Revèy sikadyen an kontwole ekspresyon eritropoyetin ritmik nan ren murin lan

Pou plis enfòmasyon:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Sciesielsk et al

Cistanche tubulosa anpeche maladi ren, klike la a pou jwenn lapwodwi ak Cistanches

Jenerasyon ritm sirkadyèn se selil otonòm epi li depann de yon bouk fidbak transkripsyon/tradiksyon ki kontwole pa yon fanmi activateur sirkadyèn ki gen ladan CLOCK, BMAL1, ak repressè tankou CRY1 ak CRY2. Objektif etid la se te egzamine tou de mekanis molekilè ak enplikasyon emopoyetik ekspresyon sirkadyèn eritropoyetin. Sourit mutan ki gen efase omozigot nan nwayo sirkadyèn revèy jèn kriptokrom 1 ak 2 (Cry-null) yo te itilize pou elicide règleman eritropoyetin sirkadyèn. Sourit kontwòl kalite sovaj te montre yon diferans enpòtan nanrenekspresyon mRNA eritropoyetin ant fwa sirkadyèn 06 ak 18. Nan paralèl, yon kantite siyifikativman pi wo nan selil ki pwodui eritropoyetin nanren(byRNAscope ) ak nivo siyifikativman pi wo nan sikile erythropoietin pwoteyin (pa ELISA) yo te detekte sirkadyèn tan 18. Chanjman sa yo te aboli nan sourit Cry-null epi yo te endepandan de tansyon oksijèn, saturation oksijèn, oswa ekspresyon de ipoksi-induzibl faktè 2alpha, ki endike ekspresyon eritropoyetin sirkadyèn sa a se transkripsyon reglemante pa CRY1 ak CRY2. Repòtè tès jèn yo te montre ke eterodimè CLOCK/BMAL1 aktive yon eleman E-bwat nan pwomotè eritropoyetin 5' la. Ibridizasyon RNAscope in situ konfime prezans Bmal1 nan selil ki pwodui eritropoyetin.ren. Nan sourit Cry-null, yo te jwenn yon kantite retikulosit siyifikativman redwi pandan nimewo eritrosit ak ematokrit yo pa t chanje. Kidonk, sirkadyèn eritropoyetin règleman nan murin adilt normoxicrense transkripsyon kontwole pa mèt sirkadyèn activatorsCLOCK/BMAL1, ak repressors CRY1/CRY2. Konklizyon sa a ka gen enplikasyon poufizyoloji renak maladi, dyagnostik laboratwa, ak terapi anemi.

MO KLE:kronobiyoloji; ritm sirkadyèn; revèy; kriptokrom; eritropyetin; ematopoyez; faktè ipoksi-induzibl

Deklarasyon tradiksyon Revèy molekilè nan prèske tout kalite selil kondwi transkripsyon jèn an kolaborasyon ak faktè espesifik tisi yo. Jiskaprezan, sirkadyèn mekanis osilatif nan larenpa te lye ak byoloji nan eritropoyetin (Epo). Isit la, li te elisid ke ekspresyon sirkadyèn Epo reglemante pa pwoteyin revèy mèt (kriptokrom 1 ak 2, Clock, ak Bmal1). Kòm EPO aji diferan nan rezo konplèks regilasyon eritropoyez la, pi bon itilizasyon recombinant Epo imen nan pasyan ki genrenensifizans ka gen ladan aplikasyon li jis anvan maksimòm sirkadyèn fizyolojik li alantou minwi.

Ritm sirkadyèn nan nefroloji yo lajman enkonu, men trè enpòtan paske dezòd yo pa travay orè, chwa fòm, ak senesans asosye ak yon risk ogmante nan divès maladi, ki gen ladan maladi kadyovaskilè.^1–4Modèl bèt nan revèy sirkadyèn detounen bay premye prèv ki montre enpak negatif nan disregulasyon sirkadyèn sou sistèm ematopoyetik la (egzanp, pa ogmante kantite eritrosit ki gen laj).^5,6

