Efè neropwotektif ak mekanis Procyanidins in vitro ak in vivo Pati 2

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

3. Diskisyon

Plizyè etid yo montre ke PC yo montre gwo aktivite antioksidan ak antioksidan ]25-27I, e ke estrès oksidatif ki te koze atravè pwodiksyon twòp ROS ak/oswa andikap sistèm defans antioksidan jwe yon wòl enpòtan nan maladi neurodegenerative [ -6,28,29]. Sepandan, efè neuroprotective ak mekanis PC yo konsènan domaj oksidatif yo toujou klè. Se poutèt sa, etid sa a fè rechèch sou efè ak mekanis PC yo nan neropwoteksyon.

Tanpri klike la a pou w konnen plis

Nan etid la prezan, konsantrasyon apwopriye PC yo amelyore nivo anzim antioksidan, ki gen ladan GSH-Px, CAT, ak SOD, men diminye nivo ROS ak MDA nan modèl domaj oksidatif konpare ak mezi lè l sèvi avèk H, O, pou kont li. Konklizyon sa yo prezan yo te konsistan avèk etid anvan yo ki sijere ke yon sipleman PC ki ba atravè rejim alimantè ka amelyore aktivite yo nan GSH-Px, CAT, ak SOD nan porsele sevre [30]. Yon lòt etid tou sijere ke PC yo siyifikativman ogmante aktivite CAT ak SOD ak diminye kontni MDA, kidonk amelyore kalite espèm kabrit [31].

Cistanche ka amelyore iminite

Chemen Nrf2/ARE se yon chemen antioksidan enpòtan [32-34]. Nòmalman, Nrf2 abite nan sitoplasm la, kote li mare ak pwoteyin inhibitor, Keap135,36]. Sou eksitasyon H2O2, Nrf2 disoye soti nan Keap1, inisye sistèm defans andojèn antioksidan, epi imedyatman transloke nan nwayo a [34,37,38]. Apre sa, li reyaji ak ARE pou aktive yon seri jèn pwoteksyon selil ak antioksidan, tankou GCLC, GCLM, NOO1, ak HO-139,40]. An repons a estrès oksidatif, menm jan ak chanjman yo wè pandan eksitasyon H-O2, Nrf2 dissociates de Keap1 nan sitosol la epi li transloke nan nwayo a, li lye ak sekans ARE a pou aktive transkripsyon jèn kriyoprotektif [41,42]. Nou te obsève ke konsantrasyon apwopriye PC yo te fasilite lokalizasyon nikleyè Nrf2 anba kondisyon H, O2-lesioning nan selil PC12. Anplis, konsantrasyon apwopriye PC yo te kontwole nivo ekspresyon NOO1, HO-1, GCLM, ak GCLC, yo tout ka dirèkteman aji pou elimine radikal gratis ak molekil oksidatif [43]. Pakonsekan, rezilta sa yo te montre ke konsantrasyon apwopriye PC yo ogmante nivo chemen Nrf2/ARE. Apre sa, yo te itilize silans jèn Nfr2 atravè siRNA Nrf2 pou plis evalye wòl aktivasyon Nrf2/ARE nan neropwoteksyon PC yo kont H, O2-pwovoke domaj oksidatif. Selil Nrf2-siRNA-transfekte yo endike yon diminisyon enpòtan nan ekspresyon Nrf2. Ansanm, nou te jwenn ke Nrf2 knockout aboli PCs-medyatè pwoteksyon kont H2O,-trete andikap nan viabilite selil, ak Nrf2 knockout tou aboli efè yo antioksidan nan PC yo. Konklizyon sa yo te selon yon etid anvan ki sijere ke amelyore deklanchman chemen Nrf2/ARE kontribye nan neropwoteksyon [44]. Se poutèt sa, rezilta prezan yo endike ke chemen Nrf2/ARE ka reprezante yon sib famasi nan PC yo pou prevansyon neurodegeneration.

4. Materyèl ak Metòd 4.1. Pwodwi chimik ak reyaktif

H2O2 te achte nan men HUSHI (HUSHI, Shanghai, Lachin). CCK-8, NAC te achte nan men Beyotime (Beyotime, Shanghai, Lachin). PCs,2',7/-dichlorofluorescein diacetate, MDA, GSH-Px, twous dyagnostik SOD, ak twous dyagnostik CAT yo te achte nan men Solarbio (Solarbio, Beijing, Lachin).RNAi Plus, PrimeScript RT reagent Twous ak gDNA Eraser, ak SYBR Premix Ex Tag II te achte nan men Takara (Takara, Shiga, Japon). Nrf2-siRNA, control-siRNA, ak lipofectamine 2000 yo te jwenn nan GenePharma (GenePharma, Shanghai, Lachin). Antikò prensipal sa yo ak antikò segondè korespondan yo te jwenn nan Proteintech (Proteintech, Wuhan, Lachin): Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, lamin B, ak GAPDH.

