Sible Laktat Dehydrogenase A ak Catechin resansibilite selil kansè gastric SNU620/5FU pou 5-Fluorouracil Pati 2

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

2.5. Cotreatment CA ak 5Fu pwovoke apoptoz mitokondriyo depandan ROS

Depi anpèchman LDHA dirèkteman ogmante ROS mitokondriyo a ak pèt nan potansyèl manbràn li yo, imedyatman pwovoke apoptoz [16,29], yo te egzamine faktè ki gen rapò ak apoptoz mitokondriyo ROS-medyatè. CA oswa 5FU sèl tretman yon ti kras ogmante mitokondriyo ROSlevel nan selil SNU620/5FU lè yo mezire pa sikometri koule lè l sèvi avèk MitoSOX. Sepandan, cotreatment ak CA ak 5FU siyifikativman amelyore pwodiksyon mitokondriyo ROS. Sa a ogmante pwodiksyon ROS te ranvèse pa Mito-TEMPO, yon antioksidan mitokondri yo vize (Figi 5A-C). Anpèchman kwasans apre tretman ak CA ak 5FU te refè tou sou tretman Mito-TEMPO nan selil SNU620 / 5FU (Figi 5D). Pli lwen, apoptoz te evalye atravè tach Annexin V-FITC / PI nan selil SNU620 / 5FU. Kotreatman ak CA ak 5FU ogmante kantite selil apoptotik nan mitan selil SNU620/5FU (Figi 6A, B). Fragmantasyon mòfolojik nikleyè parèt pandan apoptoz, epi li ka obsève pa 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tach [30,31]. Yo te jwenn fwagmantasyon ADN yo te ogmante siyifikativman nan gwoup cotreatment la, konpare ak gwoup kontwòl la (Figi 6C). Finalman, yo te egzamine byomarkè apoptoz ki gen ladan Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3, ak PARP. Cascade proapoptotic la te ogmante apre cotreatment ak CA ak 5FU nan selil SNU620/5FU (Figi 6D). Konklizyon sa yo sijere ke cotreatment ak CA ak 5FU pwovoke apoptoz nan selil SNU620/5FU.

Figi 5. Kotreatman ak catechin (CA) ak 5-fluorouracil (5FU) ogmante pwodiksyon mitokondriyo ROS: (A)SNU620/5FU selil yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan CA,5FU（10 μM）, ak Mito. -TEMPO（20 μM） pou 48 h. Yo te mezire ROS mitokondriyal selil yo atravè analiz FACS lè l sèvi avèk MitoSOXTM Wouj; (B) graf ba a montre pousantaj selil ki pozitif pou tach MitoSOX; (C) imaj mikwoskòp fluoresans (X100) nan selil SNU620/5FU tache ak MitoSOX. yo te prezante; (D) yo te mezire viabilite selil yo atravè tès MTT. Yo montre rezilta yo kòm mwayen ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Figi 6. Ogmantasyon apoptoz pa katechin (CA) ak 5-fluorouracil (5FU) cotreatment; Selil SNU620/5FU yo te trete ak CA （10 uM） ak/oswa 5FU （10 μM） pou 48 h∶（A） yo te analize kantite selil apoptotik atravè FACSanalysis lè l sèvi avèk tach PI-Annexin V; (B) graf la endike. pousantaj selil yo nan faz apoptotik bonè ak an reta. Yo montre rezilta yo kòm mwayen ± SEM.**p<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Tanpri klike la a pou w konnen plis

3. Diskisyon

Nan etid sa a, pou karakterize ak evalye chemoresistance nan 5FU, nou te itilize selil SNU620/5FU, ki te etabli pa ekspoze alontèm nan 5FU ak yon ogmantasyon seri nan konsantrasyon dwòg [32]. Yo rapòte selil SNU620 paran yo genyen yon mutan p53 ki gen yon sipresyon omozigòt nan exon 5 [33]. Ki baze sou yon mikroarray ADN, plizyè jèn ki enplike nan chimyorezistans, ki gen ladan thymidylate sentetaz, domaj espesifik ADN obligatwa pwoteyin 2, clusterin, ak midkine, yo elve nan selil SNU620/5FU [32]. Plizyè etid anvan yo te itilize liy SNU620/5FUcell kòm yon modèl pou evalye efikasite nan vitro nan dwòg kont rezistans nan 5FU atravè anti-mitoz, aktivasyon AMPK, ak siyal reseptè cannabinoid [34-36]. Sepandan, karakteristik metabolik yo ak nivo ekspresyon jèn ki gen rapò ak metabolis nan selil SNU620/5FU yo ak wòl yo nan chemorezistans pa te lajman envestige.

Isit la, nou demontre ke selil SNU620/5FU yo gen fenotip glikolitik avanse, ki gen ladan pwodiksyon laktat ki wo ak ekspresyon de anzim ki gen rapò ak konvèsyon piruvat nan laktat, tankou LDHA. Fosforilasyon PDHA1, ki reprezante aktivite PDH redwi pa PDK2 ak PDK3 ki wo, ogmante tou nan selil SNU620/5FU ki reziste, konpare ak selil paran SNU620 yo. Sepandan, OCR pa te siyifikativman diminye nan selil rezistan yo. Yon eksplikasyon posib pou diferans sa a se plastisit eleman nitritif selil kansè yo pou sik TCA a, se sa ki, asid amine oswa asid gra ki sòti acetyl-CoA, pa sèlman acetyl-CoA ki sòti nan glikoz, ki ka bay substra nan sik TCA [37]. ].Nan korelasyon ak sa a, 5FU ki reziste selil kansè nan gastric ankouraje stemness atravè oksidasyon mitokondriyo asid gra [38]. Anplis de sa, rezistans 5FU te gen rapò ak ogmante mas ak aktivite mitokondriyo, ki gen ladan ekspresyon chèn transpò elèktron (ETC) anzim ak konsomasyon oksijèn [39,40]. Kidonk, nou konsantre sou modulasyon LDHA pou resansibilite rezistans 5FU a. Dapre rezilta nou yo, anpèchman aktivite LDHA ak oxamate oswa CA avèk siksè siprime kwasans selil SNU620/5FU ki reziste ak resansibilite yo nan tretman 5FU. Konklizyon sa yo te montre yon bon korelasyon ak sa yo nan etid anvan yo, ki te rapòte ke anpèchman jenetik oswa famasi nan LDHA avèk siksè redwi rezistans nan chimyoterapi, ki gen ladan 5FU [19,41,42]. Kidonk, nou te sipoze ke anpèchman LDHA ta ka ase pou siprime rezistans kont 5FU nan selil SNU620/5FU.

Cistanche ka amelyore iminite

Plizyè molekil sentetik, tankou oxamate, FX11, PSTMB, ak GNE-140 yo te etabli kòm inibitè ti molekil LDHA [11,43]. Pami sa yo, yo te rapòte FX11 kòm yon sansibilize nan chimyoterapi nan selil timè ki reziste [44]. Sepandan, byenke anpil inibitè LDHA yo anba kontwòl pou apwobasyon kòm nouvo dwòg antikansè, okenn nan yo pa te apwouve ankò. Kidonk, plis kandida ki sanble ak dwòg yo oblije jenere nouvo inibitè LDHA [45]. Konpoze natirèl yo te konsidere kòm resous potansyèl pou dwòg antikansè, patikilyèman nan simonte chimyorezistans kòm yon terapi konbinezon [46,47]. Se poutèt sa, vize metabolis kansè, espesyalman metabolis glikoz ak pwodwi natirèl ki sòti nan plant se yon tandans rechèch émergentes pou devlopman nouvo terapi kansè [48].

