm NHERF1 (SLC9A3R1) kontribye nan aderans selil nòmal nan matris la ekstraselilè [36], òganizasyon sitoskelèt aktin, ak kenbe mòfoloji selilè, bese ekspresyon jèn sa a ka gen konsekans tankou sloughing nan selil (Figi 5K).

Efè Stx2 sou tubul proximal yo sanble yon faktè enpòtan pou STEC maladi enfeksyon; sepandan, chanjman nan ekspresyon jèn ki konsantre sou in vivo selil tubulaires proximal pa t disponib anvan. Keepers et al. [37] te montre jèn ki eksprime diferansye (DEG) nan ren sourit ki te enjekte Stx2+LPS konsa ke pi fò nan jèn yo pi bonè ak lajman chanje yo te soti nan enfliyans LPS ak jèn ki te chanje trè ta soti nan efè Stx2. . Done yo te montre bonjan insight sou ekspresyon jèn diferans nan ren an, men yo pa t separe kalite selil ki responsab chanjman sa a. Nan etid aktyèl la, nou te eseye chèche DEG ki asosye ak selil tubulaires proximal yo lè nou konpare done mikwo-array ki soti nan sourit.ren ak imen prensipal tubulaire proximalselil ki te trete ak Stx2.

3.2. Faktè Proximal Echafodaj ki enplike nan Stx2-patoloji pwovoke an relasyon ak aktivite Stx2 li te ye nan selil ki eksprime Gb3

3.2.1. Aktivite (I), Transduction siyal pwovoke pa Stxs Liaison pou Gb3

B sous-inite Stxs pwovoke ki pa reseptè src tirozin kinaz Wi fosforilasyon [4]. Phosphorylated Wi aktive molekil siyal en pa aktivite kinaz li yo ak mennen nan renovasyon sitoskelèt [5]. Wi-asosye pwoteyin (YAP) fosforilasyon nan Y357 pa Wi yo li te ye pou pwovoke YAP nikleyè translokasyon kote li aji kòm yon ko-activator transcriptional pwovoke jèn sib tankou CTGF [38]. Pwoteyin matriselilè CYR61 (CCN1) ak CTGF (CCN2) yo sekrete nan matris ekstraselilè (ECM) epi kontribye nan kenbe adezyon selil-ECM pa lye entegrin reseptè yo ak pwoteoglikan silfat heparan (HSPGs) [39,40]. Molekil kle nan CCN1 ak 2 transkripsyon se YAP, epi li kenbe inaktif (fosforile nan rezidi serin 127) nan yon eta nòmal anba chemen an siyal Hippo. Yon fwa yo detekte adezyon selil-selil ki ba, YAP (S127) pa fosforil ankò ki pèmèt li antre nan nwayo a, ak transkripsyon CCN1 ak 2 ogmante [41-43]. CCN1 ak 2 aji kòm molekil geri blesi pou repare tisi selil ki pèdi [38,44]. Nan seri done nou an, CCN1 ak 2 te gen ti pik nan yon pwen tan pi bonè (6 h). Sa a ka reflete Stx2 obligatwa-induit deklanchman Wi. Pita èdtan, sloughing ka deklanche plis deklanchman YAP lè yo chanje chemen siyal Hippo a pou pwovoke pi gwo ekspresyon CCN1 ak 2 nan 12 èdtan oswa pita (Figi 5C).

3.2.2. Aktivite (II), Pwovoke ER-Estrès/UPR

Stxs rive nan ER a, kote fragments A1 klivaj ak subinite B imite pwoteyin depliye [9,10,45,46]. Pwoteyin 78 kDa ki reglemante ak glikoz (Grp78, pwoteyin imunoglobulin obligatwa (Bip)) ancrage twa pwoteyin kle UPR, anzim ki mande pou inositol -1 (Ire{-1), pwoteyin kinaz R-tankou retikul endoplasmik kinaz (PERK). ) ak aktive transkripsyon faktè 6 (ATF6) nan manbràn ER pandan eta nòmal. Sepandan, akòz pi gwo afinite nan Grp78 nan pwoteyin depliye, li degaje pwoteyin ancrage sa yo. ATF6 aktive apre liberasyon an epi li ogmante CHOP (DDIT3) ak X-box binding protein 1 (XBP-1) mR NAs, tandiske Ire-1 épissure XBP-1 mRNA pou pwodui XBP{{ 22}} pwoteyin, ki kontribye nan transcription CHOP (DDIT3). Aktivasyon PERK mennen nan aktivasyon ATF4 ki ogmante tou mRNA CHOP (DDIT3). Se poutèt sa, yon ogmantasyon nan mRNA CHOP (DDIT3) se yon karakteristik nan UPR [47,48]. Yo rapòte Stxs yo pwovoke UPR ak CHOP (DDIT3) regilasyon nan seri done nou an (Figi 5D-G).

GDF15 fè pati fanmi transfòmasyon faktè kwasans beta (TGF). Dènyèman, yo montre GDF15 medyatè dwòg dyabetik metformin-induit pèdi pwa [49]. Nan sourit metformin ki te administre oralman, entesten ak ren GDF15 mRNA te ogmante sa ki lakòz yon elevasyon nan GDF15 serom. GDF15 sikile travay atravè yon reseptè ki limite nan sèvo a pou siprime konsomasyon manje ak diminye pwa kò [50]. Nan sourit metformin yo, ogmante GDF15 nan ren se omwen an pati anba règleman CHOP (DDIT3). Nan seri done nou an sou ren sourit ki enjekte Stx2-, CHOP (DDIT3) te ogmante okòmansman nan 4 èdtan ak yon pik trè piti epi answit te kòmanse gen yon tandans ogmante nan direksyon 48 èdtan kote li te kenbe nivo yon boutèy demi lit{{16}. }}pliye chanjman alantou 1.3 (Figi 5E). Dapre analiz gwoup STRING, GDF15 resevwa opinyon aktif nan faktè transcription CHOP (DDIT3) ak ATF3 (Figi 5E) [51,52]. Pwa murin Stx2-piki a te kòmanse diminye oswa devye de kontwòl saline apre 24 èdtan (Figi S3B). Yon ogmantasyon nan GDF15 mRNA nan ren an nan 12 èdtan ka te enfliyanse tij sèvo a diminye konsomasyon manje, ki an vire parèt kòm yon pèdi pwa (Figi 5E ak S3B). Kòm nivo ekspresyon GDF15 kontinye wo apre 24 èdtan, sourit yo kontinye pèdi pwa (Figi 5E ak S3B).

Lè ER-estrès, PERK lage nan Grp78 (Bip) epi li oligomerize nan fosforil ak anpeche eIF2 ki mennen nan represyon tradiksyon mondyal, eksepte pou kèk pwoteyin ki reponn UPR tankou ATF4, CHOP, ak Grp78. GADD34 (pwoteyin fosfataz 1 regilasyon sou-inite 15A (PPP1R15A)) se youn nan pwoteyin yo ogmante anba fosforilasyon eIF2 (eIF2 (P))-asosye anpèchman ak upregulated nan dataset nou an (Figi 5D, G). GADD34 se yon fosfataz pwoteyin -1 ki dephosphorylate eIF2 (P) pou kontwole negatif UPR-induit anpèchman sentèz pwoteyin [53]. Ekspresyon GADD34 (PPP1R15A) vin yon chanjman ki pi gwo pase 1 apre 12 èdtan Stx2 nan seri done nou an epi li kontinye ap ogmante jiska 24 èdtan lè li plat (chanjman lòg2-pliye egal a 2.1) epi li kenbe sa a. nivo jouk nan fen (Figi 5D, G). Sa sijere ke Stx2-pwovoke UPR te gen fidbak negatif apre 12 èdtan. Ogmantasyon transkripsyon ak tradiksyon CHOP (DDIT3, GADD153) se yon karakteristik nan ER-estrès ak modèl ekspresyon diferans lan sanble ak GADD34 eksepte log2 pi gwo pase 1 rive apre 24 èdtan epi piti piti plato apre sa (log2 egal 1.3) (Figi 5D, G). Epitou, CEBPB, patnè dimerizing dominan nan CHOP, se upregulated nan dataset nou an (Figi 5D, G). Rezilta sa yo sijere ke pandan ke Stx2-pwovoke estrès ER kòmanse depi byen bonè nan kou tan an, li ogmante efè a jiska 24 èdtan epi li kenbe nivo sa a nan estrès ER jouk nan fen pandan yon bra fidbak negatif tou balanse tèt li ansanm.

3.2.3. Aktivite (III), Ribosome Inactivating Pwoteyin (RIP) Aktivite

Lè w koupe yon adenin ki soti nan rRNA, Stxs anpeche sentèz pwoteyin de novo. Depurinated rRNA enfliyanse chanjman nan mòfoloji ribosomal, ki aktive transdiksyon siyal [11] ke yo rekonèt kòm yon repons estrès ribotoksik (RSR), ki mennen nan deklanchman jèn karakteristik (gade pwochen paragraf).

3.2.4. Aktivite (IV), Aktivite ribotoksik estrès repons (RSR).

ZAK (yon MAPKKK) se kinaz li te ye nan RSR ak aktive en JUN N tèminal kinase (JNK) ak p38 MAPK chemen [12,15]. Stx1 pwovoke ekspresyon mRNA JUN ak FOS nan selil epitelyal entesten imen ak evènman sa a te mande pou aktivite RIP pozitif Stx1 ke li panse yo dwe anba kontwòl RSR [15]. Yon lòt molekil RSR en, p38 MAPK, li te ye pou pwovoke jèn repons bonè tankou JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 ak ATF3 [54], yo tout yo te eksprime diferan nan dataset nou an. Yo konnen tou chemen JNK ak p38 MAPK yo aktive evènman en Ire-1 anba UPR (Figi 4B,D ak 5B,E,F) [47]. Akòz sa, Stxs ka aktive de chemen sa yo atravè RSR ak/oswa UPR. Chemen 1/2 kinaz siyal-regleman ekstraselilè (ERK) tou montre yo dwe en RSR [55] ak jèn DUSP1 (MKP1) li te ye pou pwovoke pa chemen ERK1/2 [56]. Stx1 ak anisomycin (yon lòt inibitè sentèz pwoteyin) yo kapab pwovoke ekspresyon DUSP1 nan selil Caco-2 [57]. Nan seri done nou an, ekspresyon DUSP1 te pwovoke e sa ka endike aktivasyon ERK1/2 (Figi 4B, D).

3.2.5. Aktivite (V), Transcription Gene patikilye ki mennen nan Cytokine

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 apre 24 ak 48 h, respektivman (Figi 5F). Sa a sijere jèn chapo anba tou de chemen NF-κB, IκB (klasik) ak RelB (altènatif), yo pwovoke. Kòm ekspresyon diferans CHOP (DDIT3) depase log2 pi gwo pase 1 apre 24 èdtan, ren sourit sibi UPR, kidonk aktive PERK fosforil ekaryotik tradiksyon inisyasyon faktè 2 subunit alfa (eIF2) pou anpeche tradiksyon NFKBIA [60]. Pou rezon sa a, yon ogmantasyon nan mRNA NFKBIA pa ka anpeche anpil nan chemen NF-κB, kidonk transkripsyon faktè enflamatwa yo pèmèt (Figi 5L).

Sobbe et al. [61] te montre ke tou de klasik (RelA-p50) ak altènatif (RelB-p52) NF-κB chemen yo te aktif nan sourit Stx-enjekte detekte upregulation nan RelA-sib sitokin CCL20, CXCL1 ak CXCL10 ki te tou diferan eksprime nan nou an. dataset (Figi 5L).

3.2.6. Aktivite (VI), Stxs-induit Apoptosis

Yo te jwenn kaspase 3 clivé nan lanmò selil ki asosye ak Stxs [13,15,62]. Li te montre ke kaspase-3 aktivasyon oswa endiksyon apoptoz pa Stxs rive nan kontèks RSR ak UPR. Nan RSR Stxs-induced, tou de p38 MAPK ak JNK chemen yo enplike [15] osi byen ke aktivasyon ERK rapòte [55]. UPR sou lòt men an konnen yo pwovoke NF-κB, JNK ak p38 MAPK chemen. CHOP (DDIT3) anba UPR montre yo patisipe nan apoptoz [63] epi li te montre tou nan apoptoz ki asosye ak Stxs [13]. Patisipasyon JNK nan apoptoz pwovoke UPR yo te rapòte tou [64]. Nan seri done nou an, plizyè DEG tankou CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN, ak JUNB patisipe nan RSR ak UPR (Figi 5B, F).

3.3. Sirkadyen Disregulation pa Stx2

Yon ogmantasyon nan endothelin serik-1 (ET-1, EDN1) rive nan pasyan STEC-HUS [65]. Epitou, eksperimantal, Stx2 pwovoke ekspresyon EDN1 pa aktive kaskad transdiksyon siyal ki enplike MAPKs [66], pandan y ap UPR yo li te ye pou pwovoke transcription EDN1 [67]. Nan seri done nou an, ekspresyon EDN1 tretman Stx2 pwovoke nan tou de ren sourit ak selil proximal moun tubulaires (Figi 5G). Kòm ekspresyon jèn EDN1 se te yon denominatè komen nan ren sourit ak selil epitelyal proximal imen, li montre ekspresyon EDN1 rive, omwen an pati, nan selil epitelyal proximal tubulaires yo nan vivo anplis selil andotelyo. Epitou, ET-1 sekrete pwovoke ekspresyon EGR1 atravè aktivasyon MAPK [68]. Done nou yo konfime regilasyon an nan EGR1 nan distribisyon lè EDN1 se upregulated (Figi 5H). EGR1 pwovoke ritm sirkadyèn faktè kle PER1 ekspresyon [69], kidonk, ajiste anplitid la nan lòt faktè sirkadyèn (Figi 5H).

Nan règleman sirkadyèn, heterodimer CLOCK-BAML1 (ARNTL) kontwole PER1 ak CRY1. An retou, PER1-CRY1 heterodimer mare ak CLOCK-BAML1 (ARNTL) pou siprime plis transkripsyon pa yo, kidonk fè yon bouk negatif nan ritm sirkadyèn nan. Kidonk, pik ekspresyon jèn regilatè pozitif (CLOCK ak BAML1 (ARNTL)) ak jèn regilatè negatif (PER1 ak CRY1) rive nan yon lòt lè lè CLOCK ak BAML1 (ARNTL) gen yon ogmantasyon nan ekspresyon, PER1 ak CRY1 diminye, ak modèl la chanje nan èdtan apre yo. Lè nou te ajoute valè revèy 2-pliye chanjman nan CLOCK ak BAML1 (ARNTL) nan graf la (Figi 5J), pandan pwen tan ki pi bonè yo, PER1 ak BAML1 (ARNTL) te montre yon modèl ritm opoze ak pik byen file/etwat, sepandan, apre 24 èdtan pik yo te kòmanse vin mat ak kontinyèlman ogmante san yo pa ritm. Sa a implique ke Stx2 te enfliyanse ritm sirkadyèn ren ki gen ladan tib proximal yo. Malgre ke yon eksperyans konfimasyon plis nesesè, done nou yo konbine avèk literati pibliye ki dekri efè PER1 sou règleman sirkadyèn ren sou stimuli [70,71], sijere posib Stx2 patisipasyon nan twoub ritm sirkadyèn ak efè sou fonksyon proximal tubulaires pa diminye jèn revèy ren-. faktè reglemante tankou SGLT1 (SLC5A1) (Figi 5K). Vreman vre, nou te obsève glikozuri nan sourit Stx2-ki repwodui nan yon lòt etid ak sourit Stx1-piki [21] ki endike SGLT1 (SLC5A1) malfonksyònman nan tib proximal yo (Tablo 3). Dapre sa nou konnen, sa a se premye rapò ki endike patisipasyon Stx2 nan twoub ritm sirkadyèn ren.

4. Konklizyon

Nou detèmine jèn enpòtan konsènan ekspresyon proximal ki asosye ak tibil ki te chanje pa Stx2. Ekspresyon diferan nan jèn sa yo sipoze se rezilta aktivite Stx2 tankou endiksyon UPR, RSR ki asosye ak depurinasyon rRNA, ak transdiksyon siyal pwovoke pa reseptè plasma manbràn Gb3 obligatwa. Jèn ki pi eksprime a, GDF15, ka enfliyanse pèdi pwa ki te koze pa Stx2 atravè reseptè sèvo-tij restriksyon nan diminye konsomasyon manje. Matris ekstraselilè ak adezyon selil yo ka enfliyanse pa PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61, ak CTGF ki lakòz istopatoloji espesifik Stx2-, ak sloughing. Anplis, twoub nan ritm sirkadyèn nan ren pa Stx2 ka lakòz defo fonksyonèl proximal tubulaires tankou reabsorption glikoz.

5. Materyèl ak Metòd

5.1. Sourit Bèt

(C57BL/6, gason, 19-22 g, espesifik patojèn san) yo te achte nan men Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japon). Yo te bay manje ak dlo ad libitum. Sourit yo te kenbe ak yon estanda 12 h: 12 h limyè-fè nwa sik nan ki limyè a limen a 7 am ak koupe nan 7 pm Tanperati chanm bèt yo te kenbe alantou 24 ◦C. Tout pwosedi yo te apwouve pa Komite Swen Animal University.

5.2. Tisi ren imen

Tisi kadav san okenn idantifyan pèsonèl yo te itilize nan etid sa a, epi li konsidere kòm egzante pa direktiv yo envestigasyon imen nan Inivèsite a.

5.3. Kilti Selil

Selil epitelyal proximal tubulaires ren imen (RPTEC) te achte nan men Clonetics (Walkersville, MD, USA) epi kenbe nan 37 ◦C, 5% CO2 atmosfè. Selil yo te kiltive nan yon mwayen kwasans selil epitelyal ren ki te konplete ak faktè kwasans epidèm imen, idrokortizon, epinephrine, ensilin, tri-yodotironin, transferin, GA-1000, ak FBS.

5.4. Pirifikasyon nan LPS-Free Stx2 LPS retire nan Stx2 te fèt jan sa dekri deja [72]. Yon ti tan, yo te itilize kolòn anti-Stx2 11E1{0 antikò konjige pou jwenn fraksyon Stx2, epi yo te pase fraksyon nan Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) pou retire LPS. Fraksyon Stx2 te filtre ak yon filtè 0.2 µm ak nivo LPS yo te teste ak Limulus amebocyte lysate assay (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, USA). Fraksyon Stx2 te detèmine kòm li gen mwens pase 0.03 inite endotoxin (EU)/mL. Kalite variant Stx2 te Stx2a.

5.5. Administrasyon Stx2 nan sourit Yon dòz 2LD50 (5 ng Stx2/20 g pwa kò), ki touye sourit nan kat jou (Figi S3A), yo te enjekte nan sourit nan yon volim nan 0.1 mL nan saline san LPS. (Otsuka pharmaceutique, Japon). Piki toksin yo te fè ant 7 ak 9 am, nan ki sourit tan ki pi long yo te resevwa Stx2 a 7 am epi ki te swiv pa echantiyon 24, 48 ak 72 èdtan nan 7 am.

5.6. Koleksyon pipi ak mezi glikoz nan pipi Apre 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60, ak 84 èdtan nan piki Stx2, yo te pran pipi ak 10 µL yo te tonbe sou Fuji sèk chem glise GLU- P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japon) ak glikoz nan pipi te mezire ak Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) nan etablisman an jere pa. Yo te itilize pipi ki soti nan piki pre-Stx2 kòm echantiyon 0 h. Yo te fè koleksyon pipi ak de sourit

5.7. Pwosesis tisi Apre 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, ak 72 èdtan nan piki Stx2, twa sourit pou chak pwen tan yo te euthanized pa CO2, ak ren yo te kolekte. Mwatye nan yon ren te fikse ak 4% paraformaldehyde/phosphate-tampon saline pou 7 jou nan 4 ◦C ak trete pou seksyon parafine. Yon lòt mwatye nan ren yo te itilize pou ekstrè RNA pou analiz microarray. Yo te itilize twa sourit san okenn tretman kòm kontwòl nòmal (nayif oswa 0 h). Twa sourit yo te sou fòm piki ak PBS (machin) epi yo te sakrifye nan 72 èdtan epi yo te sèvi kòm kontwòl machin pou montre gen chanjman neglijab nan ekspresyon jèn konpare ak kontwòl nòmal.

5.8. Peryodik Asid-Schiff (PAS) Stain Paraffin seksyon yo te idrate ak tache ak 0.5% solisyon asid peryodik, ki te swiv pa yon rense ak dlo distile. Seksyon yo te transfere nan reyaktif Schiff. Apre seksyon yo te lave ak 0.6% solisyon bisulfite sodyòm byen, yo te counterstained ak ematoksilin.

5.9. Tretman Stx2 nan selil imen RPTEC RPTEC yo te trete ak 10 ng/mL Stx2 pou 6, 13 ak 19 èdtan anba 37 ◦C, 5% CO2. RPTEC san tretman Stx2 te itilize kòm yon kontwòl. Yo te fè de kopi byolojik pou chak pwen tan. Apre lave ak PBS, selil yo te itilize pou fè ekstraksyon RNA.

5.10. Free-floating Immunofluorescence Staining Pou pwosesis seksyon k ap flote gratis, yon sourit nòmal te perfused-fixed jan sa dekri nan Obata et al. [69]. Lè sa a, ren murin yo te diseke ak benyen nan 4% PFA / PBS pou 3 èdtan nan 4 ◦C ak ajitasyon dou. Tisi yo te lave ak PBS, epi kriyopwoteje ak 30% sikwoz/PBS nan 4 ◦C lannwit lan oswa jiskaske yo desann nan fon an. Seksyon epè nan frizè (50 µm) yo te koupe ak mikrotom glisman ak anviwònman jele. Seksyon yo te bloke ak 1:50 antikò kabrit anti-rat IgM nan PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, USA) pou 1 èdtan ak enkubasyon ak anti-Gb3/CD77 antikò 1:100 nan bloke a. solisyon oswa kontwòl izotip (rat IgM) nan yon konsantrasyon matche kòm antikò prensipal pou lannwit lan nan 4 ◦C. Apre lave, seksyon yo te enkube ak yon antikò segondè (anti-rat IgM Alexa Fluor 488, 1:2000 dilution nan PBS) pou 2 èdtan nan 4 ◦C. Seksyon yo te tache pou lòt sond AQP1 (1:1000 dilution, Sigma-Aldrich Japon, Tokyo, Japon) ak CD31 (550274, 1:50 dilution, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ak antikò segondè anti-lapen IgG Alexa. Fluor 546 (1:2000 dilution nan PBS) ak anti-sourit IgG Alexa Fluor 647 (1:2000 dilution nan PBS), respektivman. Apre yo fin lave ak PBS, tach 40, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, D21490, Thermo Fisher) te fè pou 15 minit nan 4 ◦C. Seksyon yo te benyen nan likid nan yon pi plak 96-byen an (ki gen fòm U) ak yon ti ront penti chak fwa yo te chanje solisyon an. Etap lave a te fèt nan pi gwo pwi tankou nan plak 12- oswa 6-byen. Aqueous aliye medya te itilize pou coverslipping. Pou preparasyon tisi imen an, ren postmortem te fikse nan fòmalin 20% pou 2 semèn epi trete pou preparasyon k ap flote gratis menm jan ak tisi sourit ak yon eksepsyon antikò CD31 anti-moun (CBL468, dilution 1:20, Merck KGaA, Darmstadt). , Almay) te itilize.

5.11. Analiz Microarray

Mwatye nan ren an benyen nan 2 mL nan RNALater (Ambion, Austin, TX, USA) nan 4 ◦C ak total RNA yo te ekstrè ak twous la Rneasy Midi (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA). Mouse Genome 430A 2.0 etalaj (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) yo te itilize. Fichye CEL yo te jwenn ak nòmalize ak mwayèn solid milti-chip (RMA), kalkil nimewo kopi RNA, ak chanjman pliye kont 0 h yo te fèt nan R (v.3.6.0) ak pake li yo. affy [73] ak RankProd 2.0 [74]. Done yo montre nan log2-valè chanjman pliye yo. Ansanm done a depoze nan Gene Expression Omnibus (GEO) (nimewo admisyon GSE172465). Soti nan selil RPTEC, RNA total yo te ekstrè ak RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, Tokyo, Japon). Tout moun genomic oligonucleotide microarray (44K oligonucleotide DNA microarray, Agilent Technologies, Tokyo, Japon) te itilize pou eksperyans microarray. Yo te itilize echantiyon RNA total yo pou preparasyon sond cDNA ki gen etikèt Cy5- ak Cy3-. Echantiyon ki gen etikèt fliyòfò yo te ibride sou chak glisad vè epi yo te lave, epi yo te analize ak yon eskanè mikwo-array ADN (modèl G2505A; Agilent Technologies). Lojisyèl Ekstraksyon ak Analiz Imaj (Agilent Technologies) te itilize pou lokalize ak delimite chak plas nan etalaj la ak entegre entansite yo, ki te Lè sa a, filtre ak nòmalize lè l sèvi avèk metòd la atenuasyon dispersion lokalman filaplon. Yo te evalye repwodibilite analiz microarray pa de repetisyon swap lank nan chak eksperyans. Diferans nan ekspresyon mRNA ant kontwòl ak Stx2-trete RPTEC rekòlte nan 6, 10, oswa 19 èdtan yo te konpare. Done fòma TXT ki soti nan lojisyèl GeneSpring yo te itilize pou detèmine non jèn ki soti nan ID sonde ak konvèti chanjman pliye nan log2-chanjman pliye. Se done yo depoze nan GEO (nimewo Adhesion GSE172466).

5.12. Analiz byoenfòmatik done ak vizyalizasyon Microarray Nan tou de done ren sourit ak RPTEC microarray, jèn ki komen nan tou de ak kote chanjman nan ekspresyon an te plis pase 2-pliye diminye oswa ogmante (oswa log2-pliye chanjman). se swa ki pi piti pase -1 oswa pi gwo pase 1) nan nenpòt ki pwen lè yo te chwazi pa R. Anplis, nan done mikwo matris ren sourit. Chanjman jèn ki anfòm koub kib yo te chwazi lè l sèvi avèk pake R maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maSigPro.html (dènye aksè sou 4 janvye 2022)] [75]. Koub kib la apwopriye pou akomode ogmantasyon oswa diminye jèn sa yo pandan yon kou tan. Yon pi wo degre polinòm tankou yon koub kib pèmèt yo chwazi jèn ak chanjman miltip pandan kou tan an pi bon pase yon koub kwadratik. Jèn ki te konpòte yo pa menm trajectoire yo te gwoupe ak modèl diminisyon/ogmante yo te vizyalize pa yon kat chalè lè l sèvi avèk R package gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (dènye aksè nan 4 janvye). 2022)] [76]. Gen ontoloji (GO) te asiyen ak fonksyon GO nan mitan jèn komen yo te anrichi lè l sèvi avèk Metascape [http://metascape.org (dènye aksè nan 4 janvye 2022)] [77]. Koneksyon/relasyon jèn komen yo te analize lè l sèvi avèk STRING [https://string-db.org/ (dènye aksè sou 4 janvye 2022)] [78]. Asosyasyon ant jèn komen yo te fouye manyèlman epi tou lè l sèvi avèk fonksyon an min tèks nan STRING.

Referans

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. Sendwòm nan emolitik-uremik.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. Vitsky, BH; Suzuki, Y.; Strauss, L.; Churg, J. Sendwòm emolitik-uremik la: Yon etid sou chanjman patolojik ren yo.Am. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Dohi, S.; Igarashi, T.; Yamanaka, T.; Yoshiya, K.; Kobayashi, N. Defisyans verotoksin nan fonksyon tubulaires kontribye nan domaj nan ren yo wè nan sendwòm emolitik uremik.J. Enfekte.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakajima, H.; Katagiri, C.; Taguchi, T.; Takeda, T.; Kiyokawa, N.; Fujimoto, J. Aktivasyon Src fanmi kinaz wi pwovoke pa Shiga toksin obligatwa globotriaosyl seramid (Gb3 / CD77) nan dansite ki ba, mikrodomains detèjan-ensolubl.J. Biol. Chem.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. Takenouchi, H.; Kiyokawa, N.; Taguchi, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; Fujimoto, J. Shiga toksin obligatwa nan globotriaosyl seramid pwovoke siyal entraselilè ki medyatè renovasyon sitoskelèt nan selil ki sòti nan kansòm ren imen.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. Furin-induit klivaj ak aktivasyon nan Shiga toksin.J. Biol. Chem.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. Majoul, I.; Ferrari, D.; Söling, HD Rediksyon nan lyezon disulfid pwoteyin nan yon anviwònman oksidan. Pon disulfide nan subunit A-toksin kolera redwi nan retikul andoplasmik la.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; Watson, PD; Marsden, CJ; Smith, DC; Moore, KAH; Cook, JP; Seyè, JM; Roberts, LM Pwoteyin disulfid izomeraz diminye ricin nan chenn A ak B li yo nan retikul andoplasmik la.Byochim. J.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. Yu, M.; Haslam, DB Shiga Toxin transpòte soti nan retikul andoplasmik apre entèraksyon ak Luminal Chaperone HEDJ/ERdj3.Enfekte. Iminitè.2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. Shiga toksin B-subunit mare ak chaperone BiP la ak pwoteyin nukleolè B23 la.Biol. Selil2006, 98, 125–134. [CrossRef]