Konsènan eritropoyez, pa sèlman efè selilè, men tou ritmitè regilatè prensipal li yo, eritropoyetin (Epo), se yon enterè patikilye paske atlèt yo te repete akize de dopaj san ak recombinant imen Epo (ki moun) akòz diferans ki depann de tan nan jounen an nan sikile konsantrasyon Epo ak paramèt ematolojik.7,8 Varyasyon dijounen nan nivo Epo serik imen (S-Epo) yo te premye dekri an 1981 nan pasyan ki gen maladi respiratwa kwonik nan poumon ak travayè chabon,⁹epi answit nan matyè ki an sante.^10,11Jiska prezan, plizyè rapò endike nivo S-Epo ki wo nan mitan lannwit lan (8 PM jiska 4 AM) ak nivo S-Epo ki ba nan maten bonè (4 AM jiska 8 AM). Faz ak anplitid osilasyon S-Epo, si yo prezan, yo varye ant moun.^9,10,12,13An mwayèn, nivo S-Epo yo chanje apeprè 1.5-pliye parapò ak minimòm yo.^14–22Yo te montre ritm dijounen sa a pa afekte pa aje,20 fòmasyon,16, oswa ekspoze altitid.17 Kontrèman, osilasyon S-Epo lajounen an aboli nan pasyan ki gen maladi pulmonè obstriktif kwonik konplike pa ipoksemi lajounen, nan myeloma ak ensifizans ren. , ak nan myelodysplasia.^15,21,23

An 2009, nou te dekri ekspresyon sirkadyèn Epo mRNA nan ren murin nan yon analiz gwo echèl pwomotè jèn ki kontwole revèy men nou pa t kapab idantifye ni yon eleman jenetik distenk nan jèn EPO a oswa yon faktè transactivating ki responsab osilasyon sirkadyèn. 24 Plis dènyèman, yon modèl rat nan chòk emorajik sijere, dapre modèl ekspresyon paralèl, ke jèn yo revèy (Bmal1 ak Per2) te enplike nan règleman an nan sekresyon EPO pandan ipoksi/iskemi.²⁵

Jenerasyon ritm sirkadyèn se selil otonòm epi li depann sou yon bouk fidbak transkripsyon-tradiksyon ki kontwole pa yon fanmi faktè transkripsyon revèy sirkadyèn, tankou CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1, ak CRY2.26 CLOCK/BMAL1 heterodimer aktive transkripsyon an. nan revèy sirkadyèn jèn PER1/2 ak CRY1/2 atravè lyezon nan eleman bwat E nan pwomotè yo. Pwoteyin PER ak CRY, sepandan, bay fidbak negatif lè yo anpeche aktivite CLOCK/BMAL1, kidonk diminye pwòp ekspresyon yo. Rezilta yo nèt mennen nan modèl osilasyon ekspresyon jèn sirkadyèn yo ak chanjman ritmik nan fizyoloji selilè ak ògàn.²⁷

Pou konprann enplikasyon revèy byolojik la, yo etidye plizyè kalite sourit mutan ki gen faktè transkripsyon revèy sèl-nwayo ki deranje oswa ki elimine. sourit (Cry-null), ki manke kapasite pou eksprime ritm sirkadyèn andojèn.^26,30Konbine done in vivo ak in vitro demontre ke Cry1/2 kontwole ekspresyon sirkadyèn Epo atravè CLOCK/BMAL1-transkripsyon pwovoke nan ren normoxic la.

METÒD

Eksperyans sou bèt

Omozygous Cry1–/– /Cry2–/– bèt (Cry-null; gason ak fi; C57BL/6J ki baze sou)31 ak kontwòl sovaj (WT) yo te elve (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) epi yo te elve pou 5. jiska 7 mwa. Sourit WT yo te soti nan elvaj koloni Cry-null la.

Genotip Cry-null la te konfime pa reyaksyon chèn polymerase (Tablo Siplemantè S1). Pou antrennman, sourit yo te loje an gwoup epi yo te gen manje ak dlo ad libitum nan yon 12-èdtan:12-èdtan sik limyè/fè nwa pandan 14 jou. Nan 2 jou apre yo fin lage nan fènwa konstan, bèt yo te sakrifye nan tan sirkadyèn (CT) 06 oswa 18 (n ¼ 13-15 pou chak gwoup ak pwen tan). Tisi (fwa ak ren) yo te jwenn byen vit epi yo te jele nan nitwojèn likid. Yo te analize yon sougwoup gason ak fi bèt WT ak Cry-null an detay pou pwa kò ak emogram diferans.

Pou analiz gaz san, bèt yo te anestezi (fentanyl, {{0}}.075 mg/kg, midazolam, 1.5 mg/kg, ak medetomidine, 0.75 mg/kg), tracheotomize, entube, ak vantile (tidal volim, 9 ml/kg; to respiratwa, 160 min- 1; presyon pozitif nan fen ekspirasyon, 2 cm H2O), jan sa dekri.32 Yo te entwodwi yon katetè an polietilèn nan operasyon nan atè karotid gòch la. Apre 5 minit nan estabilizasyon, yo te sispann eksperyans nan atravè eksanguinasyon rapid atravè katetè karotid la, yo te analize gaz san yo (ABL-800; Radyomètr; tanperati kontwole), epi yo te retire ren pou analiz apre hoc.

Tout pwosedi yo te otorize pa Local Animal CareCommittee (T0307/08; G0100/17 ak yon adisyon soti nan janvye 2021) epi yo te fè an akò ak direktiv yo ak règleman nan lwa pwoteksyon bèt Alman an.

Preparasyon RNA ak analiz quantitative polymerase chèn reyaksyon

Yo te extrait RNA total jan sa dekri a.33 Yo te transkri yon total de 1000 ng total de RNA ak transkriptaz ranvèse SuperScript III (Thermo Fisher; No. 18080085) ak hexamers o aza (Thermo Fisher; No. SO142), dapre enstriksyon manifakti a. Reyaksyon chèn polymerase Quantitative yo te kouri sou yon cycler StepOnePlus (Teknoloji lavi) ak primè entron-spanning oswa tès TaqMan (Tablo Siplemantè S2). Kantifikasyon absoli mRNA te reyalize pa konparezon ak yon koub estanda soti nan dilusyon seri nan modèl reyaksyon chèn polymerase.

Deteksyon ekspresyon mRNA Epo nan teknik RNAscope nan ren

Yo te fè tès RNAscope dapre pwotokòl manifakti a (ACD; nòt teknik 320536). Yo te tache 10- mm kryoseksyon transverse nan ren ak yon sond C1 kont DapB (kontwòl negatif; ACD; No. 310043) oswa Epo (ACD; No. 315501). Etap ibridasyon lè l sèvi avèk Amp 4-6 ak deteksyon siyal wouj yo te omisyon. De endepandan, chèchè avèg konte Epo selil pozitif nan 200 agrandisman orijinal, sou 3 a 8 cryosectionsper bèt nan yon sistèm D 'Axioplan 2 (Zeiss).

Reprezantatif Epo quantification zidòl ak tach fluorescent doub yo te fè lè l sèvi avèk RNAscope Multiplex FluorescentDetection Reagent V2 Twous (ACD; No. 323110), dapre pwotokòl manifakti a. 1.5-Mitan seksyon transverse nan ren yo te tache ak yon sond C1 kont Bmal1 (ACD; No.438741) ak yon sond C2 kont Epo (ACD; No. 315501-C2). Opaleye 520 (Akoya BioSciences; No FP1487001KT) te itilize ak sond theC1, ak koloran opal 650 (Akoya BioSciences; No FP1496001KT) te itilize ak sond C2 la. Nan - 400 agrandisman orijinal, selil pozitif Epo yo te imajine pou kolokalizasyon Bmal1 nan yon sistèm Eclipse Ti2imaging (Nikon). 40,6-diamidino-2-phenylindole te itilize kòm kontre.

Konsantrasyon serik EPO

Echantiyon san yo te kite kayo pou 1 èdtan nan tanperati chanm anvan yo santrifuje pou 20 minit nan 2000 - g. Yo te retire serom epi imedyatman jele nan -80 C jiskaske yo te fè tès imunosorban ki lye ak anzim pou Epo (Quantikine; R&D Systems; No. MEP006) ak echantiyon ki pa dilye. Yo te li ak yon iMARK Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad) nan 450 nm, ak koreksyon longèdonn nan 570 nm ak yon 4-paramèt anfòm koub estanda, jan sa dekri deja.³³

konte selil san

Synlab te mezire kantite selil total ak diferansye ki soti nan san ki gen antikoagule EDTA. veterinè Bèlen ak yon kontwa selil otomatik ADVIA2120i(Siemens) pou san murin.

Repòtè tès jèn

Selil 293 nan ren anbriyon imen (DSMZ; No. ACC305; nimewo pasaj 3-10; mycoplasma negatif) yo te grandi nan mwayen Eagle's Dulbecco/Ham F12 (Biochrom; No. FG4815) ki te konplete ak 10 pousan serom fetis bovine (Merck; No. F7524). Transfeksyon selilè yo te fèt nan 12-plak pi ki gen 1.67 - 105 selil/pi. Chak pi yo te transfekte ak 333 ng ADN plasmid (1 nan 10 ladan yo te vaniy konstriksyon) ak 1 ml Fugene 6 reyaktif transfeksyon (Promega; No. E2691) jan sa dekri.34 Tout konstwi yo itilize yo ki nan lis nan Tablo Siplemantè S3. Selil yo te lysed 48 èdtan apre transfeksyon ak pasif Lysis tanpon (Promega; No. E1941). Aktivite Luciferase yo te detèmine ak twous Beetle-Juice ak Renilla-Juice (tou de pjk GmbH; No 102511/102531, respektivman), nan yon luminomèt Lumat LB9501. Chak eksperyans te fèt nan kopi teknik, ak valè mwayèn yo te itilize pou kalkil.

Analiz estatistik

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.5-pliye ranje entèkartil la) nan 4 sou 6 jèn sirkadyèn ki eksprime. Done yo te analize lè l sèvi avèk IBM SPSS Statistics 27 epi yo prezante kòm pwen endividyèl ak medyàn oswa kòm ba ak mwayèn ak SD. Mann-Whitney U tès oswa Kruskal-Wallis ak Bonferroni kòm tès post hoc te fè.

REZILTA

Ablation nan ekspresyon sirkadyèn Epo nan sourit Cry-null

Pou elicide mekanis molekilè règleman sirkadyèn Epo a, nou analize mRNA Epo ak ekspresyon pwoteyin nan sourit mutan WT ak Cry-null. Nan ren WT, jèn revèy kanonik yo te montre yon ekspresyon depandan tan nan jounen an, tandiske sa a te aboli nan sourit Cry-null, jan yo espere (Figi Siplemantè S1). Nou te deja rapòte osilasyon sirkadyèn ekspresyon Epo mRNA sou 24 èdtan pou ren murin WT adilt yo.24 Lè nou konsantre kounye a sou valè minimòm ak maksimòm, nou te obsève yon diferans enpòtan, w9-pliye ant CT06 (peryòd dòmi sourit; minimòm espere. ) ak CT18 (faz aktivite; maksimòm espere; Figi 1a). Nan ren yo nan sourit Cry-null, sepandan, pa gen okenn diferans enpòtan nan ren Epo mRNA ekspresyon yo te detekte. Miyò, nan sourit Cry-null, kantite absoli nivo transkripsyon Epo ren yo nan tou de fwa yo te ant nivo medyàn WT Epo mRNA nan CT06 ak CT18 (Figi 1a). EPO mRNA nan fwa korespondan yo te anba limit deteksyon an (done yo pa montre).

Chanjman diurn nan konsantrasyon serom Epo

Pou estime tradiksyon ekspresyon sirkadyèn Epo mRNA nan sikilasyon pwoteyin Epo, nou analize echantiyon serom pa tès iminosorban ki lye ak anzim. Yo te pran echantiyon san anvan echantiyon ògàn yo. Serom Epo ogmante w2. 3- pliye ant CT06 ak CT18 nan sourit WT, men diferans sa a te aboli nan sourit Cry-null (Figi 1b). Miyò, konsantrasyon S-Epo medyàn yo mwayèn sou tan (CT06 ak CT18) te menm jan an nan sourit WT ak Cry-null (22 mU/ml [ranje, 3-59 mU/ml] kont 21 mU/ml [ranje, 7). -50 mU/ml]).

Ekspresyon sirkadyen Epo an relasyon ak paramèt gaz san atè ak oksimetri batman kè

Pou mennen ankèt sou si chanjman potansyèl dijounen nan nivo oksijèn san ak tisi yo ta ka lakòz osilasyon sirkadyèn nan ekspresyon Epo, yo te jwenn espesimèn san atè epi yo te fè analiz gaz nan san nan sourit Cry-null ak WT ki anestezi, tracheotomize, ak ayere mekanikman nan CT06 oswa CT18, ki koresponn ak pi ba ak pi wo nivo sirkadyèn Epo mRNA, respektivman (Figi 1a). Nou pa detekte ni diferans enpòtan nan pH atè a, presyon pasyèl CO2, oswa presyon pasyèl O2 ni nan depase baz estanda oswa konsantrasyon laktat (Figi 2a-e) ant CT06 ak CT18 oswa WT ak Cry-null sourit. Nivo saturation oksijèn, mezire pa oksimetri batman kè, tou pa t montre okenn diferans (Figi 2f). Ekspresyon jèn nan EPO mèt regilatè ipoksi-induzibl faktè a (HIF) 2a pa t 'diferan ant CT06 ak CT18, swa nan sourit WT oswa Cry-null (Figi 3). Se konsa, nan kondisyon normoxic, sirkadyèn Epo règleman pa koze pa chanjman nan tansyon oksijèn.

Sirkadyen switch on-off nan ekspresyon Epo nan selil ren ki pwodui Epo

Pou etidye si ekspresyon sirkadyèn Epo mRNA medyatè pa chanje sou plis selil ren ki pwodui Epo (REPCs) oswa sèlman lè w ogmante ekspresyon Epo pou chak selil, yo te itilize ibridizasyon RNAscope in situ sou mitan seksyon transverse ren (egzanp nan Figi Siplemantè S2). Nan sourit WT, kantite REPC yo te ogmante anpil ant CT06 (medyàn, 5; ranje, 0-25) ak CT18 (medyan, 22; ranje, 5-82; 4.{{ 11}} pliye; P ¼ 0.010). Kontrèman, ren Cry-null te montre menm kantite REPC yo nan CT06 (medyàn, 18; ranje, 2-33) ak CT18 (medyan, 15; ranje, 4-87; pa enpòtan; Figi 1c). Nou konsidere ke sourit Cry-null montre restriksyon kwasans akòz pwoblèm siyal nan faktè kwasans ensilin 1 (IGF1), ki lakòz yon diferans kontinyèlman ogmante nan pwa kò ak gwosè ògàn ant Cry-null ak sourit WT.30 Kòm nou te itilize. bèt relativman jèn, pwa absoli nan ren sourit Cry-null te sèlman yon ti kras pi ba pase nan sourit WT (-12 pousan nan sourit Cry-null), men rapò pwa relatif ren-a-kò a pa t diferan (figi siplemantè S3) . Kidonk, ogmantasyon sirkadyèn nan ekspresyon Epo mRNA sanble ap reglemante pa yon switch REPC adisyonèl.

Aktivasyon minim EPO pwomotè pa CLOCK/BMAL1

Pou idantifye sekans regilasyon ki responsab ekspresyon sirkadyèn Epo (Figi 4a), yo te fè tès jèn repòtè luciferase nan selil 293 nan ren anbriyon imen an. Liy selil 293 nan ren anbriyon imen an te chwazi pa pou orijin ren li men pou mank li nan yon revèy sirkadyèn andojèn. Kidonk, efè stimulatory CLOCK/BMAL1 ta ka teste nan yon background ki ba, nonoscillating CLOCK/BMAL1. Overexpression CLOCK / BMAL1 siyifikativman ankouraje aktivite a nan pwomotè minim EPO imen an (Figi 4b, I vs II). Si motif E-bwat la (-36 a -31 bp parapò ak sit la kòmanse transcription) mitasyon,35 efè sa a se bouche (Figi 4b, III).

Pou etidye si règleman sirkadyèn yo te obsève te depann de kalite selil, nou tcheke plizyè liy selil ki eksprime EPO pou aktivite revèy andojèn nan siveyans osilasyon pwomotè Bmal1 nan yon repòtè luciferase. Moun ki gen yon ritm andojèn enkli selil HEP3B ki sòti nan epatom imen, selil KELLY ki sòti nan neuroblastom imen, ak selil ren sourit PDGFRbþ (ansyen EPO eksprime liy selil sourit FAIK1-10).36,37 Pami 3 liy selil yo, sèlman. Selil KELLY yo te ekspoze osilasyon lisiferaz pwomotè EPO (figi siplemantè S4A). Malgre ke selil PDGFRbþ yo te montre yon ritm sirkadyèn fò nan aktivite pwomotè Bmal1, nou pa t 'detekte osilasyon pwomotè EPO, ki sijere yon anplitid pi ba nan konstriksyon repòtè pwomotè EPO-kondwi (figi siplemantè S4B).

Kolokalizasyon Bmal1 ak Epo nan ren Cry-null kont sourit WT

Pou plis elicide (i) règleman sirkadyèn nan pwodiksyon Epo ren pa rekrite selil ren Epo-pwodwi ak (ii) colocalization nan ekspresyon Bmal1 ak Epo, nou fè RNAscope ibridizasyon nan situ. Epo ak Bmal1 colocalized, ak mikwoskospi sou agrandisman ki ba reprezante diferans ki genyen nan rekritman nan REPCs (Figi 5), jan yo mezire nan Figi 1c.

