Abstrè
Yo mennen ankèt sou efè yo sinèrjetik inhibition nanCistenche dezètikolaGlikozid fenillethanoid (PHGs) ak glabridin (GLA) sou pigmantèr po, yo te rapò a mas pi bon nan PHGS GLA preliminè tès depistaj nannan vitroTyrosinase aktivite inhibition analiz, 1, 1- Diphenyl -2- picrylhydrazyl (DPPH) netwayaj radikal, ak 2,2'-azino-bis ({{ eksperyans. Pli lwen evalyasyon yo te fèt lè l sèvi avèk twa modèl selilè:

Yon modèl melanogenesis B16F10 UVB-pwovoke pou evalye anpèchman sentèz melanin atravè aktivite tyrosinase ak kontni melanin;

Yon lipopolysaccharide (LPS) -dudwi HACAT modèl enflamatwa yo evalye efè anti-enflamatwa pa mezire interleukin -6 (IL -6) ak timè necrosis faktè- (TNF-) repwesyon;

Yon AAPH (2,2'-azobis (2- amidinopropane) dihydrochloride-pwovoke HACAT modèl estrès oksidatif detèmine aktivite antioksidan via superoksid dismutaz (SOD) ak catalase (CAT) amelyorasyon.

Pi bon rapò mas PHGs/GLA te idantifye nan modèl sa yo. Rezilta yo demontre ke solisyon PHGS/GLA (prepare nan sal fosfat-tampe, PBS, pH 6.8) nan rapò mas nan 1: 1, 5: 1, ak 10: 1 ekspoze siyifikatif anpèchman tyrosinase ak efè antioksidan sinèrjetik. Pousantaj anpèchman tirozinaz yo te 94,37%, 92.93%, ak 88.06%, respektivman; Pousantaj DPPH radikal netwayaj rive nan 89,44%, 88.72%, ak 88.10%; Pousantaj ABTS⁺ netwayaj yo te 100.13%, 100.01%, ak 99.87%. Nan 25 ug/mL nan DMEM, PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) te montre pa gen okenn sitotoksisite nan direksyon B16F10 oswa selil HACAT. PHGS/GLA (1: 1) solisyon DMEM parètSiperyè anpèchman tirozinaz(23.80% aktivite rezidyèl), siyifikativmanredwi kontni melanin(30.90%), ak depase lòt rapò ak monoterapi nan siprime IL -6/TNF-lage ak amelyore aktivite SOD/CAT. Konbinezon an sinèrjetik nan PHGs ak GLA efektivman soulaje sKin ipèrpigmantasyon pa anpeche melanogenesis, diminye enflamasyon, akAmelyore kapasite antioksidan.

Mo kle
NèsanDeserticola glikozid fenylethanoid; glabridin; efè sinèrjetik; anti-melanogenesis; antioksidan; anti-enflamatwa; Matyè pharmaceutique anvan tout koreksyon

 

 

 

NèsanDeserticola ekstrè akWo nivoglikozid fenillethanoid pou blanchiman po

Whatsapp nou pou plis detay

 

Seksyon eksperimantal

1.1 Materyèl, reyaktif, ak enstriman

Selil melanom souritB16F10 (Katalòg Non.: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Teknoloji co, Ltd.

Imen imòtèl keratinositHACAT (Katalòg Non.: Icell-H066), Icell Bioscience Inc., Shanghai, Lachin.

Glycosides phenylethanoid Cistanche (PHGs)akGlabridin (GLA), Shaanxi Tianxingjian Byolojik Chimik Teknoloji co, Ltd.

Tirozinaz, Hefei BASF Biyoteknoloji Co., Ltd.

Arbutin (ARB)akL-tirozin, Aladen byochimik Teknoloji co, Ltd, Shanghai, Lachin.

1, 1- Diphenyl -2- Picrylhydrazyl (DPPH), Tokyo Chemical Industry co, Japon.

2,2′-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- asid sulfonic) Diamonium sèl (ABTS), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Asid ascorbic (VC), Tianjin Damao Chimik faktori reyaktif.

Potasyòm persulfateaketanòl anidrid, Tianjin Zhiyuan Chemical Reyaktif Co., Ltd.