Pli lwen, plizyè rapò te sijere ke pwodwi natirèl, tankou gossypol, galloflavin, crocetin, machin A, ak EGCG, se pisan inibitè LDHA [43,49,50]. Malgre ke nan mitan sa yo, gossypol gen pi pisan aksyon inhibition sou LDHA (IC50=9.8 uM), li tou inibit aktivite a nan LDHB, ki konvèti laktat nan piruvat [51]. Rezilta nou yo te demontre ke EGCG, yon inibitè LDHA etabli ak yon sansibilize nan chimyoterapi 5FU [22-25], fè efè inhibition sou tou de aktivite LDHA ak LDHB. Pami inibitè LDHA ki sòti nan pwodwi natirèl ki montre aktivite inhibitor espesifik LDHA, tankou machin A(IC50 =84 μM), crocetin （IC50 =54.9 μM）, ak CA （IC{{13} }.69 μM）【49,50】, CA te montre pi bon efè suppressive sou aktivite LDHA ki gen rapò ak valè ICsn la.Malgre ke estrikti chimik CA ak EGCG yo sanble anpil eksepte pou kantite asid adisyonèl galik, selektivite inhibition yo te pa menm bagay la tou.Anplis de sa, malgre CA se konpoze ki pi senp la, konpare ak dérivés li yo, li te montre pi bon aksyon inhibition sou tou de pwodiksyon laktat ak aktivite LDHA.Kidonk, yo ta dwe fè yon etid vaste relasyon estrikti-aktivite pou demontre CA kòm yon potansyèl nouvo zo rèl do pou devlopman inibitè LDHA espesifik ak ki pisan.

EGCG te konnen ke yon inibitè konpetitif nan NADPH. Anplis de sa, EGCG anpeche translokasyon ak repwodiksyon NADPH oksidaz [52-54]. Sepandan, dapre rezilta yo modèl molekilè, CA ak EGCG yo estriktirèl sitiye nan diferan kote (Figi 3A, B).Anplis de sa, yo pa t 'montre korelasyon an nan espesifik nan anpèchman nan aktivite LDHA ak LDHB, ki itilize NADH la. ak NAD plis kòm yon kofaktè, respektivman. Soti nan done sa yo, nou sipoze ke CA pa gen okenn korelasyon dirèk ak EGCG nan mekanis nan konpetisyon ak NAD (P) H. By wout la, anpèchman nan LDHA pa plizyè inibitè, tankou FX11, GSK 2837808A, NCI-737, ak NCI-006, redwi pwodiksyon NADt ak ogmante akimilasyon NADH, kidonk diminye rapò a nan NAD plis. /NADH[16,17,55]. Apoptoz pwovoke pa chemen domaj ADN depandan p53/NAD ogmante tou pa anpèchman LDHA lè l sèvi avèk siRNA oswa inibitè chimik, NH -2 [56]. Yo te rapòte chemen siyal GCN2-ATF4 a kòm yon lòt mekanis ki responsab lanmò selil apoptotik ki te pwovoke pa inibitè LDHA a, GSK 2837808A [17]. Piske rapò NAD/NADH jwe yon wòl kle nan omeyostazi redox ak pwopagasyon selil [5758], CA kòm yon inibitè LDHA ta ka afekte selil kansè 5FU ki reziste atravè modulasyon rapò NAD plis /NADH.

