Efè Inibisyon Curcumin Derivation J147 Sou Melanogenesis ak Transpò Melanosome Pa Fasilite ERK-Medyate Degradasyon MITF Pati 1

Yo rekonèt itilizasyon ki ka geri nan kurkumin ak chimik modifye kurkumin (CMC) pou siprime melanogenesis ak aktivite tirozinaz. J147 se yon vèsyon modifye nan kurkumin ak byodisponibilite siperyè ak estabilite. Sepandan, pa gen okenn rapò sou efè J147 sou pigmantasyon nan vitro ak nan vivo. Nan etid nou yo, nou te envestige efè ipopigmantè tretman J147 sou melanosit epi eksplore mekanis ki kache a. Etid yo prezan sijere ke J147 siprime tou de melanogenesis fondamantal ak -MSH-induit, osi byen ke diminye ekstansyon melanosit dendrite ak transpò melanozòm. J147 te jwe wòl sa yo sitou lè li aktive wout kinaz pwoteyin kinaz (ERK) ki kontwole siyal ekstraselilè. Yon fwa aktive, li te lakòz degradasyon MITF ak plis desann-reglemante ekspresyon de tirozinaz, TRP-1, TRP-2, Myosin Va, Rab27a, ak Cdc42, finalman anpeche sentèz melanin ak transpò melanozòm. Anplis de sa, efè ipopigmantè J147 yo te demontre nan vivo nan yon modèl zebrafish ak UVB-induit hyperpigmentation modèl nan kochon Gine mawon. Konklizyon nou yo tou sijere ke J147 pa montre okenn sitotoksisite nan vitro ak nan vivo. Ansanm, done sa yo konfime ke J147 ka pwouve byen itil kòm yon ajan pi an sekirite natirèl blanchiman po.

Cistanchetou gen fonksyon nanankouraje pwodiksyon kolagen an, ki ka ogmante elastisite ak ekla po a epi ede repare selil po ki domaje yo. CistanchePhenylethanol Glycosidesgen yon siyifikatif desann-regleman efè soutirozinazaktivite, ak efè a sou tirozinaz montre yo dwe konpetitif ak revèsib anpèchman, ki ka bay yon baz syantifik pou devlope ak itilize nan.engredyan blanchinan Cistanche. Se poutèt sa, cistanche gen yon wòl kle nan blanchiman po. Li kapabanpeche pwodiksyon melanindiminye dekolorasyon ak mat; ak ankouraje pwodiksyon kolagen anamelyore elastisite po aak klere. Akòz rekonesans la toupatou nan efè sa yo nan cistanche, anpilblanchiman popwodwi yo te kòmanse pénétrer engredyan èrbal tankou Cistanche satisfè demann konsomatè, konsa ogmante valè komèsyal Cistanche nan pwodwi blanchiman po. An rezime, wòl cistanche nan blanchiman po enpòtan anpil. Efè antioksidan li yo ak efè kolagen an pwodwi ka diminye dekolorasyon ak mat, amelyore elastisite po ak ekla, epi konsa reyalize yon efè blanchiman. Epitou, aplikasyon an lajè nan Cistanche nan po blanchi pwodwi demontre ke wòl li nan valè komèsyal pa ka souzèstime.

Mo kle: J147, efè ipopigmantè, transpò melanozòm, chemen ERK, degradasyon MITF

Klike sou Cistanche Tubulosa pou blanchiman

Pou plis enfòmasyon: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

ENTWODIKSYON

Pigmantasyon po depann sou tou de sentèz melanin ak distribisyon nan kouch epidèm la. Melanin pwodui sitou alantou nwayo melanosit ak estoke nan melanosom (Tian et al., 2021). Apre matirite, melanozòm te imigre ansanm mikrotubul ak filaman aktin nan pwent dendrit selil yo epi finalman nan keratinosit vwazen yo pou fini pwosesis distribisyon an (Beaumont et al., 2011; Ohbayashi and Fukuda, 2012). Anba estati fizyolojik nòmal, melanin pwoteje po moun kont domaj iltravyolèt (UV), pwodui chimik toksik, ak lòt faktè anviwònman (Slominski et al., 2004; Yousaf et al., 2020). Sepandan, twòp pwodiksyon ak akimilasyon pwovoke ipèpigmantasyon epi yo asosye ak maladi po tankou melanodèrma pòs-enflamatwa, melasma, ak lentigins solè, ki mennen nan yon chay sikososyal remakab (Pillaiyar et al., 2017). Pakonsekan, li nesesè yo devlope ajan blanchiman efikas ak san danje.

Nan dènye ane yo, biyoloji selil melanin te vin tounen yon domèn rechèch pi laj ak plizyè pwoteyin enpòtan ki kontribiye nan melanogenesis ak transpò melanosome yo te elisid, peye wout la pou idantifye inibitè sentèz melanin. Tirozinaz se sèlman nesesè pou melanogenesis ak anpèchman nan tirozinaz aksyon katalitik se metòd ki pi komen pou diminye pwodiksyon melanin (D'Mello et al., 2016). Plizyè inibitè tirozinaz li te ye, ki gen ladan arbutin ak asid kojik, te deja devlope kòm aditif kosmetik (Ding et al., 2020). KIF5b ak Rab27A-Melanophilin-Myosin Va konplèks kontribye nan transpò melanozòm deyò (Ohbayashi and Fukuda, 2012; Noguchi et al., 2014). Cdc42 kontwole elongasyon dendrit, ki esansyèl pou transfè melanozòm (Luo, 2000). Anpèchman nan pwoteyin ki anwo yo ta ka siyifikativman siprime transpò melanozòm, ki se yon mekanis enpòtan pou devlope ajan blanchiman po. Faktè transkripsyon ki asosye ak mikroftalmi (MITF) se yon faktè transcription mèt nan melanogenesis. Anplis, MITF tou kontwole transpò melanozòm pa pwovoke ekspresyon Rab27a ak Cdc42 (Noguchi et al., 2016). Plizyè chemen siyal yo patisipe nan pigmantasyon lè yo regle nivo ekspresyon MITF. Aktivasyon nan cAMP pwoteyin kinaz A (PKA) stimul pigmantèr atravè cAMP repons eleman obligatwa pwoteyin (CREB) depandan upregulation nan ekspresyon MITF (Rodríguez ak Setaluri, 2014). Kontrèman, aktivasyon kinaz pwoteyin ekstraselilè ki kontwole siyal (ERK) anpeche melanogenesis pa akselere degradasyon MITF (Lv et al., 2020a). Anpil ajan anti-melanogenic yo te devlope ki vize aktivite tirozinaz, transfè melanozòm, oswa chemen siyal ki gen rapò ak melanogenic. Sepandan, kèk inibitè te sibi etid nan vivo epi yo te montre bon rezilta (Pillaiyar et al., 2017).

Kurkumin se yon konpoze diarylheptanoid izole nan rizòm Curcuma longa (Zingiberaceae) epi li itilize kòm yon gou jòn oswa pigman nan manje (Zheng J. et al., 2018). Etid yo endike divès fonksyon fizyolojik li yo, ki gen ladan aktivite anti-enflamatwa, anti-oksidatif, anti-amiloid, ak anti-timè (Liu et al., 2016; Zheng Y. et al., 2018). Apa de sa yo, kurkumin inibit aktivite tirozinaz ak siprime melanogenesis nan melanosit (Lee et al., 2010; Tu et al., 2012). Men, pòv byodisponibilite kurkumin limite aplikasyon li (Karthikeyan et al., 2020). Pou rezoud pwoblèm sa a, J147 devlope kòm yon konpoze ki pisan nan derive kurkumin ak pi gwo estabilite ak byodisponibilite (Li et al., 2020). J147 gen yon efè neuroprotective e kounye a nan faz I esè klinik pou maladi alzayme a. Sepandan, toujou pa gen okenn rapò sou efè J147 sou pigmantè nan vitro ak nan vivo.