4.2. Kilti Selil

Selil PC12 yo te jwenn nan Koleksyon Nasyonal Kilti Selil Otantifye yo. Selil yo te kenbe nan medyòm DMEM ki te konplete ak 10 pousan serom fetis bovin ak penisilin-streptomycin (100 U/mL; 100 ug/mL) nan yon enkibatè imidite a 37 degre ak 5 pousan CO2.

4.3. Selil Viabilite Essays

Selil PC12 yo te simen nan 96-plak byen nan yon dansite 1 × 104 selil / pi. Selil yo te ekspoze a diferan konsantrasyon PC oswa NAC （20 μM） pou 24 èdtan, apre sa yo te enkube ak 200 μM H2O2, pou 24 èdtan. Apre sa, yo te ajoute 10 μLof CCK-8solisyon nan chak pi epi yo te enkube pou 1 èdtan, apre sa yo te mezire absorbans nan 450 nm.

4.4. Antretyen Pwason

Apwobasyon etik pou itilizasyon bèt te akòde pa Komite Konsèvasyon ak Itilizasyon Animal nan Sant Eksperimantal Animal nan Zhejiang University (ZJU20200125). Pwason zèb adilt (Danio rerio, souch AB) yo te jwenn nan sant bèt laboratwa nan Zhejiang University epi yo te kenbe nan 28±1C anba yon sik limyè/fè nwa 14/10-h [21J. Pwason yo te manje Artemia nauplii de fwa pa jou. Pou pwodui anbriyon, yo te mete pwason zèb adilt lannwit lan nan tank elvaj nan yon rapò 1:1, gason:fi. Spawning te deklanche nan 2 èdtan apre limyè yo te limen nan denmen maten. Anbriyon yo te leve nan dlo anbriyon a 28 degre [45].

4.5. Mezi ROS

Pou mezire pwodiksyon ROS nan vivo, lav pwason zèb (souch AB), 3 jou apre fètilizasyon （pdf） yo te ekspoze a NAC（30 μM） oswa divès kalite konsantrasyon PC nan absans oswa prezans 300 μM nan H,O, pou 4. jou. Apre sa, nan 7 pdf, diferan gwoup tretman yo te transfere nan yon plak 24-byen (10 lav zebrafish pou chak gwoup) trete ak 20 uM nan 2',7'-dichlorofluorescein diacetate solisyon, epi yo te enkube pou 60 min nan. fè nwa a nan 28.5 degre C [46]. Apre sa, yo te lave lav yo twa fwa ak mwayen anbriyon pou retire depase 2'7'-dichlorofluorescein dyacetate. Lè sa a, lav yo tache yo te obsève ak imaj anba yon mikwoskòp konfokal lazè Olympus. Entansite fliyoresan chak lav endividyèl yo te mezire atravè lojisyèl Image].

Pou mezire pwodiksyon ROS an vitro, selil PC12 yo te simen nan 6-plak byen nan yon dansite 2 × 10 * selil / pi. Selil yo te ekspoze a diferan konsantrasyon nan PC oswa NAC (20 uM) pou 24 èdtan epi yo te Lè sa a, enkube ak 200 uM nan HO, pou 24 èdtan. Selil yo te enkube ak 10 μM nan 2',7'-dichlorofluorescein diacetate solisyon nan fè nwa a pou 30 min; apre sa, yo te retire solisyon an lank, epi selil yo te lave twa fwa nan saline ki gen tanpon fosfat. Lè sa a, selil yo te obsève ak imaj anba yon mikwoskòp konfokal lazè Olympus. Entansite fliyoresan selil yo te quantifye atravè lojisyèl Imaj].

4.6.Evalyasyon MDA, GSH-Px, SOD, ak CAT

Lav zebrafish （AB souch） at3 pdf te ekspoze a NAC （30 μM） oswa divès kalite konsantrasyon PC nan absans oswa prezans 300 uM H2O, pandan 4 jou. 7 dpf zebrafish yo te anestezi ak tetracaine epi yo te omojeneize apre etanasya sou glas. MDA, GSH-Px, CAT, ak SOD yo te analize ansanm, dapre enstriksyon manifakti a. Chak eksperyans te genyen 20 lav, epi chak endèks mezire te repete an twa fwa.

Selil PC12 yo te simen nan 6-plak byen nan yon dansite 2 × 10 * selil / pi. Selil yo te ekspoze a diferan konsantrasyon PC oswa NAC (20 uM) pou 24 èdtan epi yo te Lè sa a, enkube ak 200 uM nan H2O, pou 24 èdtan. Selil PC12 yo te pwochen kolekte epi enkubate ak tanpon lysis. Aktivite MDA, GSH-Px, SOD, ak CAT yo te mezire lè l sèvi avèk twous tès korespondan yo, dapre pwotokòl chak manifakti yo. Chak endèks mezire te repete an triple.

4.7.Total ekstraksyon RNA, ranvèse transcription, ak kantite reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl

Lav pwason zèb (souch AB) at3 dpf te ekspoze a NAC (30 μM) oswa divès kalite konsantrasyon PC nan absans oswa prezans 300 uM H, O, pandan 4 jou. Apre tretman, RNA yo te ekstrè lè l sèvi avèk RNAiso, swiv enstriksyon manifakti a. Yo te transkri RNA ranvèse lè l sèvi avèk yon Twous PrimeScript RT ak yon gonm gDNA, swiv enstriksyon manifakti a (Takara, Shiga, Japon). Yo te fè PCR an tan reyèl ak yon sistèm PCR Applied Biosystems Vi-7 an tan reyèl lè l sèvi avèk SYBR Premix Ex TaqII -actin te itilize kòm yon jèn referans, epi yo te kalkile ekspresyon jèn relatif lè l sèvi avèk 2-AACt la. metòd. Sekans premye yo itilize yo ki nan lis nan Tablo 1.

4.8. Nrf2 siRNA Transfection

Nrf2-siRNA te itilize pou kraze Nrf2. Selil PC12 yo te simen nan 6-plak kilti byen epi yo te transfekte ak Nrf2-siRNA (80 nM) oswa kontwòl-siRNA lè l sèvi avèk Lipofectamine 2000, dapre enstriksyon manifakti a.

4.9.Preparasyon Pwoteyin Selil antye, Sitoplasmik ak Nikleyè

Pou fè ekstraksyon pwoteyin antye-selil, selil yo te kolekte epi enkubate ak tanpon RIPA lysis ki gen 1 pousan PMSF ak 1 pousan bwason inibitè proteaz pou 30 min sou glas. Lisat selil yo te santrifuje, epi yo te kolekte supernatant la epi estoke. Pou preparasyon fraksyonman subselilè, echantiyon selil yo te trete lè l sèvi avèk twous ekstraksyon pwoteyin nikleyè ak sitoplasmik. Kontni pwoteyin yo te teste lè l sèvi avèk tès BCA la. 4.10.Western Blotting

Echantiyon pwoteyin alikòt yo te rezoud pa SDS-PAGE epi yo te transfere nan manbràn polyvinylidene-difluoride. Lè sa a, blots yo te enkube ak antikò prensipal sa yo: Nrf2, Keapl, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, oswa GAPDH. Yo te lave manbràn an ak TBST pou 5 min; sa a te repete 5 fwa. Apre sa, blots yo te enkube nan peroksidaz-konjige antikò segondè. Finalman, bann pwoteyin yo te vizyalize lè l sèvi avèk yon reyaktif deteksyon ECL-plus Western blotting.

4.11.Essay Konpòtman Lokomotè

Lav zebrafish (souch AB) nan 3 pdf yo te ekspoze a NAC (30 μM) oswa divès kalite konsantrasyon PC nan absans oswa prezans 300 μM HO, pou 4 jou. Apre sa, nan 7 pdf, lav trete sa yo te plake nan 24-plak byen (yon pwason pou chak pi ak 12 lav pou chak gwoup). Nou te itilize Any-maze 4.73 pou mezire konpòtman locomoteur lav zebrafish, epi nou kalkile distans total vwayaje nan 10 min [47].

4.12.Estatistik analiz

Done yo montre kòm mwayèn ± devyasyon estanda (SD) nan omwen twa eksperyans endepandan. Yon sèl-fason analiz de divèjans (ANOVA) ak tès miltip Duncan yo te itilize pou detèmine siyifikasyon estatistik, ak diferans yo te konsidere kòm enpòtan lè p.<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">

5. Konklizyon

An konklizyon, rezilta prezan yo endike ke PC yo fè efè neuroprotective atravè aktive chemen Nrf2/ARE ak anzim dezentoksikasyon en li yo ak anzim antioksidan. Ansanm, PC yo ka gen yon efè pwoteksyon sou maladi neurodegenerative.

Kontribisyon otè:Conceptualization, JCandJZ.(Jijain Zhu); metodoloji, JC; lojisyèl, YC; validation, YZ., JZ(Jiawen Zhao) ak HY; analiz fòmèl, JC; ankèt, YC; resous, JZ (iajin Zhu); gerizon done, JC; ekri—preparasyon bouyon orijinal, JC; ekri-revizyon ak koreksyon, JZ.(iajin Zhu); vizyalizasyon, JC; sipèvizyon, DL; administrasyon pwojè, JZ (Jijain Zhu); akizisyon finansman, JZ(Jijain Zhu). Tout otè yo te li epi yo te dakò ak vèsyon ki te pibliye maniskri a.

Finansman:Rechèch sa a pa te resevwa okenn finansman ekstèn.

Deklarasyon Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl:Etid la te fèt dapre direktiv yo nan Deklarasyon èlenki, ak apwouve pa Komite Etik Konsèvasyon bèt ak Itilizasyon Komite nan Sant eksperimantal bèt nan Zhejiang University (ZJU20200125). Deklarasyon Konsantman Enfòme: Pa aplikab.

Deklarasyon Disponibilite Done:Done yo genyen nan atik la. Konfli enterè: Otè yo pa deklare okenn konfli enterè.

Egzanp Disponibilite: Echantiyon konpoze yo pa disponib nan men otè yo.

Atik sa a soti nan Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules