Abstraji

Jan nou koumanse: De pli zan pli etid yo te rapòte efè ki ka geri nan selil tij mesenchymal (MSC) ki sòti nan eksosom ki karakterize pwoteyin ak miRNA. Sepandan, pwoteomik ak pwofil miRNA exosomes ki sòti nan selil souch anbriyon imen (hESCs) ak selil souch pluripotent moun (hiPSCs) rete klè.

Glycoside nan cistanche ka ogmante tou aktivite SOD nan kè ak tisi fwa, ak siyifikativman redwi kontni an nan lipofuscin ak MDA nan chak tisi, efektivman scavenging divès kalite radikal oksijèn reyaktif (OH-, H₂O₂, elatriye) ak pwoteje kont domaj ADN ki te koze. pa OH-radikal. Cistanche phenylethanoid glikozid gen yon gwo kapasite scavenging nan radikal gratis, yon pi wo kapasite diminye pase vitamin C, amelyore aktivite a nan SOD nan sispansyon espèm, redwi kontni an nan MDA, epi yo gen yon sèten efè pwoteksyon sou fonksyon manbràn espèm. Cistanche polisakarid ka amelyore aktivite SOD ak GSH-Px nan eritrosit ak tisi nan poumon nan sourit senesan eksperimantal ki te koze pa D-galaktoz, osi byen ke diminye kontni an nan MDA ak kolagen an nan poumon ak plasma, ak ogmante kontni an nan elastin, gen yon bon efè scavenging sou DPPH, pwolonje tan an nan ipoksi nan sourit senesan, amelyore aktivite a nan SOD nan serom, ak retade koripsyon fizyolojik nan poumon nan sourit senesan eksperimantal Avèk koripsyon selilè mòfolojik, eksperyans yo te montre ke Cistanche gen bon kapasite antioksidan. epi li gen potansyèl pou yo dwe yon dwòg pou anpeche ak trete maladi po aje. An menm tan an, echinacoside nan Cistanche gen yon kapasite siyifikatif pou elimine radikal gratis DPPH epi li ka retire espès oksijèn reyaktif, anpeche degradasyon kolagen an gratis radikal-induit, epi tou li gen yon efè reparasyon bon sou domaj anyon radikal gratis timin.

Klike sou anti-aje Cistanche Powder Bulk

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Metòd: Nan etid sa a, nou izole ekzosom nan hESCs, hiPSCs, ak selil souch mesenchymal kòd lonbrit imen (hUC-MSCs) atravè ultracentrifugasyon klasik ak yon filtè 0.22-μm, ki te swiv pa idantifikasyon konsèvatif. Tandem etikèt mas tag ak etikèt-gratis quantification peptide relatif ansanm defini pwoteomik yo. Yo te fè sekans segondè-debi pou detèmine pwofil miRNA yo. Lè sa a, nou te fè yon analiz byoenfòmatik yo idantifye pwosesis byolojik dominan yo ak chemen modil pa kago exosome. Finalman, Western blot la ak RT-qPCR yo te fèt pou detekte chaj aktyèl yo nan pwoteyin ak miRNAs nan twa kalite exosomes.

Rezilta yo: Dapre etid nou an, kago ki soti nan twa kalite exosomes kontribye nan pwosesis byolojik sofistike. An konparezon, hESC exosomes (hESC-Exos) te siperyè nan reglemante devlopman, metabolis, ak antiaje, ak hiPSC exosomes (hiPSC-Exos) te gen fonksyon byolojik menm jan ak hESC-Exos, tandiske hUC-MSCs exosomes (hUC-MSC-Exos) kontribye plis nan règleman iminitè.

Konklizyon: Done yo prezante nan etid nou an ede defini peyizaj pwoteyin ak miRNA nan twa ekzosom, predi fonksyon byolojik yo atravè analiz rezo sistematik ak konplè nan nivo sistèm nan, epi revele aplikasyon potansyèl respektif yo nan diferan domèn yo optimize seleksyon ekzosome nan preklinik ak klinik. esè.

Mo kle: Selil souch anbriyon imen, Selil souch pluripotant moun ki pwovoke, Selil souch mesenchymal kòd lonbrit imen, Exosomes, Proteomics, miRNA

Entwodiksyon

Vesicules ekstraselilè (EVs) se ti vesikul aktivman sekrete pa selil yo, sitou ki gen exosomes, microvesicles (MVs), ak kò apoptotik [40, 56, 57]. Yo distribye lajman nan plizyè likid kò, tankou krache, lèt tete, san, likid serebrospinal, kòlè, ak pipi [57]. Pami yo, exosomes gen yon bikouch lipid ak yon dyamèt 40-200 nm, yon dansite k ap flote 1.13-1.18 g / ml nan gradyan sikwoz la, ak yon aparans ki gen fòm tas anba yon mikwoskòp elèktron [21, 53]. Divès konpoze bioaktif, ki gen ladan pwoteyin, asid nikleyik, ak lipid, bay fonksyon kominikasyon entèselilè ekzosom ant selil yo [16, 17]. Bikouch lipid la se yon baryè delika ki pwoteje sa ki nan exosomes kont koripsyon anzimatik likid kò [49]. Egzosom ki estab ka medyatè pwosesis fizyolojik ak patolojik konplike atravè aktivite parakrin, ki gen ladan devlopman ògàn ak repwodiktif, prezantasyon antijèn, kominikasyon newòn, repons iminitè, règleman aje, ak pwopagasyon selil [57, 62].

Fòmasyon eksozòm ak lage se yon pwosesis konplètman reglemante, ak klasman an nan eksozòm-ankapsule sa ki fèt pa mobilizasyon divès pwoteyin [22, 47]. Pwoteyin miltip yo enpòtan anpil pou fòmasyon exosome, ki genyen konplèks klasman endozomal ki nesesè pou transpò (ESCRT), tetraspanin (CD9, CD63, ak CD81), jèn ki lye ak apoptoz 2-pwoteyin X ki entèraksyon (Alix), ak sansiblite timè. jèn 101 (TSG101) [38, 55]. Trafik entraselilè ekzosom yo kondwi pa aktivite kolektif yon seri pwoteyin, ki gen ladan switch molekilè RAB GTPases ak pwoteyin cytoskeletal, tankou aktin ak tubulin [24]. Imedyatman, sekresyon exosome konplete pa konplèks SNARE ak fanmi sinaptotagmin [22]. Rechèch te detèmine ke boujònman ak koule nan exosomes depann sou aktivite kalsyòm ak rekritman ESCRT [15]. Kòm yon mesaje, lage exosome patisipe nan diafonis selilè an repons a fizyoloji selilè ak chanjman patolojik, tankou aktivasyon, chanjman pH, ipoksi, domaj radyasyon, oswa estrès selil [61].

Pou dekouvri konpozan exosomes yo ak fonksyon posib fizyolojik ak patolojik yo, yo souvan itilize teknik pwoteomik, transkriptomik ak lòt pou etidye RNA eksozòm ak pwoteyin ki soti nan diferan espès, tisi ak selil [44]. Analiz pwoteomik exosome anjeneral gen ladan twa etap: izolasyon, pirifikasyon, ak karakterizasyon exosomes, idantifikasyon konpozan pwoteyin lè l sèvi avèk espektometri mas, ak analiz done anvan tout koreksyon [14]. Eta selilè a siyifikativman afekte konpozisyon pwoteyin ak abondans nan exosomes. Kounye a, teknik pwoteomik quantitative pou analize karakterizasyon pwoteyin ak abondans yo itilize pou elicide mekanis ki kache pwodiksyon exosome yo ak apwofondi konpreyansyon nou sou wòl fizyolojik ak patolojik exosomes nan selil yo [39]. Pami yo, teknoloji pwoteomik quantitative ki baze sou spèktrometri mas yo lajman itilize, sitou ki gen ladan metòd ki gen etikèt ki san etikèt ak ki estab izotòp ki make [13, 42]. miRNA yo se ti molekil byoaktif ki asosye ak plizyè aktivite lavi. Teknik sekans segondè-debi a karakterize pa gwo sansiblite ak presizyon e li gen aplikasyon lajè nan sekans miRNA (18-30 nt) [6]. Etandone devlopman teknoloji aktyèl la, pa gen okenn baryè pou diseke pwofil pwoteyin ak miRNA exosomes yo.

hESC yo ak hiPSC yo gen gwo potansyèl diferansyasyon [36]. Sepandan, aplikasyon dirèk yo nan tretman an limite akòz risk pou malfezans ak pwoblèm etik [31]. Kontrèman, selil souch mesenchymal (MSCs) gen yon aplikasyon pi laj pou entèvansyon nan plizyè maladi nan anviwònman klinik [8]. Sepandan, itilizasyon dirèk yo toujou ap fè fas a plizyè limit, tankou yon to siviv ki ba, rejè iminolojik, ak pwoblèm sekirite [8, 43]. Kounye a, yo te peye anpil atansyon sou exosomes paske yo te biosekirite, estabilite, ki pa aneploidi, ak iminojenisite ki ba [51]. Etid anvan yo te dokimante konparezon eleman MSC ki sòti nan tisi diferan ak exosomes yo ki gen pwofil proteomik ak miRNA [59]. Gong et al. tou dekri rezo regilasyon hESC ekstraselilè vesik (EVs) an tèm de proteome a, men se sèlman nan chemen ki gen rapò ak aje san yo pa konsantre sou lòt moun [19]. Questa et al. tise atlas pwoteomik EV nan hiPSC ki sòti nan fibroblasts prepui imen (HFFs) [45]. Malgre ke etid sa yo te an pati rapòte eleman pwoteyin nan EV yo, yo pa t 'konsantre sèlman sou exosomes, epi analiz pwoteomik konplè yo pa byen klè. An patikilye, pwofil miRNA yo poko dekri. Pou adrese sa a, yo te chwazi exosomes izole nan hESCs, hiPSCs, ak hUC-MSCs nan etid la pou plis envestigasyon vize pwofil pwoteòm ak miRNA yo pou jwenn nouvo lide pou rechèch ak aplikasyon klinik yo.

Metòd

Preparasyon ak karakterizasyon exosomes

hESCs ak hiPSC yo te kiltive nan mwayen ncTarget (cat. No. RP01020; Nuwacell. Ltd, Lachin), pandan y ap 3yèm jenerasyon hUC-MSCs yo te kiltive nan mwayen hMSC misyon san serom (cat. No. RP02010; Nuwacell. Ltd, Lachin). Apre sa, yo te kolekte 350 mL nan supernatant selil yo nan faz kwasans logaritmik (~80 pousan konfluyans) pou pirifye exosome. Egzosom yo te ekstrè pa yon seri santrifujasyon rekonèt ak ultracentrifugasyon, jan yo dekri deja [34, 52]. Yon ti tan, yo te kolekte medya kondisyone yo (CM) epi yo te sibi santrifujasyon gradyan (300×g pou 10 min, 2000×g pou 15 min, 10, 000×g pou 30 min) pou separe. debri selilè. Egzosom yo te pellet soti nan supernatant yo kolekte nan 100, 000 × g pou 70 min lè l sèvi avèk yon rotor Ti45 (Beckman Coulter, USA). Lè sa a, yo te resuspend nan PBS pou pwochen filtraj la lè l sèvi avèk yon 0.22-μm MF-Millipore™ manbràn filtre (Sigma, USA). Te filtraj la sibi ultracentrifugation nan 100, 000 × g pou 70 min. Te granules final exosome resuspende nan PBS pou pwochen analiz la. Yo te itilize yon sistèm dinamik limyè gaye (DLS) (Wyatt Technology, USA) pou mezire konsantrasyon ak gwosè ekzosom izole yo.

Mikwoskopi elektwonik transmisyon (TEM)

Yo te fè analiz TEM pou dekri mòfoloji ekzosom izole yo, jan sa te dekri anvan an. Yo te plante exosomes resuspended yo (1 ug nan 10 ul nan PBS) sou yon griy kwiv ki kouvri ak kabòn (200-may) epi yo te pèmèt yo adsorbe sou li pou 2 minit, ki te swiv pa de lave ak dlo doub distile. Lè sa a, kadriyaj yo te negatif tache ak 8 μL nan 2 pousan solisyon acetate uranyl pou 1 min. Apre siye natirèl, echantiyon yo te egzamine lè l sèvi avèk yon sistèm Tecnai Spirit (Thermo Fisher, USA) nan 120 kV.

Limyè dinamik gaye

Distribisyon gwosè exosomes yo te dekri atravè analiz Suivi nanopartikul lè l sèvi avèk yon dispèsyon limyè dinamik (Wyatt Technology, USA) dapre enstriksyon manifakti a (271-DPN), jan yo te rapòte deja[23]. Yon ti tan, granules exosome yo te resuspend nan 100 μL PBS. Dis, 50 μL nan exosomes ki anwo yo te ajoute nan 1450 μL nan PBS ak vortexed pou 30 s. Exosomes (1.5 mL) yo te transfere nan yon kivèt jetab pou ekilib nan 25 degre pou 30 s. Valè endèks refraktif dispersant la te 1.37, epi tou de Z-mwayèn ak polydispersity (PDI) te detèmine gwosè patikil exosome yo. Yo te pran mezi endepandan pou chak echantiyon.

Tandem tag mas tag (TMT) etikèt ak analiz LFQ (label-free relative peptide quantification).

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100, ak P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 ak P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), osi byen ke siyifikasyon estatistik (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

analiz pwofil miRNA

Yo te ekstrè RNA total ki soti nan ekzosom izole yo lè l sèvi avèk mirVana™ miRNA Isolation Kit (cat. No. AM1560; Thermo Fisher, USA). Echantiyon RNA yo te sibi bon jan kalite enspeksyon pou tès miRNA microarray fèt pa LC-Bio Technology Co., Ltd. Yo te fè analiz de done anvan tout koreksyon jan yo te rapòte [9]. Yo te chwazi miRNAs diferan eksprime kòm kandida miRNA nan yon valè p<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) ak maksimòm enèji gratis<−10 (miRanda).

Analiz bioenfòmatik

Done kri yo te sibi analiz lè l sèvi avèk pake lojisyèl Maxquant (v1.6.0), epi done Swis-Prot_Imen yo te mete kòm yon referans (20,600 pwoteyin) (ID Proteome: UP000005640) . Pwoteyin idantifye yo te trase nan Gene Ontology (GO) ak Kyoto Ancyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ki baze sou analiz KOBAS [60] tèm pou detèmine pwopriyete byolojik ak fonksyonèl yo. Lojisyèl Cytoscape ak pake igraf nan lojisyèl R (vèsyon 3.6.1) yo te itilize pou trase rezo entèse nan pwoteyin exosome oswa miRNAs ant chemen siyal yo.

Analiz estatistik

Tout eksperyans yo te fèt an triple. Repetibilite kantite pwoteyin ak miRNA yo te ogmante atravè analiz eleman prensipal (PCA), devyasyon estanda relatif, ak koyefisyan korelasyon Pearson la. Yo te analize rezilta yo lè l sèvi avèk yon tès t Elèv ki pa pè. Done yo eksprime kòm erè estanda mwayèn nan mwayèn (SEM). P-valè yo te konsidere estatistik enpòtan nan *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Rezilta yo

Izolasyon eksozòm ak idantifikasyon

Kilti ak idantifikasyon twa selil souch pluripotan imen yo te dekri nan Fichye Adisyonèl 1. Yo te izole eksozòm nan medya kondisyone twa kalite selil souch (Fisye adisyonèl 1: Fig. S1) epi yo te idantifye ki baze sou mòfoloji, gwosè patikil, konsantrasyon, ak makè sifas [19]. TEM te revele ke exosomes sa yo te gen yon mòfoloji tas ki gen fòm (Fig. 1A), ak DLS revele ke distribisyon gwosè yo te nan 50-200 nm (Fig. 1B). Western blotting te endike ke exosomes izole yo te pote makè pozitif CD63, TSG101, ak HSP70 men se pa makè negatif calnexin (figi 1C). Chak hESC te gen yon sede exosome ki sanble ak sa yo ki nan hiPSCs, ak tou de te pi wo pase sa yo ki nan hUC-MSCs (Fig. 1D). Rezilta sa yo endike ke ekzosom reprezantan yo te arete, ki pa gen okenn diferans nan fòm; sepandan, yo te jwenn diferans ki genyen nan mitan konsantrasyon exosomes izole nan twa kalite selil souch yo.

Bioenfòmatik nan pwoteyin pataje ak tèt chaje

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (essai san etikèt). Finalman, 554, 437, ak 911 grenn yo te chwazi pou analize pwofil pwoteyin hESC-Exos, hiPSC-Exos, ak hUC-MSC-Exos, respektivman (Fichye adisyonèl 1: Fig. S3A). Lè sa a, kandida sa yo te sibi yon tès dyagram Venn yo chwazi pwoteyin pataje (Fichye adisyonèl 1: Fig. S3B). Analiz byoenfòmatik te revele 303 pwoteyin yo pataje domine règleman an nan chemen siyal sa yo ki gen ladan règleman nan sitoskelèt aktin, adezyon fokal, PI3K-AKT, metabolis kabòn, elatriye (Fichye adisyonèl 1: Fig. S3C). GO analiz tou endike ke pwoteyin yo pataje yo te rich nan ekstraselilè ekzosome, manbràn, pwoteyin obligatwa, ak rejyon ekstraselilè, (Fichye adisyonèl 1: Fig. S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (essai san etikèt) (figi 2A). Dapre rezilta sa yo, 163, 187, ak 451 pwoteyin yo te tès depistaj nan hESC-Exos, hiPSC-Exos, ak hUC-MSC-Exos, respektivman (Fichye adisyonèl 1: Fig. S3E). Lè sa a, nou te dekri koub abondans ekspresyon twa kalite exosomes ak idantifye dis senbòl jèn yo nan pwoteyin chaje nan exosomes (figi 2B). ThPwoteyin trè chaje yo te sibi byoenfòmatik ki baze sou algorithm KOBAS la. Pwoteòm twa kalite exosomes yo tout te enplike nan yon konplèks siyal wout regilasyon rezo, ak 20 pi gwo chemen yo te klase dapre valè -log10 (P-valè) (Fig. 2C-E). Tout pwoteòm yo te rich nan entèraksyon matris ekstraselilè (ECM)-reseptè ak chemen siyal PI3K-AKT. Analiz entèraksyon pwoteyin-pwoteyin (PPI) te revele ke pwoteyin ki chaje tèt yo nan tou de hESC-Exos ak hiPSC-Exos yo te.anrichi nan sik selilè a ak chemen metabolik, tandiske pwoteyin ki an tèt chaje nan hUC-MSC-Exos yo te rich nan chemen ki gen rapò ak règleman iminite (Fig. 2F-H).

Konparezon pè nan pwoteomik exosome

Pou evalye diferans ki genyen ant chak de pwoteòm eksozòm, nou te konstwi yon dyagram Venn pou rekonèt grap jèn inik ak sipèpoze ki kode pwoteyin. Lè sa a, yo te sibi jèn kodaj pwoteyin pataje yo nan analiz vòlkan an ak kat chalè ak GSEA, epi yo te filtre pwoteyin diferan eksprime nan P.<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

Konparezon ant hESC-Exos ak hUC-MSC - 1: Fig. S4 D) te revele ke inik grap jèn ki kode pwoteyin nan hESC-Exos te sitou patisipe nan EGFR, TGF-, sik selil, regilasyon pluripotans, ak Wnt. siyal (Fichye adisyonèl 1: Fig. S4E). Kontrèman, grap inik hUC-MSC-Exos yo te rich nan anpil chemen siyal ki gen rapò ak imunoregulasyon tankou sistèm konpleman, règleman enflamasyon, ak enfeksyon mikwòb (Fichye adisyonèl 1: Fig. S4F). Gwoup sipèpoze yo te trè rich nan entèraksyon ECM-reseptè, konpleman ak kaskad koagulasyon, ak siyal PI3K-AKT (Fig. 3D). Trase vòlkan an montre diferans ki genyen ant hESC-Exos ak hUC-MSC-Exos (Fig. 3E). Pwoteyin regilasyon yo nan hUC-MSC-Exos (Cluster 1) te sitou patisipe nan repons konpleman an, aktivite selil asasen natirèl, ak siyal Rap1 ak PPAR. Nan contrast, hESC-Exos upregulated pwoteyin yo te sitou patisipe nan siyal PI3K-AKT, MAPK, ak AMPK (Fig. 3F). GSEA konfime pi wo kapasite regilasyon hiPSC-Exos nan pluripotence (Fichiye adisyonèl 1: Fig. S6A ak D) ak sa ki nan hESC-Exos nan iminoregilasyon, ki gen ladan cytotoxicity asasen natirèl selil-medyatè (Fichye adisyonèl 1: Fig. S6B ak E) ak règleman COVID19-SARS-CoV2 (Fichiye adisyonèl 1: Fig. S6C ak F).

Konparezon hiPSC-Exos ak hUC-MSC-Exos (Fichye adisyonèl 1: Fig. S4G) te revele ke inik hiPSCExos pwoteyin-kodaj jèn yo te siyifikativman asosye ak fen-joining ki pa homologue, TGF-, ak metabolis vitamin B6 (Anplis. fichye 1: Fig. S4H), tandiske sa ki nan hUC-MSC-Exos te sitou patisipe nan chemen ki gen rapò ak imunoregulasyon (Fichye adisyonèl 1: Fig. S4I). Pwoteyin sipèpoze yo te patisipe tou nan règleman entèraksyon ECM-reseptè yo, konpleman ak kaskad koagulasyon, ak siyal PI3K-AKT (figi 3G). Trase vòlkan an prezante pwoteyin diferan eksprime yo (figi 3H). Cluster 1 pwoteyin nan heatmap la endike ke hUCMSC-Exos sitou reglemante repons iminitè a ak chemen siyal AMPK pandan y ap hiPSC-Exos sitou regle sik selilè ak ensilin, Hippo, ak chemen siyal mTOR (Fig. 3 I). GSEA te sipòte plis wòl dominan hiPSC-Exos nan règleman pwosesis devlopman (Fichye adisyonèl 1: Fig. S7A ak D) ak antretyen nan pluripotence (Fisye adisyonèl 1: Fig. S7B ak E), tandiske hUC-MSC-Exos yo te sitou patisipe nan pwosesis imunoregulasyon an (Fichye adisyonèl 1: Fig. S7C ak F).

Bioenfòmatik nan pwoteòm sipèpoze

Apre sa, nou te envestige pwoteòm pataje twa kalite exosome yo. An total, 309 jèn pwoteyin-kodaj (Fig. 4A) te sibi analiz GO ak KEGG. Rezilta yo te endike ke gwoup jèn ki kode pwoteyin nan mitan twa kalite exosome yo te sitou patisipe nan aktivite ekstraselilè ak pwosesis byolojik ki gen ladan pwosesis metabolik pwoteyin selilè, siyal reseptè obligatwa, ATP obligatwa, NAD obligatwa, gerizon blesi, ak pwosesis metabolik lipid (Fig. 4B). Yo menm tou yo kontribye nan konstriksyon rezo konplèks regilasyon nan chemen siyal tankou PI3K-AKT, glycolysis/gluconeogenesis, Hippo, Oxytocin, HIF-1, sik selilè, ak chemen AMPK (Fig. 4C). Te gen relasyon regilasyon konplike ant wout siyal pwoteomik ak kanonik sa yo (figi 4D). Trase ti wonn nan evidans diferan abondans nan chak grap pwoteyin nan chemen an siyal kanonik. Lè nou konsidere ke hESC-Exos ak hiPSC-Exos ta ka gen pi fò kapasite regilasyon pase hUC-MSC-Exos an tèm de sik selilè ak chemen siyal AMPK, hUC-MSC-Exos ta ka gen efè regilasyon enpòtan sou VEGF ak NF-κB siyal chemen (Anplis. dosye 1: Fig. S8).

Analiz la heatmap plis revele diferans ki genyen nan ekspresyon de pwoteyin pataje (Fig. 4E). Nan Cluster A, pwoteyin ki enplike nan chemen siyal reseptè PI3K-AKT, Hippo, VEGF ak B-selil yo te rich nan hUC-MSCExos ak hESC-Exos. Pwoteyin nan Cluster B sitou patisipe nan règleman siyal PPAR, metabolis kolestewòl, ak pwodiksyon IgA epi yo te apovri nan hESC-Exos. hUC-MSC-Exos sitou genyen pwoteyin Cluster C, ki kontwole repons konpleman an, enfeksyon mikwòb, siyal HIF-1, siyal MAPK, chemen metabolik, ak chemen NF-κB. Pwoteyin nan Cluster d, ki te rich nan hiPSC-Exos, te patisipe nan reglemante siyal Ras, fosforilasyon oksidatif, ak siyal mTOR. Pwoteyin nan Cluster e te pi abondan nan tou de hiPSC-Exos ak hESC-Exos pase nan hUC-MSCExos, epi yo te patisipe nan plizyè pwosesis metabolik, tankou sik sitrat, sik selil, siyal ensilin, metabolis asid gra, ak siyal AMPK. . Pwoteyin nan Cluster f te patisipe nan reglemante reabsorpsyon kalsyòm, glikoliz / glikoz, siyal adrenèjik, ak metabolis piruvat epi yo te apovri nan tou de hUC-MSCExos ak hiPSC-Exos. Pwoteyin nan diferan grap yo ki nan lis nan dosye adisyonèl 4.

pwofil miRNA twa kalite exosome yo

Pou mennen ankèt sou pwofil miRNA twa kalite exosome yo, yo te izole RNA total de exosomes pou koup bout 5' ak 3' pou transkripsyon envès ki vin apre. Yo te itilize cDNA yo jwenn pou konstriksyon bibliyotèk ak tès laj. Nimewo entegrite RNA (RIN) te 2.7, 2.6, ak 2.6 nan hESC-Exos, hiPSC-Exos, ak hUC-MSC-Exos, respektivman (Fichye adisyonèl 1: Fig. S9A). Detèminasyon konsantrasyon RNA revele ke hESC-Exos domine chaj RNA a, ki te swiv pa hiPSC-Exos ak hUC-MSCExos (Fichiye adisyonèl 1: Fig. S9B). Koefisyan korelasyon Pearson a (Fichiye adisyonèl 1: Fig. S9C) ak PCA (Fichiye adisyonèl 1: Fig. S9D) yo te itilize pou evalye repetibilite miRNAs quantitatively. Heatmaps yo te itilize pou reprezante miRNA yo eksprime diferansye nan twa kalite exosome (Fichye adisyonèl 1: Fig. S9E), ak kantite miRNA eksprime diferansye nan P.<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Pou mennen ankèt sou miRNA ki enplike nan pwosesis byolojik, yo te filtre tèt miRNA yo nan P<0.05 and read count>1000 pou plis prediksyon jèn sib. Lè sa a, jèn anrichi yo te sibi analiz GO ak KEGG. Rezilta yo te endike ke hESC-Exos miRNAs siyifikativman afekte pwosesis sa yo: Rap1, PI3K-AKT, kalsyòm, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, sik selilè, AMPK siyal chemen, elatriye (KEGG analiz) (Fig. 5D), ak sik selilè a, devlopman miltip òganis, transdiksyon siyal entraselilè, diferansyasyon selil, aje, siyal Wnt, ak metabolis asid gra. (pwosesis byolojik) (Fig. 5G). Sib anrichisman jèn nan hiPSC-Exos miRNAs endike ke pwosesis sa yo te siyifikativman reglemante: PI3K-AKT, Rap1, Ras, Kalsyòm, Hippo, cAMP, ak cGMP-PKG siyal chemen, elatriye (KEGG analiz), ak sik selilè a, devlopman miltip òganis, fosforilasyon, diferansyasyon selilè, migrasyon selilè, ak repons a ipoksi. (pwosesis byolojik) (Fig. 5H). Nan rezo regilasyon hUC-MSC-Exos miRNAs, pwosesis byolojik ki pi posib yo te: Rap1, Ras, PI3K-AKT, kalsyòm, cAMP, Hippo, sik selilè, JAK-STAT, ak chemen siyal HIF-1. . (KEGG analiz) (Fig. 5F), ak fosforilasyon, transdiksyon siyal entraselilè, ATP obligatwa, divizyon selilè, metabolis lipid, T selil ko-stimulasyon, geri blesi, NF-κB obligatwa, ak repons enflamatwa. (pwosesis byolojik) (Fig. 5 I). Yo te montre rezo senk pi gwo miRNA yo ak chemen regilasyon yo tou (Fichye adisyonèl 1: Fig. S10).

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】