CA pwovoke lanmò selil nan tou de paran SNU620 ak 5FU ki reziste selil SNU620/5FU. Sepandan, lanmò selil CA-induit te depann de LDHA atravè rediksyon shRNA nan selil SNU620/5FU. Anplis de sa, cotreatment nan CA ak 5FU te montre efè antikansè adisyonèl sou selil 5FU ki reziste. Kòm deja rapòte [16,59], anpèchman nan LDHA ogmante ROS la ak konsekans siprime kwasans lan nan selil kansè yo. Lè LDHA te anpeche, metabolis enèji a te konvèti soti nan glikoliz nan sik la TCA ak fosforilasyon oksidatif mitokondriyo [60]. Kidonk, selil kansè yo fè plis pwodiksyon ROS, sa ki lakòz domaj nan manbràn mitokondriyo ak apoptoz mitokondriyo-induit [61,62].An bon akò ak etid anvan yo, CA pwovoke lanmò selil apoptotik atravè yon mitokondriyo ROS-depandan chemen. Ogmantasyon ROS-defans kapasite ak redwi siyal apoptotik yo se pwopriyete komen nan selil kansè chemoresistant, espesyalman nan selil 5FU ki reziste 3,63]. Anplis de sa, chanjman nan metabolis kansè, patikilyèman nan metabolis glikoz, tou mennen nan rezistans nan chimyoterapi atravè chanjman nan aktivite selilè, tankou reparasyon ADN aberan, otofaji amelyore, redwi apoptoz, defans kont ROS, ak ogmante sekresyon nan exosomes [9,64,651]. . Kidonk, vize anzim glikolitik, ki gen ladan LDHA, ak CA ta ka yon estrateji altènatif pou simonte chemoresistance, espesyalman nan kansè nan gastric 5FU ki reziste. Anjeneral, timè malfezan divize rapidman se trè sansib a inibitè sentèz ADN ki gen ladan 5FU, konpare ak tisi nòmal. Sepandan, kèk selil kansè yo ka devlope rezistans nan tretman an atravè plizyè mekanis, jan sa te dekri anvan [34-36]. Kotreatman nan konpoze bioaktif ak chimyoterapi konvansyonèl gen yon efè ki pi wo, konpare ak yon sèl konpoze, sou ralanti devlopman nan rezistans |66. Se poutèt sa, efè byolojik phytochemicals espesifik ak efè sitotoksik pwouve ke yo administre ak chimyoterapi konvansyonèl yo vize yon seri pi laj nan chemen siyal nan selil kansè yo, ki gen ladan metabolis kansè ak fonksyon mitokondriyo, yo ta dwe siperyè konpoze sèl nan jesyon kansè paske yo ka retade. devlopman rezistans [67]. Nan etid sa a, konbinezon an nan CA ak 5FU te montre yon anpèchman ki pi wo sou viabilite selil, konpare ak sa yo ki nan yon tretman sèl. Anplis, nou te demontre ke anpèchman nan aktivite LDHA ak apoptoz mitokondriyo ROS-medyatè ki vin apre ta ka mekanis ki kache efè a sansibilize nan CA sou selil 5FU ki reziste (Figi 7).

Anplis de puisans ak espesifik nan anpèchman LDHA, CA pi an sekirite pase deja etabli natirèl pwodwi-sòti inibitè LDH. Anplis, CA se yon engredyan chimik byen li te ye nan te vèt, epi sekirite li yo ak pwopriyete farmakodinamik yo te konfime nan etid anvan yo [68-70]. Sepandan, yon evalyasyon egzak toksisite nan koadministrasyon CA ak 5FU poko fèt. Anplis de sa, efikasite nan in vivo nan CA nan selil kansè 5FU ki reziste pa te egzamine nan etid sa a. Sepandan, etid anvan yo rapòte sou efikasite antikansè in vivo CA ak dérivés li yo pou simonte chemorezistans, ki gen ladan rezistans 5FU nan gastric imen ak kansè nan kolon [71-77]. Nan etid sa a, nou konsantre sou anpèchman LDHA kòm yon mekanis molekilè pi gwo nan CA nan simonte rezistans nan 5FU. Se poutèt sa, pou devlope CA kòm yon adjuvant roman pou selil kansè chemoresistant, yo ta dwe evalye efikasite nan vivo ak sekirite nan cotreatment CA ak 5FU atravè etid sou bèt vaste, ki gen ladan modèl xenograft ak bon evalyasyon toksisite laboratwa.