MATERYÈL AK METÒD

Reyaktif

J147 (J302241), -MSH (M118985), ak tirozinaz nan djondjon (T128536) yo te jwenn nan Aladdin (Shanghai, Lachin). Nou jwenn antikò kont Myosin Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc{-8401), Rab27a (sc{{{ 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) ak p38 MAPK (sc-398546) soti nan Santa Cruz (CA, USA). Antikò yo kont MITF (97800), p-MEK (2338), MEK (4694), p-ERK (4370), ak ERK (4695) yo te jwenn nan Cell Signaling Technology (MA, USA). Antikò yo kont tirozinaz (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), cytokeratin (ab7753), ak S100 (ab133519) yo te jwenn nan Abcam (Cambridge, UK). p38 inhibitor SB203580 (S1863), ERK inhibitor PD98059 (S1805), twous tès pwoteyin BCA (P0012), tanpon lysis selil (P0013), ak -aktin (AF5001) yo te jwenn nan Beyotime (Shanghai, Lachin). Twous RT-qPCR (RR036A) yo te achte nan men Takara Biomedical Technology (Beijing, Lachin).

Kilti Selil

Esè MTT

Yo te egzamine viabilite selil pa MTT (Yun et al., 2020). Yon ti tan, selil yo te simen nan 96-plak byen epi yo te trete ak J147 (1-8 μM) pou 48 èdtan. Lè sa a, selil yo te lave ak PBS epi ranplase ak solisyon MTT (20 μL). Apre enkubasyon pou yon lòt 4 èdtan, yo te retire solisyon supernatant la epi yo te ajoute DMSO (200 μL) nan chak pi. Finalman, yo te detèmine absorpsyon optik nan 570 nm.

Mezi nan Melanin kontni

Selil ki gen yon dansite 2 × 105 selil/mL yo te simen nan 6-plak kilti byen. Apre enkubasyon 24 èdtan, selil yo te kiltive ak diferan dòz J147 (1, 2, 4 μM) ak ak oswa san eksitasyon -MSH (60 nM). Apre tretman 48 èdtan, selil yo te rekòlte epi yo te fonn melanin total nan granules selil la nan 100 μL solisyon k ap travay NaOH (1 mol / L, 10 pousan DMSO) nan 80 degre C pou 1 èdtan, epi yo te mezire absorpsyon an nan 405. nm (Lv et al., 2015; Lv et al., 2019).

Egzamen Aktivite Tirozinaz

Yo te egzamine aktivite tirozinaz selilè jan sa dekri deja (Liao et al., 2017; Lv et al., 2020a). An brèf, selil yo te lysed pa tanpon lysis selil apre yo fin lave twa fwa, ak Lè sa a, supernatant la pou tès aktivite tirozinaz yo te jwenn nan santrifuje lysates yo. 100 μL PBS (0.1M, pH 6.5) kontni 10 ug pwoteyin melanje ak 100 μL 0.1 pousan L-DOPA. Plak la te enkube nan 37 degre pou 1 èdtan, ak Lè sa a, absòbe optik nan 475 nm te kontwole.

Efè dirèk J147 sou aktivite tirozinaz te teste pa yon sistèm san selil jan sa dekri deja (Lv et al., 2020a). An brèf, reyaksyon an pou detèminasyon aktivite tirozinaz djondjon fèt nan yon plak 96-byen ak melanj reyaksyon an te genyen tirozinaz djondjon (10 inite), L-tirosin (0.03 pousan, 50 μL), ak 100 μL PBS. (0.1 M, pH 6.5) ajoute ak konsantrasyon diferan nan J147. Apre enkubasyon nan 37 degre pou 10 min, yo te mezire absorpsyon nan 475 nm lè l sèvi avèk yon espektwofotomèt mikroplak.

Masson-Fontana tach ajan amonyakal

Pou detekte pigman melanin, moso po, ak melanosit yo te fiks nan fòmalin ak tache swiv pwotokòl estanda a (Gu et al., 2018; Lv et al., 2020b). An brèf, glisad yo te lave 3 fwa ak dlo deyonize epi yo te enkube nan solisyon ajan amonyakal nan tanperati chanm pou 12 èdtan. Apre rense byen nan dlo deyonize, glisad yo te enkube nan solisyon ipo pou 5 min. Apre sa, glisad yo te rense ankò epi yo te kontre ak yon tach wouj net pou yon lòt 5 minit. Finalman, apre yon bon rense, yo te obsève glisad anba yon mikwoskòp Nikon-Eclipse-Ti.