Konklizyon ematolojik nan Cry1/Cry2 Defisi Pou evalye (i) efè ematopoyetik mank de ekspresyon sirkadyèn Epo ak (ii) posib lòt anomali ematolojik nan sourit san yon revèy fonksyonèl, konte selil san yo te analize. Diferans tan nan jounen an nan ekspresyon mRNA Epo ak konsantrasyon S-Epo pa te reflete pa diferans enpòtan nan konte retikulosit periferik nan CT06 kont CT18 nan sourit WT. Kantite retikulosit, sepandan, te siyifikativman pi ba nan tou de CT06 ak CT18 nan bèt Cry-null konpare ak sourit WT (Figi 6a). Pa te gen okenn diferans enpòtan nan nimewo eritrosit yo oswa valè ematokrit nan WT kont sourit Cry-null. Tou de paramèt, sepandan, pa t varye ant CT06 ak CT18 nan tou de tansyon (Figi 6b ak c) epi yo pa t koresponn ak nimewo ki pi ba retikulosit periferik nan sourit Cry-null (Figi 6a). Pou teste si defisyans nitrisyonèl (egzanp, fè ak folat) akòz pwoblèm siyal IGF1 yo enplike nan diferans ki genyen nan retikulosit redwi men nimewo nòmal eritrosit nan sourit Cry-null, gwosè ak fòm globil wouj yo te analize men yo pa t montre okenn diferans enpòtan. ant Cry-null ak sourit WT (figi siplemantè S5).

Miyò, konte plakèt medyàn nan sourit Cry-null yo te gen tandans yo dwe pi wo pase nan sourit WT, men nimewo plakèt pa t 'siyifikativman diferan ant CT06 ak CT18 nan tou de tansyon (Figi 6d). Kontrèman, konte globil blan (WBC) te diferan anpil ant CT06 ak CT18 nan WT men se pa nan sourit Cry-null. Nimewo WBC medyàn nan sourit Cry-null te menm jan an wo, tankou nan sourit WT nan CT06 (Figi 6e).

DISKISYON

Isit la, nou demontre ke ekspresyon sirkadyèn Epo reglemante nan nivo transkripsyon an. Analiz de Epo mRNA ak S-Epo konsantrasyon nan aritmik Cry1 ak Cry2 ensufizant sourit redireksyon rechèch nou an pou "revèy Epo a" nan faktè transcription sib en yo CLOCK ak BMAL1, ki fè yo reprime pa CRY1 ak CRY2.26 Ablation nan Cry1 / Cry2 mennen. nan pèt represyon ritmik CLOCK/BMAL1, sa ki lakòz nivo transkripsyon Epo konstan ki te nan ant nivo medyàn yo nan CT06 ak CT18 nan sourit WT (Figi 1a). Ibridizasyon in situ pa RNAscope endike ke osilasyon sirkadyèn nan reyalize pa chanje sou ekspresyon Epo mRNA nan selil entèstisyèl (Figi 1c), ak ibridizasyon in situ pa RNAscope tou revele ekspresyon an nan Bmal1 nan REPCs (Figi 5).

Pi enpòtan, nivo S-Epo siyifikativman pi wo nan CT18 konfime ke sirkadyèn, règleman Epo transkripsyon an tradwi nan osilasyon sirkadyèn nan sikile pwoteyin Epo nan kondisyon normoxic (Figi 1b). Vrè maksimòm nivo S-Epo espere yon ti kras pita pase CT18 paske sentèz de novo nan pwoteyin EPO mande w80 a 120 minit, 38 epi yo te chwazi tan sirkadyèn sou baz nivo maksimòm Epo mRNA. 24 Nou te jwenn ke règleman sirkadyèn Epo gen anpil chans medyatè pa deklanchman transkripsyon yon motif E-bwat nan pwomotè 5' EPO pa CLOCK/BMAL1 (Figi 4 ak Figi Siplemantè S4), ki konsistan avèk korelasyon pozitif ki dekri ant pwoteyin BMAL1 ak Nivo S-Epo nan yon modèl rat nan emoraji egi.²⁵

Gen prèv pou yon règleman bidireksyon ant CLOCK/BMAL1 ak chemen HIF yo atravè entèraksyon dirèk pwoteyin-pwoteyin.^39,40Regilasyon HIF2a, pi gwo aktivatè pwomotè EPO a,41,42 te lakòz yon chanjman nan nivo ekspresyon jèn revèy nan selil epatoma imen yo.43 Anplis de sa, BMAL1 dimerize ak pwoteyin HIF1a ak HIF2a,^44,45,ak kontwòl revèy sirkadyèn nan aktivite HIF yo reglemante nan yon fason espesifik tisi yo.39 Nan sourit, ekspoze a ipoksi egi (4 èdtan nan 6 pousan kont 21 pousan O2), EPO mRNA te ogmante twòp men li pa t montre diferans sirkadyèn ankò. .46 Kidonk, kondisyon normoksik yo pwobableman pi apwopriye pou diseksyon mekanis molekilè règleman sirkadyèn Epo a. Nan rat yo, sepandan, chanjman nan san ak nivo oksijèn nan tisi yo te rapòte.39,47 Nan rat, gen yon seri ki ba nan chanjman ritm chak jou nan oksijenasyon ren nan zD3 pousan, ak yon pik nan fè nwa a (¼ aktivite wonjè) .47 Diferans sa yo pa t 'kapab detekte nan eksperyans nou yo, kote sèlman sourit anestezi, tracheotomize, ak ayere mekanikman te kapab etidye pou rezon regilasyon bèt. Sepandan, analiz de pH atè, presyon pasyèl nan CO2, ak presyon pasyèl nan O2, depase baz estanda oswa laktat kòm byen ke saturation oksijèn pa t 'indike gwo diferans ki genyen ant sourit WT ak Cry-null nan tou de CTs (Figi 2). Anplis de sa, nivo transkripsyon Hif2a nan ren yo te sanble tou nan tout kondisyon (Figi 3). Kidonk, nan kondisyon nòrmoksik, règleman sirkadyèn Epo a sanble endepandan de chanjman nan tansyon oksijèn lajounen. Sepandan, kesyon an nan ki nivo gwo altitid oswa ipoksi (ba pO2) enfliyanse osilasyon sirkadyèn nan pwodiksyon Epo merite plis atansyon. Nivo S-Epo imen yo jeneralman pi wo nan altitid wo, tandiske faz ak anplitid yo pa chanje, 17,22 ak nan volontè ki an sante ekspoze a ipoksi normobaric, konsantrasyon S-Epo montre yon osilasyon pwononse.⁴⁸

Règleman Circadian Epo se pwobableman pi enpòtan pou nefroloji klinik ak ematoloji, men tou konsènan dyagnostik laboratwa, tankou tès san pou dopaj ak ajan erythropoiesis-estimile. Pou evalye konsantrasyon Epo sikile nan analiz dopan, yo dwe konsidere lè nan jounen an (lè ekstèn) nan koleksyon san an ak kronotip moun nan (tan entèn).49,50

Nan erythropoiesis, inite pete-fòme-eritroyid se premye selil espesifik linaj yo, ki te swiv pa inite ki fòme koloni-eritroyid, ki montre ekspresyon abondan nan reseptè Epo. Apre 2 jou nan kilti ak Epo, inite murin ki fòme koloni-eritroyid pwodui koloni eritroblast. Yon fwa yo rive nan etap eritroblast ortokromatik yo apre 7 jou, selil yo ekstrè nwayo yo vin retikulosit ki manke ekspresyon reseptè Epo.51 Lè nou konsidere tan li pran pou inite ki fòme koloni yo - eritroyid yo vin matirite nan retikulosit oswa menm eritrosit konplètman matirite, li. se pwobableman pa etone ke pa gen okenn diferans obsève ant CT06 ak CT18 nan sourit WT (Figi 6a-c). Miyò, nimewo jeneral retikulosit yo te siyifikativman pi wo nan WT pase nan sourit Cry-null (Figi 6a), ki sijere ke diferansyasyon nan reticulocytes gen pwoblèm nan sourit Cry-null. Done anvan yo endike ke selil premye erythroid montre tou yon modèl sirkadyèn nan sentèz ADN. Administrasyon in vivo de rhEpo améliore ritm sirkadyèn nan nimewo koloni erythroid.52 Pi ba nimewo reticulocyte, malgre relativman wo konsantrasyon jeneral S-Epo nan sourit yo Cry-null, te kapab lakòz nan aboli sentèz sirkadyèn ADN sou nivo erythroid progenitors. Yo te obsève yon konstelasyon S-Epo segondè ak eritropoyez redui nan sourit ki gen ablasyon jenetik pwodiksyon melatonin pineal (sourit C3H/HeN ki manke yon N-asetil transferaz ki limite vitès),53 diskite pou aktivite sirkadyèn intrinsèques sou selil progenitor erythroid. nivo.

Miyò, sourit Cry-null montre yon rediksyon apeprè 80 pousan nan nivo IGF1, ki mennen nan rediksyon siyal IGF1 ak yon rediksyon 30 pousan nan pwa kò ak gwosè ògàn konpare ak WT, yon efè ki vin pi grav pandan tout lavi yo.30 Malgre ke bèt yo itilize nan nou an. eksperyans yo te relativman jèn (laj medyàn,^21–29 semèn), yo montre yon efè modere sou kò total ak pwa ren absoli nan sourit Cry-null, men rapò pwa ren-a-kò a te nòmal (figi siplemantè S3). Dènye reyalite a ka enpòtan pou kapasite sentèz pwoteyin Epo (Figi 1b).

Sepandan, analiz de gwosè globil wouj nan san oswa fòm (MCV, MCH, ak MCHC; Siplemantè Figi S5) pa t sijere defisyans nitrisyonèl (egzanp, fè ak folat) kòm yon eksplikasyon pou diferans ki genyen ant retikulosit redwi ak konte eritrosit nòmal nan Cry-. sourit nil (Figi 6a ak b). Miyò, Epo ak IGF1 siyal senkronize pwopagasyon selilè ak diferansyasyon pandan eritropoyez atravè entèraksyon ak GATA-1/zanmi GATA-1 konplèks transkripsyon an.54 Nan pwosesis sa a, Epo aktive chemen an AKT selilè epi kidonk ogmante. afinite GATA-1, pi gwo regilatè transkripsyon eritropoyez la, ak zanmi kofaktè li GATA-1. Mekanis sa a anpeche, sepandan, si siyal IGF1 aboli.54 Kidonk, yon efè pozitif nan Epo relativman pi wo nan sourit Cry-null sou diferansyasyon globil wouj ka depase aktivite a IGF1 redwi nan sourit relativman jèn Cry-null etidye isit la.

Enplikasyon jeneral la nan aritmisite sirkadyèn konplè sou ematopoyèz se plis elisid pa analiz nou an sou nimewo plakèt ak WBC. Rezilta anvan sourit ki eksprime yon fòm dominan-negatif Clock (ClockD19/D19) te endike ke dezòd ekspresyon tronbopoyetin (regilatè prensipal megakaryopoiesis) ak reseptè Mpl li yo rezilta nan ogmante kantite megakaryosit mwèl matirite ak nimewo plakèt sikile. 55 Siyifikatif osilasyon sirkadyèn ki dekri nimewo plakèt yo ak nan pik nan tan zeitgeber (ZT) 20 nan sourit WT ak pi wo nimewo plakèt nan ZT08 nan sourit ClockD19/D19,55 sa ki lakòz yon mank de osilasyon sirkadyèn nan nimewo plakèt, pa t 'kapab. dwe konfime nan modèl sourit nou an (Figi 6d). Yon lòt konklizyon enpòtan se pèt diferans tan nan jounen an nan sikile WBC nan sourit Cry-null kontrèman ak sourit WT (Figi 6e), ki konsistan avèk aktivite a rapòte nan CLOCK / BMAL1 sou pwodiksyon WBC ki gen matirite.^56,57

Pou entèpretasyon done nou yo, yo dwe konsidere diferans ki genyen nan aktivite lajounen-lannwit nan sourit ak imen yo: Lè CT06 nan imen an apeprè koresponn ak minwi (faz dòmi), tandiske CT18 apeprè koresponn ak mitan jounen an (faz aktivite). Opoze a se vre pou sourit nocturne, men tou de òganis yo montre menm modèl ekspresyon sirkadyèn Epo a (ba nan CT/ZT06, segondè nan CT/ZT18). Sa a endike ke mekanis adisyonèl (egzanp, faktè metabolik) ta ka modifye ritm yo nan ekspresyon Epo nan tou de òganis yo. Sinkronizasyon ant nivo pik Epo ak ekspresyon reseptè Epo nan premye pitit pitit eritroyid yo (inite ki fòme pete - eritroyid e menm inite ki fòme koloni - selil eritroyid)⁵² Sigjere ke pasyan k ap resevwa tretman rhEpo (egzanp, nan anemi ren fen oswa maladi ematolojik) ta benefisye de imite fizyoloji sirkadyèn nòmal la lè yo aplike ipo pandan lannwit lan. Maladi ematopoyetik pa te rapòte nan moun ki gen CRY1 (Online Mendelian Eritaj nan Man * 601933) oswa CRY2 (Online Mendelian Eritaj nan Man * 603732) mitasyon pèt fonksyon ankò. Rapò klinik asosye varyant CRY1 prensipalman ak twoub defisi atansyon/ipèaktivite, souvan akonpaye pa lensomni, enkyetid, depresyon, oswa twoub faz dòmi reta.^58,59Sa a merite plis envestigasyon paske maladi sa yo ka vin pi mal ak anemi oswa maladi ematopoyetik.

An konklizyon, etid sa a bay premye prèv ki montre ekspresyon sirkadyèn Epo nan ren murin adilt normoxic reglemante nan nivo transcription pa deklanchman CLOCK/BMAL1-medyatè yon eleman E-bwat nan pwomotè 5'EPO a. Kòm EPO aji diferan nan rezo a regilasyon konplèks nan eritropoyez, itilizasyon optimal nan repo nan pasyan ki gen ensifizans ren ka gen ladan aplikasyon li jis anvan maksimòm sirkadyèn fizyolojik li nan mitan lannwit lan.