4. Materyèl ak Metòd

4.1.Materyèl

Yo te achte antikò kont poly(ADP-ribose)polymerase, kaspas-3, ak kaspas-9 nan Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Antikò kont LDHA, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ak PDHA1 yo te achte nan men Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ak sa ki kont fosfò-PDHA1 ak PDK3 yo te achte nan men Abcam ( Abcam, Cambridge, MA, USA). Anplis de sa, yo te achte antikò kont PDK2 ak PDK4 nan Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, USA), sa yo ki kont PDK1 yo te jwenn nan Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), ak sa yo ki kont selil B. lenfom-2(Bcl-2) ak Bcl{-2-pwoteyin X ki asosye yo te achte nan men Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). MitoSOX te achte nan men Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Pwodwi chimik ak reyaktif, ki gen ladan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT),4',{{22} }diamidino-2-phenylindole, oxamate, nikotinamid adenine dinukleotide, CA, ak CA dérivés (EC GC, EGC, ak EGCG) te achte nan men Merck (Merck, Darmstadt, Almay). -Nikotinamid adenine dinucleotide (fòm oksidasyon) te achte nan men endistri chimik Tokyo (Tokyo endistri chimik, Tokyo, Japon).

4.2.Kilti Selil

Kansè gastric imen SNU620, SNU620/5FU, ak AGS, kansè nan pankreyas Panic-1 ak MIA PaCa-2, ak kansè nan kolon LS174T ak selil RKO yo te jwenn nan Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Kore di). ).SNU620, SNU620/5FU, AGS, ak LS174T selil yo te kiltive nan Roswell Park Memorial Institute mwayen 1640 (RPMI -1640) (Welgene, Daegu, Kore di), complétée ak 10 pousan chalè-inaktive fetis serom fetis (FBS). )(Gibco, New York, NY, USA) ak 1 pousan penisilin/streptomycin (Invitrogen), ak selil Panc-1, MIA PaCa{-2, ak RKO yo te kiltive nan mwayen Eagle's modifye Dulbecco a (Welgene). ) ki gen 10 pousan FBS ki inaktive chalè ak 1 pousan penisilin/streptomycin. Tout selil yo te kiltive nan yon CO umidifye, enkibatè a 37 degre, ak 5 pousan CO2.

4.3. Selil Viabilite Essay

Nivo sitotoksisite CA ak 5FU nan SNU620 ak SNU620/5FUcells yo te mezire lè l sèvi avèk yon tès MTT. Selil yo te kiltive nan 24-plak byen (2 × 104 selil / pi) ak konsantrasyon ki endike nan CA ak 5FU pou jou deklare a. Lè sa a, solisyon MTT (2.0 mg/mL) te ajoute nan chak pi, ki te swiv pa 3-4 èdtan nan enkubasyon nan 37 degre ak 5 pousan CO, nan yon enkibatè kilti selil. Mwayen kilti a te retire imedyatman, epi absòbe nan kristal formazan te fè soti nan selil vivan. DMSO te ajoute pou fonn kristal formazan yo, epi li te mezire nan 540 nm lè l sèvi avèk yon Spectramax M2 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

4.4. To asidifikasyon ekstraselilè (ECAR) ak to konsomasyon oksijèn (OCR)

ECAR ak OCR, ki endike pousantaj selilè glikoliz ak fosforilasyon oksidatif, respektivman, te kontwole ak analizeur Seahorse XF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), jan sa dekri deja [78,79]. Yon ti tan, 60,000 selil SNU620 oswa SNU620/5FU pou chak pi yo te simen nan plak sis-pi Seahorse XF nan mwayen RPMI ki te konplete ak 1 pousan penisilin/streptomycin. Apre yon enkubasyon 30 minit, yo te ranplase mwayen ki soti nan chak pi ak 80 uL medyòm san serom prechofe ak 5 mM oxamate, yon inibitè LDH estanda [11]. Lè sa a, selil yo te enkube nan 37 degre C pou 24 èdtan. Apre enkubasyon, yo te ranplase mwayen ki soti nan chak pi ak 180 μL mwayen XFbase prechofe (ki gen 10 mM glikoz, 2 mM glutamin, ak 1 mM piruvat sodyòm; pH 7.4) pou mezire ECAR ak OCR. Yo te analize rezilta yo lè l sèvi avèk lojisyèl Wave 2.6.0.31 (Agilent Technologies).