Imunofluoresans pou transfè Melanosome

Sistèm kokilti B16F10 ak selil HaCaT yo te etabli sou plat konfokal la, jan sa dekri deja (Lee et al., 2015; Lv et al., 2020c). Apre tretman J147, selil yo te immunostained ak anti-GP100 ak anti-Cytokeratin dapre pwotokòl estanda a. Yo te pran imaj nan mikwoskòp Nikon-Eclipse-Ti.

Imunohistochimi pou S-100

Immunohistochemistry pou S-100 te fè jan sa te dekri deja (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Yon deskripsyon tou kout te jan sa a: glisad yo te bloke ak 5 pousan BSA nan 25 degre C pou 1 èdtan ak Lè sa a, enkubasyon ak anti-S-100 antikò prensipal nan 4 degre C lannwit lan. Nan denmen, glisad yo te lave 3 fwa ak solisyon TBST ak enkubasyon ak antikò segondè a. Lè sa a, glisad yo te trete ak aminoethyl carbazol pou devlope seksyon yo epi yo te obsève anba yon mikwoskòp.

Ranvèse transcription-PCR

Selilè total RNA te extrait pa réactif TRIzol ak quantifié spectrophotometrically. Lè sa a, yo te itilize SuperScript II Reverse Transcriptase pou fè sentèz yon sèl-blokecDNA swiv enstriksyon fabrikasyon yo.Jadendanfan oligonukleotid yo te achte nan men GenScript(Nanjing, Lachin). Sekans yo nanMITFpremye jèn yo se 5′- AGAGCAGGGCAGAGAGTGAGTG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. Sekans yo nanGAPDHjènprimè yo se 5′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, 5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. Pwodwi PCR yo tesepare pa elektwoforèz sou 1 pousan jèl agaroz ak detekteanba limyè iltravyolèt (Lee et al., 2013).

Western Blotting

Pwoteyin (40 ug) yo te separe pa jèl SDS-PAGE ak transfere nan manbràn filtre nitrocellulose (NC) pa yon sistèm transfè elektwoforetik (Bio-Rad). Manbràn NC yo te bloke ak 3 pousan BSA nan solisyon TBST nan tanperati chanm pou 1.5 èdtan. Lè sa a, manbràn yo te enkube ak antikò prensipal nan 4 degre lannwit lan. Nan denmen, blots yo te lave 3 fwa ak solisyon TBST ak Lè sa a, enkubasyon ak peroksidaz-konjige antikò segondè nan 25 degre pou 1 èdtan, ak vizyalize lè l sèvi avèk chemiluminescence amelyore (Lv et al., 2020d).

Detèminasyon kontni Melanin nan modèl Zebrafish

Yon ti tan, yo te rasanble anbriyon senkronize yo ak pipèt (twa a kat anbriyon pou chak pi ak 200 μL anbriyon mwayen nan 96-plak byen). Lè sa a, J147 ak PTU yo te fonn nan 0.1 pousan DMSO epi yo te ajoute nan mwayen anbriyon an soti nan 35 a 60 h (25 h ekspoze). Enfliyans J147 sou melanogenesis zebrafish te obsève anba stereomikwoskòp la (Zheng J. et al., 2018).

Fenotip ki baze sou Evalyasyon ak UVB-induit Hyperpigmentation Guinea Pig Modèl

8 kochon Gine mawon (6 semèn, apeprè 250-300 g) te achte nan men Enstiti Syans Animal Laboratwa (Beijing, Lachin). Kochon Gine sa yo te kenbe poukont yo nan yon chanm tanperati ak imidite konstan anba yon sik limyè/nwa 12-h. Zòn separe yo (sèk dyametral 1 cm) nan do chak bèt yo te ekspoze a 500 mJ/cm2 UVB (Sigma SH -4, Shanghai, Lachin) yon fwa pa jou pou 1 semèn pou etabli modèl ipèpigmantasyon an. Lè sa a, machin nan (PEG400/EtOH=7:3) ak J147 (1 pousan) yo te bay zòn hyperpigmented yo (20 μL solisyon pou chak sèk) de fwa pa jou pou 3 semèn. Degre pigmantè a te evalye lè yo kalkile ΔL-valè dapre valè L ki mezire pa espektrofotomèt la (YS3010, 3nh, Shenzhen, Lachin), jan sa a: ΔL=L (nan chak jou mezire) -L (nan jou 0) (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Tout pwosedi bèt nan etid sa a te apwouve pa swen bèt ak itilizasyon komite nan Changzhou University.

Analiz estatistik

REZILTA

J147 Diminye Melanogenesis ak kantite Dendrit nan selil B16F10

Yo montre estrikti J147 nan Figi 1A. Premyèman, yo te fè yon eksperyans viabilite selil pou mennen ankèt sou si J147 te cytotoxik nan selil B16F10. Jan yo montre nan Figi 1B, pa gen okenn efè sitotoksik nan J147 yo te obsève nan yon seri dòz 1-8 μM apre 48 èdtan. Lè sa a, nou egzamine enfliyans J147 sou sentèz melanin. Jan yo montre nan Figi 1C, J147 inibit sentèz melanin fondamantal. -MSH siyifikativman ankouraje melanogenesis nan melanosit. Ogmantasyon nan melanogenesis pwovoke pa -MSH te ranvèse apre tretman J147. Toujou, tach ajan amonyak Masson-Fontana te montre ke J147 konsiderableman redwi kontni melanin nan selil B16F10 avèk oswa san -MSH (Figi 1D). Anplis de sa, kantite ak longè dendrit yo ak konsantrasyon melanin nan dendrit yo te diminye tou lè yo konpare ak selil ki pa trete (Figi 1D). Rezilta yo sijere ke J147 diminye melanogenesis ak fòmasyon dendrite san efè sitotoksik.

J147 anpeche aktivite tirozinaz selilè ak ekspresyon tirozinaz, TRP-1, TRP-2

Fanmi pwoteyin tirozinaz yo (tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2) te patisipe nan melanogenesis. Pami sa yo, tirozinaz yo se anzim kle ki kontwole chemen biosentetik melanin (D'Mello et al., 2016). Pou detèmine si J147 enfliyanse aktivite tirozinaz, nou te premye itilize metòd oksidasyon L-DOPA pou detèmine efè J147 sou aktivite tirozinaz selilè. J147 (1-4 μM) yo te montre fè egzèsis efè pwofon inhibitor sou aktivite tirozinaz selilè nan yon fason ki depann de dòz nan selil B16F10 (Figi 2A). Apre sa, yo te fè yon tès aktivite tirozinaz djondjon pou detèmine efè dirèk J147 sou aktivite tirozinaz. Jan yo montre nan Figi 2B, pa gen okenn efè inhibition yo te obsève, ki endike ke J147 pa t enfliyanse aktivite yo anzimatik nan tirosinaz djondjon (Figi 2B). Kòm nou konnen, melanogenesis kontwole pa aktivite a ak kantite tirozinaz sa yo. Pou envestige si efè anti-melanogenic J147 yo korelasyon ak ekspresyon de tirozinaz, analiz Western blot te fèt. Jan yo montre nan Figi 2C, nivo ekspresyon tirozinaz yo te siyifikativman redwi apre tretman J147 avèk oswa san -MSH, e menm rezilta yo te obsève nan ekspresyon TRP-1 ak TRP-2. Obsèvasyon sa yo te endike ke J147 inibit aktivite tirozinaz selilè ak melanogenesis pa diminye nivo ekspresyon tirozinaz, TRP-1, ak TRP-2.

J147 anpeche transpò Melanosome pa regle ekspresyon Myosin Va, Rab27a ak Cdc42.

Pigmantasyon po moun detèmine pa sentèz melanin ak distribisyon melanin. Nan melanosit mamifè, melanin sitou fèt nan kò selil la akimigre ansanm ak filaman aktinak mikrotubul nan dendrit, epi finalmannan keratinosit vwazen yo finidistribisyon anpwosesis (Ohbayashi ak Fukuda, 2012). Jan yo montre nanFigi 1D, J147 ansibleman diminye fòmasyon dendrit la.Anplis de sa, konsantrasyon nan melanin nan dendrit te touredwi kòm pigman melanin la te rasanble nan perinuclear larejyon yo. Apre sa, nou ko-kilti B16F10 ak HaCaT selil yoenvestige si J147 enfliyansetransfè melanozòm nankeratinosit pa mikwoskopi konfokal. Distribisyon an nanmelanin te wè nan selil HaCaT nan ko-kilti amodèl (Figi 3A). Nan contrast, pandan y ap modèl la ko-kilti tetrete ak J147 pou 48 h, siyal granulaire melanosom nanSelil HaCaT yo te siyifikativmanredwi (Figi 3A).

Pou plis klarifye mekanis ki kache nan efè anpèchman transfè melanozòm pa J147, nou te egzamine plizyè faktè enpòtan ki enplike nan transpò melanozòm. KIF5b medyatè transpò melanozòm deyò ansanm mikrotubul yo, ak konplèks Rab27a Melanophilin-Myosin Va kontribye nan transpò melanozòm ansanm filaman aktin nan melanosit (Reiner et al., 2020). Anplis de sa, Cdc42 stimul fòmasyon dendrit nan melanosit, ki tou jwe yon wòl esansyèl nan transpò melanozòm. Jan yo montre nan Figi 3B, ekspresyon Cdc42, Myosin Va, ak Rab27a, men se pa KIF5b, te siyifikativman diminye apre tretman J147 nan kondisyon avèk oswa san -MSH. Rezilta nou yo endike ke J147 inibit transpò melanozòm pa diminye ekspresyon Myosin Va, Rab27a, ak Cdc42.

J147 Degradasyon MITF akselere

MITF se youn nan regilatè kle pou melanogenesis epi li kontwole transkripsyon jèn tirozinaz, TRP-1, TRP-2, Cdc42, ak Rab27a (Noguchi et al., 2016; Kim et al., 2019). ). Premye nou te egzamine enfliyans J147 sou transkripsyon MITF yo. Jan yo montre nan Figi 4A, -MSH konsiderableman ogmante transkripsyon MITF, sepandan, pa gen okenn chanjman obsève apre tretman J147, ki endike ke J147 pa downregulate ekspresyon MITF. Apre sa, nou te egzamine si J147 enfliyanse tradiksyon MITF. Jan yo montre nan Figi 4B, apre tretman -MSH, nivo pwoteyin MITF ogmante, pik nan 4 h, epi yo te kòmanse diminye nan 8 h (Figi 4B). Yon fason diferan, nivo pwoteyin MITF yo pa t diminye nan 4 èdtan apre tretman J147, men nan 8 èdtan nivo pwoteyin MITF yo rapidman te refize nan nivo endeslabl, sa ki endike ke J147 pa enfliyanse tradiksyon MITF men akselere degradasyon pwoteyin MITF.

J147 Siprime Melanogenesis atravè chemen siyal MEK/ERK

Mitogen-aktive pwoteyin kinaz (MAPK) chemen siyal, ki gen ladan siyal kinaz kinaz (ERK), p38, ak c-jun N-terminal kinase (JNK), jwe wòl enpòtan nan pigmantasyon (Lee et al., 2013). Fosforilasyon ERK li te ye pou fasilite degradasyon MITF epi evantyèlman gaye stimuli melanojèn yo, ki reprezante yon gwo mekanis fidbak negatif (Kwon et al., 2017). Sepandan, fonksyon p38 la ak chemen JNK la rete kontwovèsyal. Pakonsekan, nou egzamine efè J147 sou chemen siyal MAPK yo. Jan yo montre nan Figi 5A, J147 aktive MEK / ERK ak p38, tandiske pa gen okenn enfliyans yo te jwenn nan fosforilasyon chemen an siyal JNK.

Pou plis enfòmasyon: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501