SODIUM SODIUM, Chengdu Huayi famasetik Excipient Manufacturing Co., Ltd.

Fosfat dipotasyòm, Shanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-dopa, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Twous konte selil -8 (CCK8), Beijing Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, Dimethyl sulfoxide (DMSO), 2,2′-azobis (2- methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)akLipopolysaccharide (LPS), Beijing Solarbio Syans ak Teknoloji co, Ltd.

DMEM segondè-glikoz mwayen, Thermo Fisher syantifik (Lachin).

Fetal serom bovin (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Komès co, Ltd.

Solisyon penisilin-streptomycin, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Imen il -6 ELISA Twous, Imèn TNF-ELISA TwousakImèn chat elisa twous, Wuhan Fine Biotech co, Ltd.

Total superoksid dismutaz (SOD) twous esè, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Tout reyaktif yo te nan klas analyse.

Enstriman yo itilize:

Multiskan FC plen-longèdonn lektè mikroplatakHeracell 371 CO2 enkibatè, Thermo Fisher Scientific, USA.

Kq -200 VDB Cleaner Ultrasonic, Kunshan Ultrasons Enstriman Co., Ltd.

Dvkw-d -2 dijital beny dlo thermostatic, Beijing Yongguangming faktori enstriman medikal.

Dhg -9246 yon elektrik thermotatic eksplozyon fou, Shanghai Jinghong Ekipman Ekipman co, Ltd.

KN4006B UVB enstriman radyasyon iltravyolèt(Entansite iradyasyon: 8 MW/cm²), Xuzhou Kenuo Enstriman Medikal Ekipman co, Ltd.

1.2 Metòd

Premyèman, PHGS ak GLA yo te fonn nan swa fosfat-tanpere sal (PBS, Ph =6.{{0}}. 0 0 1, 0.. Lè sa a, PHGS ak GLA te melanje nan rapò nanm (phgs): m (gla)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, ak 1:40, pou prepare solisyon PHGS/GLA ak yon konsantrasyon mas total de0.4 g/L, ki make kòmPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), respektivman.

 

1.3 Eksperyans byochimik

1.3.1 Tyrosinase aktivite anpèchman analiz

Nan yon plak 96- byen,50 μl nan solisyon an echantiyon tès yo, 50 μl nan PBS (Ph =6. 8)ak50 μl nan solisyon L-tirozin (1 g/L)yo te ajoute sekans. Plak la te enkubasyon nan yon beny dlo 37 degre pou 10 minit. Lè sa a,5 0 μl nan solisyon tyrosinase (0.4 g/L, ekivalan a 200 U/ml)te ajoute, epi yo te plak la enkubasyon ankò nan 37 degre nan dlo beny pou yon lòt 10 minit.

Arbutin (ARB)te itilize kòm kontwòl la pozitif, akPBS (Ph =6. 8)te itilize kòm kontwòl la vid.

Absorption nan solisyon an nan490 nmte mezire lè l sèvi avèk yon lektè mikroplat, ak nan in vitro to anpèchman tyrosinase (%) te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon (1).

 

 

Nan fòmil la:

A _ reyaksyonse absorption nan solisyon an echantiyon ki gen solisyon L-tirozin, PBS, ak solisyon tyrosinase.

Yon _ kontwòl reyaksyonse absorption nan solisyon an echantiyon ki gen solisyon L-tirozin ak PBS san yo pa solisyon tyrosinase.

A _ vidse absorption nan solisyon an ki gen solisyon L-tirozin, PBS, ak solisyon tyrosinase san yo pa echantiyon an.

Yon _ kontwòl vidse absorption nan solisyon an ki gen solisyon L-tirozin ak PBS san echantiyon an ak solisyon tyrosinase.

1.3.2 Detèminasyon DPPH gratis aktivite netwayaj radikal

Premyèman, {{0}}.0. 2 mmol/l.

Lè sa a, PHGS ak GLA yo te fonn nan 50% etanòl yo prepare solisyon etanòl nan PHGs ak GLA ak konsantrasyon mas nan{{0}}. 0 0 1, 0.. Solisyon etanòl nan VC yo te prepare nan menm fason an.

Imedyatman, solisyon yo etanòl nan PHGs ak GLA yo te melanje nan rapò nanm (solisyon phgs): m (solisyon gla)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40Pou jwenn 9 solisyon etanòl nan PHGs/GLA ak rapò mas diferan, ki make kòmPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Finalman,100 μl nan chak solisyon echantiyonak100 μl nan solisyon an k ap travay DPPHyo te ajoute nan yon 96- byen plak, melanje respire, ak enkubasyon nan tanperati chanm nan fè nwa a pou 30 minit. Absorption a nan517 nmte mezire lè l sèvi avèk yon lektè mikroplat. VC te itilize kòm kontwòl la pozitif, epi yo te chak eksperyans repete twa fwa.

DPPH gratis radikal to a netwayaj (%) te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon (2).

 

Nan fòmil la:

A1se absorption nan solisyon an echantiyon + DPPH solisyon k ap travay.

A2se absorption nan 50% etanòl + DPPH solisyon k ap travay.

A3se absorption nan solisyon an echantiyon + 50% etanòl.

 

1.3.3 Detèminasyon nan ABTS⁺ gratis radikal aktivite netwayaj

Premye,1 g (1.82 mmol) nan ABTSte fonn nan dlo deionized pou prepare yon solisyon k ap travay ABTS ak yon konsantrasyon final nan7.4 mmol/l. 0. 5 g nan potasyòm persulfatete fonn nan dlo deionized pou prepare yon solisyon k ap travay potasyòm persulfate ak yon konsantrasyon final nan2.6 mmol/l. Volim egal nan solisyon yo k ap travay ABTS ak solisyon k ap travay potasyòm persulfate yo te melanje ak pèmèt yo reyaji nan fè nwa a pou 12 èdtan yo prepare solisyon an ABTS⁺ k ap travay.

Lè sa a, solisyon etanòl nan PHGS, GLA, ak VC, osi byen ke PHGS/GLA solisyon etanòl ak rapò nanPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), yo te prepare dapre metòd ki dekri nan Seksyon 1.3.2.

Finalman,40 μl nan chak solisyon echantiyonak160 μl nan solisyon an ABTS⁺ k ap travayyo te ajoute nan yon 96- byen plak, melanje respire, ak te reyaji nan fè nwa a nan tanperati chanm pou 6 minit. Absorption nan solisyon an nan734 nmte mezire lè l sèvi avèk yon lektè mikroplat.

Pousantaj ABTS⁺ gratis pou netwayaj radikal (%) te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon (3).

 

 

Nan fòmil la:

A1se absorption nan solisyon an echantiyon + ABTS⁺ solisyon k ap travay.

A2se absorption de deionized dlo + abts⁺ solisyon k ap travay.

A3se absorption nan echantiyon an solisyon + deionized dlo.

1.4 eksperyans selil

1.4.1 Kilti selil

Apre reviv selil B16F10 ak HACAT yo, yo te smi nan medyòm DMEM-wo glikoz (ki gen 10% sewòm bovin fetal ak 1% solisyon penisilin-streptomycin) ak kiltive nan37 degre, 5% CO2ak70% imiditenan yon enkibatè pou 24 èdtan. Estati kwasans selil la te obsève anba yon mikwoskòp, ak chanjman mwayen oswa pasaj yo te fèt jan sa nesesè ki baze sou kondisyon an kwasans selil.

1.4.2 Gwoup eksperimantal

Logaritmik-faz B16F10 ak selil HACAT yo te smi nan 96- byen plak nan yon dansite selil ki apwopriye ak kiltive pou 24 èdtan yo ki pèmèt aderans selil. Solisyon echantiyon ak konsantrasyon diferan yo te prepare lè l sèvi avèk DMEM medyòm.

Gwoup eksperimantal yo te jan sa a:

Gwoup nòmal

Gwoup modèl

PHGS ki ba-dòz gwoup(125 ug/ml)

PHGS medyòm-dòz gwoup(250 ug/ml)

PHGS segondè-dòz gwoup(500 ug/ml)

GLA ba-dòz gwoup(6.25 ug/ml)

GLA medyòm-dòz gwoup(12.5 ug/ml)

GLA High-Dòz Gwoup(25 ug/ml)

PHGS/GLA (1: 1) gwoup(25 ug/ml)

PHGS/GLA (5: 1) Gwoup

PHGS/GLA (10: 1) Gwoup

Pou laUVB-pwovoke modèl pigmantèr nan selil B16F10, selil gwoup modèl yo te trete ak30 μl nan PBS (Ph =7. 4)ak iradyasyon anba yon enstriman radyasyon iltravyolèt UVB nan3 cm anba aparèy lapou110 segonn. Gwoup eksperimantal yo te pretrate ak100 μl nan solisyon echantiyon diferanpou 1 èdtan anvan ou ajoute30 μl nan PBSak iradyasyon anba aparèy la UVB pou 110 segonn. Te gwoup la nòmal kontinyèlman trete ak segondè-glikoz DMEM medyòm, ak gwoup la vid pa t 'gen selil men li te ranplase ak yon kantite lajan egal nan mwayen.

Pou laLPS-induit modèl enflamasyon nan selil HACAT, yo te gwoup la modèl trete ak20 ug/ml solisyon PBS PBSpou 24 èdtan. Gwoup eksperimantal yo te pretrate ak100 μl nan solisyon echantiyon diferanpou 24 èdtan anvan ou ajoute20 ug/ml solisyon LPSpou yon lòt 24 èdtan. Te gwoup la nòmal kontinyèlman trete ak segondè-glikoz DMEM medyòm, ak gwoup la vid pa t 'gen selil men li te ranplase ak yon kantite lajan egal nan mwayen.

Pou laAAPH-induit modèl estrès oksidatif nan selil HACAT, yo te gwoup la modèl trete ak25 mmol/L solisyon aafpou 24 èdtan. Gwoup eksperimantal yo te pretrate ak100 μl nan solisyon echantiyon diferanpou 24 èdtan anvan ou ajoute25 mmol/L solisyon aafpou yon lòt 24 èdtan. Te gwoup la nòmal kontinyèlman trete ak segondè-glikoz DMEM medyòm, ak gwoup la vid pa t 'gen selil men li te ranplase ak yon kantite lajan egal nan mwayen.

Chak gwoup te mete kanpe ak3 replike pwiak kiltive nan37 degre, 5% CO2ak70% imiditenan yon enkibatè.

1.4.3 tès sitotoksisite

Yo te mezire sitotoksisite a lè l sèvi avèk laMetòd CCK8. Logaritmik-faz B16F10 ak selil HACAT yo te dijere avèk yo0. 25% trypsinpou 3 minit. Apre dijesyon te sispann ak mwayen an, selil yo te repete pipetted yo prepare yon sispansyon selil ak yon dansite nan1 × 10⁴ selil/ml. Selil yo te respire smi nan 96- byen plak nan100 μl pou chak byen, ak PBS te ajoute nan pwi yo periferik. Apre Aderans selil, yo te ajoute konsantrasyon diferan nan solisyon echantiyon, ak3 replike pwi pou chak gwoup, ak selil yo te kiltive nan37 degre, 5% CO2ak70% imiditepou24, 48, ak 72 èdtananvan jete mwayen an.

Pou tout gwoup,100 μl nan CCK8 DMEM segondè-glikoz medyòm (ki gen 10% CCK8)te ajoute ak enkubasyon pou60 minit. Absorption nan solisyon an nan450 nmte mezire lè l sèvi avèk yon lektè mikroplat.

Te viabilite nan selil (%) kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon (4).

 

Nan fòmil la:

Yon _ tretese absorption nan selil yo byen ki gen, solisyon CCK8, ak solisyon an echantiyon.

A _ vidse absorption nan byen ki gen mwayen ak solisyon CCK8 men san yo pa selil yo.

A0se absorption nan selil yo byen ki gen ak solisyon CCK8 men san yo pa solisyon an echantiyon.

1.4.4 Tirosinase aktivite épreuves

Metòd L-DOPA te itilize pou mezire aktivite tirozinaz. Apre trete selil yo pou48 èdtanJan sa dekri nan Seksyon 1.4.2, yo te abandone a, ak pwi yo te lave de fwa ak PBS (ph =7. 4). Lè sa a,50 μl nan 1% Triton X -100 solisyonte ajoute nan chak byen epi imedyatman mete yo nan yon frizè –80 degre pou30 minit. Selil yo te deglase nan tanperati chanm nan pwovoke lysis.

Apre pre-chofe nan37 degrepou5 minit, 10 μl nan 10 mmol/L L-DOPA solisyonte ajoute nan chak byen ak enkubasyon nan37 degre, 5% CO2, ak 70% imiditepou1 èdtan. Absorption a nan475 nmte mezire lè l sèvi avèk yon lektè mikroplat. Chak eksperyans te repeteTwa fwa, ak aktivite a tyrosinase (%) te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon (5).

Nan fòmil la:

Yon _ eksperyansse absorption nan selil yo byen ki gen ak solisyon echantiyon anba iradyasyon UVB.

A _ nòmalse absorption nan selil yo byen ki gen ak solisyon echantiyon san yo pa iradyasyon UVB.

A _ vidse absorption nan mwayen ki gen byen men san yo pa selil yo.

 

1.4.5 mezi kontni melanin

Te metòd la lysis NaOH itilize mezire kontni melanin. Apre trete selil yo pou72 èdtanJan sa dekri nan seksyon 1.4.2, yo te abandone a, epi yo te lave pwi yo de fwa avèk PBS.100 μl nan solisyon NaOH akeuz ki gen 10% DMSO (1 mol/L)te ajoute nan chak byen, epi yo te plak la mete yo nan yon90 degre foupou1 èdtan. Absorption a nan490 nmte mezire lè l sèvi avèk yon lektè mikroplat. Chak eksperyans te repeteTwa fwa, ak kontni an melanin (%) te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon (5).

 

1.5 Mezi nan faktè enflamatwa ak endikatè estrès oksidatif

Apre trete selil yo pou48 èdtanjan sa dekri nan Seksyon 1.4.2,Selil hacatSoti nan chak gwoup yo te ranmase lè l sèvi avèk yon grate selil, santrifuje, ak supènant la te ranmase. Konsantrasyon yo nan il -6 ak TNF- yo te mezire dapre enstriksyon yo nan twous yo ELISA.

Apre trete selil yo pou48 èdtan, Selil HACAT yo te ranmase lè l sèvi avèk yon grate selil, sibi repete sik friz-efondreman pwovoke lysis selil, ak santrifuje nan12, 000 rpm pou 10 minit nan 4 degre. Supernatant la te ranmase, ak aktivite yo nanKabinèak konsantrasyon nanChatyo te mezire lè l sèvi avèk enstriksyon yo twous ELISA.

 

1.6 Mezi Index konbinezon

AKonbinezon endèks (CI) metòd[20] te itilize pou evalye si wi ou non konbinezon an nan PHGs ak GLA nan rapò mas diferan ekspoze efè sinèrjetik nan anpeche aktivite tyrosinase ak antioksidan. Te endèks la konbinezon kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon (6).

 

Nan fòmil la:

D1akD2reprezante konsantrasyon yo respektif (G/L) nan de dwòg yo nan tretman an konbinezon ki nesesè yo reyalizex% aktivite.

Dxreprezante konsantrasyon an (g/l) nan chak sibstans endividyèl lè yo itilize pou kont li pou reyalizex% aktivite.

ACompusyn lojisyèlte itilize pou kalkil:

CI> 1endike yon efè opoze.

CI=1endike yon efè aditif.

CI <1endike yon efè sinèrjetik.

 

1.7 analiz done

Tout done yo te eksprime kòm"Vle di ± devyasyon estanda (x̄ ± s)", ak diskisyon yo te baze sou valè yo vle di.

Estatistik analiz te fè lè l sèvi avèkGraphPad Prism 9.5. 0. Yon sèl-fason ANOVA (analiz de divèjans) te itilize pou konparezon nan mitan gwoup miltip. YounP-valè <0. 05te konsidere kòm estatistik enpòtan.