4.5.Quantitatioe Reverse transcription-polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

Total RNA yo te ekstrè lè l sèvi avèk RiboEx Total RNA Ekstraksyon Twous (GeneAll Biotechnology, Seoul, Kore di), epi cDNA te sentèz lè l sèvi avèk yon twous transkriptaz ranvèse (Promega, Madison, WI, USA). , ak kantite total cDNA sentèz se 20 μL. Yo te itilize chak twous dapre enstriksyon manifakti a. Yo te fè PCR quantitative lè l sèvi avèk yon Sistèm PCR an tan reyèl StepOneTM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), ak Real HelixgPCR la. Twous (NanoHelix, Daejeon, Kore di), pou 40 sik ki gen ladann 15 s a 95 degre Cand 1 min nan 60 degre. Nivo mRNA relatif yo te nòmalize nan nivo 18S ribosomal RNA, ki te sèvi kòm yon kontwòl andojèn. yo itilize pou qRT-PCR yo ki nan lis nan Tablo 1.

4.6.Wester" analiz blot

Selil yo te lave ak 1 × PBS, ak pwoteyin total yo te ekstrè nan selil lè l sèvi avèk tanpon RIPA ak 1 pousan tanpon NP -40 lysis ki gen tablèt bwason inibitè proteaz (Roche, Basel, Swis). Chak konsantrasyon pwoteyin yo te mezire lè l sèvi avèk tès pwoteyin Bio-Rad la. Kantite egal pwoteyin yo te fraksyon nan chak echantiyon jiska 8-15 pousan SDS-PAGE, epi answit pwoteyin yo te transfere nan manbràn nitrocellulose (GE Healthcare, Munich, Almay) atravè elektwoforèz. Manbràn yo te bloke nan tanperati chanm (20-25 degre) pou 1 èdtan lè l sèvi avèk 5 pousan lèt sèk san grès ak enkubasyon ak antikò prensipal nan 4 degre lannwit lan. Imedyatman, manbràn sa yo te lave twa fwa ak 1 × Tris-tampon saline pou 10 min. Gwoup espesifik nan pwoteyin yo te mezire ak yon sistèm D 'chimiluminesans (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). Ekspresyon an nan pwoteyin te ajiste pa GAPDH. 4.7.Laktat Pwodiksyon Esè

Pwodiksyon laktat te mezire nan kilti kilti SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T, ak RKO selil. Selil sa yo te enkubasyon pou 1d nan 37 degre, ak medya kilti yo te imedyatman ranplase ak fenol wouj-gratis mwayen, ki te swiv pa enkubasyon pou 1 èdtan nan 37 degre. Lè sa a, mwayen chak selil yo te evalye lè l sèvi avèk yon twous komèsyal laktat fluorometric (BioVision, Milpitas, CA, USA).

4.8. LDHA ak LDHB Aktivite Essay

Pou detekte aktivite LDHA, konsantrasyon ki endike nan CA yo te enkube pou 20 minit nan yon tanpon ki gen 2 mM piruvat, 20 μM NADH, ak 20 mM HEPES-K plis （pH7.2）. Pou aktivite LDHB, yo te itilize yon tanpon ki gen 1 M Tris-HCl (pH8.0), 25 mM NAD plis, ak 2 M sodyòm L-laktat. Yon ti tan, 10 nanogram nan chak nan pirifye recombinant LDHA ak LDHB pwoteyin yo te itilize pou tès yo nan vitro LDHA ak LDHB aktivite. Yo te itilize yon mikwogram nan pwoteyin total ki soti nan lisat selil yo pou analiz aktivite intraselilè LDHA ak LDHB kòm yon sous anzim. Fluoresans NADH nan yon longèdonn eksitasyon 340 nm ak yon longèdonn emisyon 460 nm te detekte lè l sèvi avèk yon espektrofluoromètr (Spectramax M2; Aparèy molekilè), jan yo dekri deja [80]. Aktivite LDHA te mezire pa kantite diminye NADH, tandiske aktivite LDHIB te evalye pa mezire kantite NADH konvèti nan NAD plis.

4.9.Entèraksyon Pwoteyin-Ti Molekil

Yo te prevwa entèraksyon ant pwoteyin ak ti molekil lè l sèvi avèk pwogram Pyrex la. Yo te itilize molekil LDHA (PDB ID:1l10) ak estrikti 2D CA ak EGCG nan baz done konpoze NCBI PubChem nan Pyrex. ID CA a te 9064 ak EGCG te 65064. Distribisyon relatif chaj sifas la te montre ak rejyon asid la an wouj, rejyon debaz la an ble, ak rejyon net la an blan. Lyezon idwojèn nan konplèks LDHA ak CA oswa EGCG, respektivman, yo te montre kòm liy pwentiye nwa. Yo te jwenn sekans nan UniProt (https://www.uniprot.org, jwenn aksè nan dat 9 Novanm 2020) avèk nimewo aksè P00338(LDHA).

4.10.Transfèksyon RNA kout epengl (shRNA)

Yo te itilize pLKO.1 mock-vector ak shRNA vize vektè LDHA, jan sa te dekri deja [50]. Selil yo te simen nan plak sis-byen (2 × 10 selil degre / pi) ak enkubate lannwit lan. Selil SNU620/5FU yo te transfekte lè l sèvi avèk polyethyleneimine (PED) (Polyplus-transfection,llkirch, France), jèn, ak rapò PEI se 1:3. Lè sa a, selil transfekte yo te trete ak 1 ug / mL puromicin pou 1 semèn. Liy selil kontwòl la te pwodwi apre enfeksyon ak yon plasmid grenpe.

4.11.LDHA Ekspresyon twòp

Plasmid pDEST27-LDHA te konstwi pa subklonaj LDHA cDNA (achte nan Korea Human Gene Bank, Daejeon, Kore) nan vektè pDEST27(Invitrogen). Yo te fè de seri subklonaj pou LDHA. Pou rekonstriksyon LDHA a, selil SNU620/5FU-shLDHA yo te transfekte ak pDEST27-LDHA ak plasmid pDEST27 vid. Yon ti tan, selil yo te kiltive jiska 70 pousan konfluyans. Lè sa a, selil yo te trete ak yon melanj ki gen ladan 3ug ADN ak Lipofectamine 2000 (Invitrogen) pou 48 èdtan. Apre enkubasyon, selil yo te chwazi ak 200 ug/mL G418 pou 1 semèn. Lè sa a, pou konfime efikasite transfèksyon an, nou te fè tès Western blot la.

4.12.Apoptoz analiz

Selil apoptotik yo te detekte lè l sèvi avèk Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), dapre enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, selil yo te simen nan plak sis-byen (2 × 10 selil degre / pi) epi yo trete ak konsantrasyon endike nan CA ak 5FU pou 2 jou. Apre 2 jou nan tretman, selil la te lave ak 1 × PBS. Selil yo te sispann nan 500 μL nan tanpon obligatwa epi yo te trete ak 5 uL nan annexin V-FITC ak 5 μL nan yòd propidium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ki te swiv pa enkubasyon pou 15 min nan tanperati chanm nan. fè nwa a. Entansite fliyoresan yo te egzamine lè l sèvi avèk yon BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. Espès deteksyon mitokondriyo reyaktif oksijèn (ROS).

Yo te detekte pwodiksyon mitokondriyo ROS lè l sèvi avèk yon MitoSOX Red Mitokondrial Superoxide Endikatè (Thermo Fisher Scientific). Selil yo te simen nan plak sis-pou （2 × 10 degre selil/byen） ak Mito-TEMPO（20 μM; Sigma-Aldrich） te pretrete pou 1 èdtan anvan tretman dwòg. Selil yo te resuspend nan 1 mL nan 1 × fosfat-tanpon saline （PBS）, apre sa yo te ajoute 5 μM nan MitoSOX. Lè sa a, selil yo te enkube pou 10 min nan 37 degre. Entansite fliyoresan te analize lè l sèvi avèk yon BD FACS CANTO II (BD Biosciences). Imaj fluoresans te detekte pa mikwoskòp fluoresans (agrandisman, 100 ×) (Axioimager M1 mikwoskòp, Carl Zeiss, Oberkochen, Almay).

4.14.DAPI tach nwayo

SNU620/5FU te simen nan yon plak 24-byen (5 × 104 selil/byen) epi trete ak konsantrasyon ki endike nan CA ak 5FU pou 48 èdtan. Apre yo fin lave ak 1 × PBS, selil yo te resuspend nan 1- mL 1 × PBS. Lè sa a, selil yo te tache ak 4ug/mL DAPI pou 30 min nan tanperati chanm ak egzamine anba yon mikwoskòp fliyoresan (agrandisman, 200 ×) (Carl Zeiss).

4.15. Analiz estatistik

Rezilta viabilite selil, pwodiksyon laktat, ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, aktivite LDHB, apoptoz, ak ROS mitokondriyo yo te endike parapò ak valè kontwòl yo epi yo te eksprime kòm mwayen ± erè estanda nan mwayèn nan twa eksperyans endepandan. Diferans ki pi wo pase valè mwayèn chak gwoup te analize pa T-tès Elèv la, tandiske diferans ki genyen ant gwoup yo te analize pa yon sèl-fason analiz divèjans ak tès post hoc Tukey a lè l sèvi avèk GraphPad Prism (Version5.0, GraphPad Software, San. Diego, CA, Etazini).

5. Konklizyon

Ansanm, selil kansè gastric SNU620/5FU ki reziste yo gen fenotip glikolitik, ki gen ladan pwodiksyon laktat ki wo ak ekspresyon LDHA ki pi wo pase sa yo ki nan selil SNU620 paran yo. Limite glikoliz ak CA, kòm yon inibitè LDHA-espesifik, sansibilize selil SNU620/5FU nan 5FU. Anplis de sa, cotreatment ak CA ak 5FU ogmante ROS mitokondriyo ak lanmò selil apoptotik nan selil 5FU ki reziste. Konklizyon nou yo sijere ke CA ka yon kandida pwomèt pou devlopman yon dwòg adjuvant ki diminye rezistans nan chimyoterapi ki baze sou 5FU pa mete restriksyon sou aktivite LDHA.

Materyèl siplemantè: Sa ki annapre yo disponib sou entènèt nan https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22105406/s1, Figi S1: Efè 5FU sou viabilite SNU620/5FU clls, Figi S2: Kwasans SNU620 ak selil SNU620/5FU yo mezire pa konte selil, Figi S3: Nivo pwodiksyon laktat nan SNU620 ak SNU620/5FUcells, Figi S4: Ekspresyon izotip PDK nan selil SNU620 ak SNU620/5FU, Figi S5: Efè oksamat sou viabilite ak SNU620. Selil SNU620/5FU, Figi S6: Efè EGCG sou aktivite LDHA ak LDHB, Figi S7: Efè catechin (CA) sou nivo ekspresyon p-PDHA1, PDHA1, ak pwoteyin PDK yo, Figi S8: Analiz kalorimetri titrasyon izotèmik (ITC) nan LDHA a ak CA, Figi S9: ekspresyon LDHA nan selil SNU620/5FU transfekte ak shLDHA, Figi S10: Mezi fenotip glikolitik ak viabilite selil nan divès selil kansè, Figi S11: Done anvan tout koreksyon nan Western blot assay.

Atik sa a extrait de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms