Wòl Melanogenic Serom/PDGF-depandan Nivo Minit Onkogenic Kinase PAK1 nan Selil Melanoma pwouve pa Trè Sansib Kinase Assay la.

Kontakte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Rezime:Nou te deja demontre ke onkogenik kinaz PAK4, ki tou de melanom ak melanosit nòmal eksprime nan yon nivo trè wo, esansyèl pou yo.melanogenesis. Nan etid la kounye a, lè l sèvi avèk trè sansib "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) kinaz tès la, nou envestige potansyèl la melanogenic nan yon lòt onkogenic kinase PAK1, ki melanom (B16F10) selil eksprime sèlman nan yon nivo trè minit. Apre transfekte selil melanom ak PAK1-shRNA pou silans jèn PAK1, kontni melanin,tirozinazaktivite, ak aktivite kinaz nan PAK1 yo te konpare ant kalite sovaj la ak transfectants. Nou te jwenn ke (i) PAK1 siyifikativman aktive pa òmòn melanogenic tankou IBMX (3-isobutil{-1-methyl xanthine) ak -MSH (melanocyte-stimulating hormone), (ii) silans jèn nan PAK1 andojèn nan selil melanom atravè PAK1-shRNA espesifik diminye ni kontni melanin aktirozinazaktivite nan prezans tou de òmòn serom ak melanogenic nan nivo fondamantal, (iii) PAK1 nan kalite sovaj ajoute exogenously nan selil melanom yo ranfòse nivo melanin -MSH-induzibl nan plizyè pli san yo pa afekte fondamantal la, ak (iv) - MSH/IBMX-induit melanogenesis diman pran plas nan absans la nan swa serom oswa PAK1, ki endike klèman ke PAK1 se esansyèl sitou pou serom- ak -MSH / IBMX-depandanmelanogenesis, men se pa fondamantal la, nan selil melanom. Rezilta etid sa a ta ka bay premye baz syantifik pou eksplike poukisa yon gran varyete PAK 1-blokatè èrbal tankou CAPE (asid kafeyik phenethyl ester), kurkumin, ak shikonin nan pwodui kosmetik yo itil poupo-blanchiman.

Mo kle:PAK1,melanogenesis, melanom,tirozinaz, MITF,po-blanchiman, serom

blanchiman po pwodwi cistanche

Entwodiksyon

Koulè cheve, iris je, ak po yo kontwole pa yon fanmi pigman yo rele melanin. Sous melanin entraselilè a se tirozin epi li konvèti an melanin atravè yon seri oksidasyon anzimatik (idwoksilasyon) ki enplike.tirozinaz, TRP (pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz) 1, ak TRP2. Ekspresyon jèn ki kode pou anzim melanojèn sa yo mande pou omwen de faktè transcription onkogenic/melanogenic (MTFs): beta-catenin ak MITF (faktè transkripsyon ki asosye ak mikroftalmi). Majorite nan konpoze èrbal nanpo-blanchimanpwodui kosmetik swa anpeche dirèkteman anzim melanogenic sa yo oswa desann-reglemante MTF yo. Analog tirozin tankou asid kojik fè pati premye kategori a (tirozinazinhibiteurs), pandan ke majorite rès tankou CAPE (asid kafeyik phenethyl ester), kurkumin, ak shikonin fè pati dezyèm kategori a (MTF regilatè) (1,2). Enteresan, anpil nan regilatè MTF sa yo ki gen ladan CAPE, kurkumin, shikonin, ak cucurbitacin yo konnen yo bloke onkogenic / aging kinase PAK1 (RAC / CDC42-aktive kinaz 1) (3-5). Kidonk, li pi sanble ke PAK1 patisipe nan aktivasyon faktè transcription melanogenic/oncogenic sa yo nan selil cheve, iris je, oswa melanosit po. Vreman vre, omwen beta-catenin se pami substrats dirèk nan PAK1 (6). PAK1 fosforil beta-catenin nan Ser 675 pou aktivasyon an, ki mennen nan transfòmasyon malfezan. Anplis de sa, beta-catenin esansyèl pou aktivasyon MITF, ki mennen nanmelanogenesisoswa/ak onkojenèz melanosit (7).

Enteresan, sepandan, li te dènyèman revele ke jèn PAK1 frape-soti pou chak sourit pigmantè echwe pou pwodwi nenpòt sourit albino (Hong He et al., obsèvasyon ki pa pibliye), ki endike klèman ke omwen melanjenis la fondamantal nan tou de selil cheve ak je. iris se endepandan de PAK1, byenke kontribisyon nan PAK1 nan pomelanogenesisrete pou klarifye.

Nou te deja montre ke onkogenic kinase PAK4 (CDC42-depandan kinaz 4) trè eksprime nan tou de melanom ak liy selil nòmal melanosit, epi li responsab pou melanogenesis yo, aktive CREB/beta-catenin-MIFT-tirozinazchemen, pandan ke PAK2 (RAC/CDC42-aktive kinaz 2), yon lòt manm trè eksprime nan fanmi PAK, pa jwe okenn wòl nan melanogenesis yo (8).

Nan etid sa a, nou bay premye prèv byochimik pou yon wòl espesifik nan yon lòt kinaz onkogenik ki rele PAK1 nan po.melanogenesis, malgre lefèt ke nivo ekspresyon li se minit: silansman shRNA-induced nan jèn PAK1 nan melanosit (B16F10) ki sòti nan melanom sourit siyifikativman redwi -MSH / IBMX-induzibl la.melanogenesisnan nivo fondamantal la, pandan y ap twòp ekspresyon nan jèn PAK1 ranfòse melanogenesis nan -MSH-induzibl san yo pa afekte fondamantal la. Anplis de sa, nou te jwenn ke -MSH / IBMXinducible melanogenesis la mande pou yon faktè serik ki gen plis chans PDGF (faktè kwasans ki sòti nan plakèt). Nan mwayen san serom, sèlman fondamantalmelanogenesispran plas.

sistanchdiminye aktivite tirozinaz la

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Materyèl

Selil melanom B16F10 yo te achte nan men American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). PAK1-SureSilencing plasmid, transfeksyon atire, endofree® plasmid maxi kit te achte nan men Qiagen (Valencia, CA 91355, USA). Antikò prensipal PAK1-, antikò segondè biotinilate, reyaktif signalfireTM ECL yo te jwenn nan Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Kinase Glo reyaktif ak ATP (ATP_Glo kinaz twous) te achte nan men Promega (Madison, Wisconsin, USA). Lipofectamine ak JM109 selil konpetan yo te achte nan men Invitrogen ak Teknoloji lavi. AG1295 ak AG1478 yo te achte nan men Calbiochem (San Diego, CA, USA). Tout lòt pwodui chimik ki gen ladan moun PDGF-bb yo te achte nan men Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.2. Silans jèn PAK1 nan melanosit sourit (B16F10) pa transfeksyon ki estab ak sourit PAK1-shRNA espesifik.

2.2.1. Kilti selilè

Selil melanom B16F10 yo te kiltive nan DMEM siplemantè ak 10 pousan FBS aktive chalè ak 1 pousan penisilin/streptomycin (10,000 U/mL ak 100 µg/mL) nan 37 degre nan yon atmosfè imidite ki gen 5 pousan CO2.

2.2.2. Transfeksyon ki estab ak sourit PAK1-shRNA espesifik

Transfeksyon ShRNA nan liy selil B16F10 te fèt fondamantalman atravè menm pwosedi a deja dekri (9), men ak sourit PAK1-shRNA espesifik (# KM04553, Qiagen). Kat klonaj distenk shRNAs sa yo te itilize pou transfèksyon an: klonaj 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), klonaj 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), klonaj 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT), ak klonaj 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) osi byen ke shRNA kontwòl negatif (WT) . Sepandan, nan etid sa a, klon 1 ak 2 yo te vin pi efikas pase klon 3 ak 4 pou silans jèn PAK1 sourit nan liy melanosit sa a (done yo pa montre). Transfektan ki estab yo te chwazi nan prezans G418 (1 mg / mL) ki touye plis pase 99 pousan nan selil ki pa transfekte.

2.2.3. Analiz Western-blot nan nivo pwoteyin PAK1 ak tès in vitro pou aktivite kinaz PAK1 nan transfektan

2.2.3.1. Analiz Western blot

Pou nou ka mezire nivo PAK1 ki ba anpil nan liy selil kontwòl (WT) ak transfektan PAK1-silans (G418-rezistan), lè nou minimize nivo "bri ki pa espesifik", nou te fè pati lwès la. analiz blot lè l sèvi avèk yon antikò poliklonal lapen kont PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) kòm antikò prensipal la. Yon ti tan, chak script te simen nan konsantrasyon nan 2 × 105 selil / byen nan yon plak 6 byen, precultured pou 48 èdtan, epi lisat selil yo te bouyi nan 25 µL nan tanpon SDS-PAGE pou 5 min. Yo te itilize uit µL (ki gen 15 µg pwoteyin total) chak supernatant pou chak plas pou SDS-PAGE. Nitrocellulose a te efase ak anti-PAK1 IgG (1:1,000 dilution kòm yon antikò prensipal), ak kòm antikò segondè, HRP-lye anti-lapen IgG la ak anti-biotin IgG (#7074, # 7075, Cell Signaling) yo te itilize pou detekte tou de PAK1 ak -aktin bann ki te finalman vizyalize ak sistèm ECL nan Amersham. Egzamen Western blot yo te reprezante twa eksperyans endepandan.

2.2.3.2. "Makawoni-Western" (IP-ATP_Glo) tès kinaz pou PAK1 nan selil melanom

Aktivite kinaz PAK1 nan melanosit WT ak transfektan shRNA yo (SHs) te mezire pa yon modifikasyon sibstansyèl (5) nan yon metòd ki gen yon deseni ki fin vye granmoun (ki nou te envante "Makawoni-Lwès") devlope pa yon gwoup Italyen (1{{39). }}). Yon ti tan, liy selil B16F10 melanom (WT oswa SHs, 2 × 105 selil/mL) yo te pre-kilti sou 6-plak byen pou 24 èdtan. Lè sa a, selil yo te trete ak 100 nM -MSH oswa 100 µM IBMX pou 48 èdtan. Selil yo te deranje pa tanpon lysis ki gen 50 mM Tris HCl pH 7.5 ak 150 mM NaCl ak 1 pousan Triton-X. Pou iminopresipasyon (IP) PAK1, lisat selil ki netwaye yo te enkube ak anti-PAK1 IgG (dilution 1:50) ak pèl pwoteyin A-agarose pou 1-2 h nan chanm frèt la ak souke kontinyèl pa yon mixer rotary. (Nissin, Suginami-ku, Tokyo, Japon). IP rezilta (PAK1) ki soti nan chak lysate te enkube ak ATP Glo kinase assay kit (Promega) nan prezans ATP ak MBP (myelin debaz pwoteyin) pou 1 èdtan nan 37 degre, ak nivo ATP ki rete a te mezire pa ATP-. depandan reyaksyon Luciferin-Luciferase ki finalman jenere yon luminesans (10). Sispansyon final la te santrifuje, epi sipènatant la te transfere nan yon plak 96-pou pou li. Lektè mikwoplak MTP-880Lab (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japon) te anrejistre luminesans ak yon tan entegrasyon 0.5 s pou chak pui.

2.3. Mezire kontni melanin ak aktivite tirozinaz nan transfektan

2.3.1. Mezi kontni melanin

Kontni Melanin te detèmine jan sa deja dekri (11). An brèf, selil B16F10 (tip sovaj oswa PAK1-espesifik transfektan shRNA) yo te plake nan yon dansite 2 × 104 selil/pi nan yon plak 24-byen. Apre 24 èdtan nan kilti, yo te ajoute 100 µM isobutil-1-methylxanthine (IBMX) oswa 100 nM -MSH epi enkube pou yon lòt 72 èdtan nan 37 degre. Selil yo te lave de fwa ak tanpon fosfat, Lè sa a, lyzed ak 500 µL nan yon solisyon ki gen 1 M NaOH ak 10 pousan DMSO ak enkubasyon nan 80 degre pou 1 èdtan, yo solubilize melanin la, ak kontni an melanin te mezire nan 490 nm. Pou konpare kontni melanin nan selil sovaj ak selil transfekte yo, kantite total melanin ki te pwodwi pa melanosit sovaj yo te konsidere kòm kontwòl (100 pousan), ak sa yo ki transfekte yo te kalkile kòmsadwa.

2.3.2. Esè pou aktivite tirozinaz intraselilè

Tirozinazaktivite te detèmine jan sa dekri deja (12), ak yon modifikasyon ti tay. Selil B16F10 (tip sovaj oswa transfektan yo) yo te plake nan yon dansite 2 × 104 selil / pi, epi apre 24 èdtan nan kilti, 100 µM IBMX oswa 100 nM -MSH te ajoute ak enkubasyon pou yon lòt 72 èdtan nan 37 degre. . Lè sa a, selil yo te lave ak glas-frèt tanpon fosfat ak lysed ak tanpon fosfat (pH 6.8) ki gen 1 pousan Triton-X (500 µL / byen). Plak yo te jele nan -80 degre pou 30 minit. Apre dekonjle, yo te ajoute 100 µL 1 pousan L-DOPA nan chak pi. Apre enkubasyon nan 37 degre pou 2 èdtan, yo te mezire absòbe a nan 490 nm.

2.4. Mezire kontni an melanin nan kalite sovaj la ak PAK1-overexpress melanosit apre tretman -MSH

Lè l sèvi avèk Myc vektè (2 µg), melanosit (B16F10) yo te transfekte tanporèman ak swa kalite sovaj (WT) PAK1 oswa sa yo rele "konstititif aktive" (CA) PAK1 pote mitasyon T423E. Apre 3 jou nan kilti, yo te rekòlte chak script transfekte pou plis eksperyans. Yo te mezire efè PAK1-overexpression sou kontni melanin la atravè menm pwosedi ki dekri deja (8). Yon ti tan, melanosit, swa kalite sovaj oswa PAK1-overespresyon ki eksprime swa PAK1 sovaj oswa mutan CA li yo, yo te enkube ak 100 nM -MSH pou 3 jou. Selil yo te lysed ak yon solisyon ki gen 1 M NaOH ak 20 pousan DMSO pou fonn melanin la, epi kontni li yo te detèmine nan 405 nm.

2.5. Melanogenesis nan yon mwayen san serom

Selil B16F10 (tip sovaj oswa PAK1-transfektan shRNA espesifik) yo te plake nan yon dansite 2 × 104 selil/byen nan yon plak 24-byen an prezans 10 pousan FBS. Apre 24 èdtan nan enkubasyon, yo ranplase mwayen kilti a ak yon mwayen san serom, epi kiltive pou yon lòt 72 èdtan avèk oswa san 100 µM IBMX oswa 100 nM -MSH pou mezire kontni melanin.

2.6. Efè inibitè reseptè PDGF / EGF sou melanogenesis serom depandan

2 × 104 selil B16F10 yo te simen nan chak pi pou 24 èdtan nan 10 pousan mwayen ki gen FBS, ak Lè sa a, kiltive pou yon lòt 72 èdtan nan mwayen an fre ki gen 100 nM -MSH ak sa ki annapre yo: (1) pa gen serom, (2) 10 pousan FBS pou kont li, (3) 10 pousan FBS plis 2 µM AG1295 (PDGF reseptè inhibiteur), ak (4) 10 pousan FBS plis 400 nM AG1478 (EGF reseptè inhibiteur), pou mezire kontni an melanin.

2.7. Analiz estatistik

Done yo eksprime kòm valè mwayen ak erè estanda yo. Konparezon estatistik yo te fèt pa yon sèl-fason ANOVA ki te swiv pa tès miltip Duncan a. Analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk SAS (version 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA), ak p Mwens pase oswa egal a 0.05 te konsidere kòm enpòtan.

maca ginseng cistanche

3. Rezilta yo

3.1. Aktivasyon PAK1 nan yon liy selil melanom (B16F10) pa òmòn melanogenic

De òmòn melanogenic, -MSH (melanocyte-stimulating hormone) ak IBMX (3-isobutil-1-methyl xanthine) yo souvan itilize pou ankourajemelanogenesisnan melanosit tankou liy selil melanom B16F10. Kidonk, nou te premye egzamine si òmòn sa yo ka aktive PAK1 nan liy selil sa a, byenke nivo pwoteyin PAK1 la trè ba, konpare ak sa yo ki nan PAK2 ak PAK4 (8). Pou kontwole chanjman ki fèt nan aktivite kinaz PAK1 nan selil yo, nou fèk devlope yon tès kinaz trè sansib/espesifik ki rele "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) pwotokòl tès kinaz lè nou konbine iminitè-presipitasyon (IP) PAK1 ki soti nan selil. lysates ak ATP_Glo kinaz twous Promega a (5). Sèvi ak tès kinaz sa a, nou te jwenn ke tou de -MSH (100 nM) ak IBMX (100 µM) aktive PAK1 nan selil melanom, ak -MSH ki pi pisan pase IBMX (gade nan Figi 1). Sepandan, nou ta dwe raple lektè yo ke deklanchman pliye PAK1 yo montre isit la se sèlman aparan, paske pandan IP tès tib ak tès kinaz sa a ki pran tan (plis pase 3 èdtan an total) k ap fèt san òmòn melanojèn sa yo, PAK1 ta dwe nòmalize piti piti. tan. Nan lòt mo, nou pa ka jele estati kinaz egzak PAK1 nan fen kilti selil trete ak stimulateur sa yo, ak aktivasyon pliye a se sèlman yon refleksyon sou-estime nan aktivasyon PAK1 ki te fèt pandan kilti selil pa simulateur sa yo.

3.2. Silans jèn PAK1 pa shRNAs nan liy selil melanom sourit

Yo nan lòd yo envestige plis byochimik si PAK1 kontribye nan lamelanogenesisnan selil po yo (melanosit), nou transfekte stab liy selil melanom B16F10 la ak sourit PAK1-shRNA espesifik pou fèmen jèn PAK1 an silans.

3.2.1. Silans PAK1 jèn nan melanosit

Analiz preliminè Western blot nou an te sigjere ke nan de klon diferan PAK1-silans (SH1 ak 2) nivo pwoteyin PAK1 yo redwi anpil (apeprè 75 pousan), men to kwasans liy selil melanom sa a pa t '. siyifikativman afekte pa silansman PAK1 (done yo pa montre). Sepandan, quantification egzat nan nivo pwoteyin PAK1 pa eskanè blot lwès sa a te pito difisil, sitou akòz gwo bri nan background alantou gwoup PAK1 nan efò pou visualize nivo ekspresyon ki ba li yo. Olye de sa, lè l sèvi avèk tès kinaz "Makawoni-Western" (5,10), nou verifye ke aktivite kinaz PAK1 nan tou de SH1 ak 2 klon yo se sèlman anviwon 25-30 pousan nan sa ki nan selil kontwòl (WT) yo ( gade Figi 2A).

3.2.2. Rediksyon nan melanogenesis la pa silans jèn PAK1

Pwochen kesyon kritik nou an te si yon rediksyon konsa nan aktivite kinaz PAK1 afektemelanogenesis. Kidonk, yo te konpare kontni melanin nan klon sa yo (SH1 ak 2) ak selil melanom sovaj (WT), apre yo fin trete tout selil sa yo ak -MSH, yon pwodiktè melanojenik, pou 72 èdtan. Jan yo montre nan Figi 2B, kontni melanin nan PAK1-defisyan melanosit sa yo (SH1 ak 2) redwi pa anviwon 50 pousan (51-55 pousan), rive nan nivo fondamantal nan WT san òmòn melanojèn. Pou wè si rediksyon sa a nan kontni melanin ki asosye ak repwesyon aktivite tirozinaz, nou meziretirozinazaktivite nan selil PAK1-defisyan (klon SH1 ak 2), konpare ak WT la. Jan yo montre nan Figi 2C, aktivite tirozinaz nan selil PAK1-defisyan yo se sèlman anviwon 45 pousan (33-58 pousan) nan sa ki nan WT a, ankò rive nan nivo fondamantal (ki pa stimulé), ki endike klèman. ke PAK1 esansyèl pou -MSH-induit melanin pwodiksyon patirozinaznan melanosit. Anplis de sa, nan yon fason ki sanble anpil, melanogenesis IBMX-induit te tou redwi pa silans jèn PAK1 nan liy selil melanom sa a (done yo pa montre). Sepandan, pran de faktè sa yo an kont, li pi sanble ke sèlman yon mwatye nanmelanogenesisnan melanosit se PAK1-depandan, ak rès la (lajman "debaz") se PAK4-depandan: (i) PAK4 se esansyèl tou pou melanogenesis la -MSH-induit nan melanosit (8), ak (ii) anviwon 25 pousan jèn PAK1 parèt toujou eksprime nan transfektan sa yo (SH1 ak 2). Sepandan, li rete yo dwe klarifye kouray si PAK1 responsab pou òmòn-induzibl la oswa fondamantal la.melanogenesis.

Anplis de sa, nou te konfime ke PAK1 andojèn nan siyifikativman aktive pa pwodiktè melanojèn tankou IBMX ak -MSH nan liy selil melanom sa a (gade Figi 1), men san okenn chanjman enpòtan nan otofosforilasyon li nan Thr 423 jan yo jije pa anti-pPAK1 la. antikò (done yo pa montre).

3.3. Ogmantasyon nan -MSH-inducible melanogenesis pa eksprime PAK1

Pa ekspresyon jèn ki kalite sovaj (WT) PAK1 nan melanosit (liy selil B16F10) pa transfèksyon, nou te revele ke jèn PAK1 ki te ajoute eksogene a ranfòse nivo melanin -MSH-induzibl nan plizyè pli (gade sou bò gòch Figi 3 la, konpare. liy 2 ak 4), pandan ke li diman afekte nivo melanin endepandan "bazal" poukont li (konpare liy 1 ak 3 nan panèl gòch Figi 3), sijere ke PAK1 kontribye sitou nan -MSH/IBMX-depandanmelanogenesis, epi yo pa melanogenesis debaz la san stimulator (yo) ekzojèn.

3.4. Efè serom sou -MSH / IBMX-inducible melanogenesis

Plis enteresan, nou te jwenn ke endiksyon an nan melanogenesis pa -MSH / IBMX mande pou 10 pousan FBS (serom fetal bovine) anplis PAK1. Jan yo montre nan Figi 4A, nan yon mwayen san serom, swa -MSH oswa IBMX diman pwovoke a.melanogenesisnan selil WT yo, byenke 10 pousan FBS la pou kont li (san -MSH/IBMX) pwovoke a.melanogenesissiyifikativman (pa anviwon 60 pousan). Enteresan, melanogenesis nan transfektan SH (selil PAK1-defisyan) nan prezans oswa absans serom te menm nivo ak selil WT nan absans serom (gade Figi 4B), sijere ke melanogenesis serom-depandan. tou mande PAK1. Nan sipòte nosyon sa a, serom pou kont li siyifikativman aktive aktivite kinaz PAK1 nan selil WT, men aktivasyon an -MSH-depandan nan PAK1 nan selil WT mande pou serom (al gade Figi 4C).

Konsènan nati chimik nan faktè melanogenic serom ki pou kont li aktive PAK1, nou espekile ke li se PDGF (faktè kwasans ki sòti nan plakèt) pou rezon sa yo: (i) plis pase yon dekad de sa nou te montre ke PDGF se sèl faktè kwasans nan serom ki aktive PAK1 atravè transaktivasyon reseptè EGF (faktè kwasans epidèm) pa reseptè PDGF (13,14), ak dènyèman lòt moun te pwouve ke swa PDGF oswa EGF pou kont li vrèman stimul la.melanogenesisnan melanosit (15,16).

3.5. Melanogenesis nan serom/PDGF-depandan mande pou reseptè EGF

Nan yon tantativ pou idantifye nati chimik espesifik faktè melanogenic serom sa a, nou te teste efè swa AG1295 (inibitè espesifik pou reseptè PDGF) oswa AG1478 (enibitè espesifik pou reseptè EGF) sou serom-depandan.melanogenesisnan melanosit. Jan yo montre nan Figi 5, swa 2 µM AG1295 oswa 400 nM AG1478 redwi anpil depandan nan serom.melanogenesisnan nivo ki ekivalan a melanogenesis debaz (san san serom). Depi PDGF prezan anpil nan serom, men se pa EGF ak AG1295 pa anpeche reseptè EGF, pandan y ap AG1478 pa anpeche reseptè PDGF (13), li pi sanble ke PDGF nan serom aktive reseptè li yo ki nan vire trans-aktive reseptè EGF ki evantyèlman aktive PAK1 ki esansyèl pou melanogenesis serom-depandan (pou detay, gade Figi 6). Dapre sipozisyon sa a, nou pral diskite pita mekanis ki gen plis chans ki kache sinèrji aparan ant -MSH ak serom / PDGF pou aktivasyon PAK1, ki mennen nan melanogenesis gaya.

Anfen, li ta dwe vo fè remake ke kontni an melanin "bazal" san yo pa -MSH pa te siyifikativman chanje pa twòp eksprime CA (konstititif aktif) mutant nan PAK1 pote T423E mitasyon (gade panèl la gòch nan Figi 3, liy 5) kòm si li te swa yon DN (dominan negatif) oswa mutan inaktif. An reyalite, -MSH pa t 'pwovoke fosforilasyon WT PAK1 nan Thr 423 nan tout (done yo pa montre). Kidonk, li ta ka konkli ke oto-fosforilasyon PAK1 nan Thr 423 pa gen anyen fè ak aktivasyon -MSH-induit nan PAK1, ki mennen nan gaya a.melanogenesisnan selil melanom. Depi T423E mutan PAK1 byen li te ye yo dwe trè onkojenik (6), petèt oto-fosforilasyon an nan Thr 423 ta ka sèvi yon switch soti nan "melanogenic" nan "onkogenic" siyal.

4. Diskisyon

Soti nan obsèvasyon nou sou melanogenesis depandan PAK1-depandan ak PAK4-depandan nan melanosit/melanom selil yo, gen de pwoblèm potansyèlman enteresan yo dwe vize deyò: (i) "espesifik" aktivite melanojèn nan PAK1 ( sèlman yon ti kras eksprime) dwe pi wo pase sa yo ki nan PAK4 (trè eksprime) nan selil melanom. (ii) Li sanble ke PAK1 se sitou responsab pou melanogenesis serom-induit, pandan y ap PAK4 se sitou responsab pou intrinsèque a (bazal)melanogenesis. Nan lòt mo, byenke PAK4-deficiency se anbriyonman letal nan sourit, pandan y ap defisi PAK1-pou kont li echwe pou pwodui sourit "albinos", diferans aparan nan koulè po orijinal la (debazmelanogenesis) ant moun nwa ak blan pou egzanp ta ka omwen an pati yon refleksyon nan diferans lan nan nivo ekspresyon PAK4, osi byen ke diferans nan nivo melanogenic.tirozinazs.

An vivo, lè l sèvi avèk sourit HRM-2 (pigmantè men san cheve), nou fèk montre ke yon krèm ki gen 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4-inhibiteur) diminye melanogenesis UV-induit nan po yo a. nivo fondamantal, byenke li toujou rete yo dwe klarifye si PAK4 oswa PAK1 ki responsab pou UV-endiksyon nan melanogenesis (8). Piske PAK1 responsab pou melanogenesis inductible a, men pa fondamantal, li ta vo tès si PAK1 kontribye anpil nan UV-induzibl la.melanogenesis(bwonzaj solèy) osi byen, lè l sèvi avèk ra PAK1 KO (frape soti) mutant ki sòti nan souch C57B16 sourit ki pote cheve nwa ak je (Hong He et al., obsèvasyon ki pa pibliye), nan yon tantativ pou konprann si yon varyete PAK1 èrbal. blockers nan pwodui kosmetik yo itil pou ajan tès depistaj solèy oswa ou pa. Enteresan PAK1 te rapòte ke yo te aktive pa iradyasyon UV ak lòt ajan ki domaje ADN (17).

Li te montre ke -MSH aktive Tyr kinaz JAK2 (18), ki an vire aktive PAK1 pa fosforilasyon an nan Tyr 285, (olye pou yo Thr 423), ki mennen nan entèraksyon an PIX-PAK1 (19). Sa a te kapab eksplike poukisa ni depandan -MSH-depandan aktivasyon PAK1 ni melanogenesis enplike otofosforilasyon PAK1 nan Thr 423. Kidonk, nou fèk envestige si PAK1-depandan melanogenesis la bloke pa yon JAK ki pisan èrbal2- inibitè ki rele cucurbitacin I (CBI) ki soti nan melon anmè (Goya) ki inibit dirèkteman JAK2 (20), epi li te jwenn ke CBI inibit la.melanogenesisan prezans òmòn melanogenic pa plis pase 70 pousan, sijere ke posiblite pou CBI bloke pa sèlman PAK1, men tou PAK4 (5). Nan kontèks sa a, li ta yon gwo enterè sonje ke PAK1-blockers èrbal yo tankou CAPE, kurkumin, shikonin, ak FTY 720 ta ka anpeche melanogenesis nan -MSH-induit nan sourit oswa selil po moun sèlman pa alantou. 50 pousan menm nan konsantrasyon yo kote PAK1 prèske konplètman bloke (1,2), tandiske sentetik pan-PAK-blocker PF3758309 la, ki anpeche tou de PAK1 ak PAK4, aboli la.melanogenesisnan selil po yo pa anviwon 90 pousan nan 300 nM (8). Nan lòt mo, sistèm melanogenic -MSH-induit nan melanosit te kapab distenge PAK1-blokatè espesifik yo ak pan PAK-blokatè. Jiskaprezan pa gen okenn bloke PAK4-espesifik (ki pa gen siRNA espesifik PAK4-) ​​yo te idantifye. Sepandan, dènyèman, yo te montre yon quassinoid trè pisan ki rele glaucarubinon ki sòti nan yon pye bwa anmè ki grandi nan forè Amazon yo bloke tou de PAK1 ak PAK4, anpeche kwasans selil kansè nan pankreyas tou de nan vitro ak nan vivo (21). Kidonk, li ta nan gwo enterè yo teste si sa a PAK-blocker èrbal siprime melanogenesis nan selil po prèske nèt tankou fè PF3758309.

Objektif prensipal etid sa a se te konsantre sou wòl melanojèn espesifik PAK1, epi yo pa envestige an detay ki jan PAK1 aktive chemen an siyal melanojèn ki gen ladan anzim melanojèn ak MTF. Sepandan, li pi sanble ke PAK1 aktive dirèkteman beta-catenin pa fosforilasyon nan Ser 675, ki mennen nan deklanchman MITF ki esansyèl pou ekspresyon jèn ki kode pou anzim melanogenic tankoutirozinaz(Tyr).

Dènyèman nou te jwenn ke PAK4 (CDC42-kinaz depandan 4) patisipe tou nanmelanogenesisnan menm liy selil melanom nan aktive de faktè transkripsyon, CREB ak beta-catenin, tou de nan yo ki esansyèl pou deklanchman MIFT (8). Piske CREB li te ye aktive pa LIM kinaz (22,23) ki tankou beta-catenin, se pami substrats dirèk komen nan tou de PAK1 ak PAK4 (6,18), li pi sanble ke PAK1 ak PAK4 pataje menm CREB la. /beta-catenin-MITF siyal chemen pou aktive jèn anzim melanogenic yo.

Sepandan, chemen siyal detaye ki mennen nan depandan -MSH/IBMX deklanchman PAK1 ta ka diferan anpil de sa ki mennen nan aktivasyon PAK4, sitou paske ansyen an enplike faktè serom (PDGF). Serom nan pou kont li se kapab aktive PAK1 (13) ak ranfòse aktivasyon an -MSH/IBMXdepandan nan PAK1 tou. Nan lòt mo, gen yon sinèrji klè ant serik la ak òmòn melanojèn sa yo nan tou de aktivasyon PAK1 akmelanogenesis.

Sa ki anba la a se ipotèz k ap travay nou an sou ki jan sinèrji sa a ta ka pran plas. Pi gwo chemen siyal ki mennen nan deklanchman PAK1 se EGFR onkojenik (reseptè faktè kwasans epidèm)-RAS-PI 3 kinaz-RAC/CDC42-PAK1 kaskad. Sepandan, kaskad sa a pou kont li pa ase pou deklanchman konplè a. Li bezwen yon lòt faktè ki rele PIX, yon pwoteyin adaptè SH3 ki mare dirèkteman PAK1 atravè motif Pro-rich li yo nan 18 asid amine ki rele PAK18. Entèraksyon PIX-PAK1 bezwen yon twazyèm pwoteyin ki rele JAK2, yon Tyr-kinase, ki fosforil PAK1 nan Tyr 285. RAS kontwole JAK2 atravè prolaktin. Dapre kèk konklizyon anvan nou ak lòt moun (13-16), PDGF (faktè kwasans ki sòti nan plakèt) se pi gwo faktè melanojèn nan serik esansyèl pou -MSH/IBMX-induit.melanogenesis, paske li aktive reseptè li yo (PDGFR) Tyr-kinase ki an vire trans-aktive EGFR (reseptè faktè kwasans epidèm =ErbB1) Tyr-kinase, ki mennen nan aktivasyon an nan PAK1 atravè onkogenik RAS-PI3 kinaz-RAC la. /CDC42 chemen (13). Kidonk, PDGF nan serom pou kont li ka aktive PAK1 ak pwovoke melanogenesis jiska mwatye. Sepandan, pou tout activation melanogenesis depandan PAK1-, -MSH/IBMX nesesè pou aktive JAK2 atravè yon chemen ki depann de cAMP (ki ta ka enplike PKA) ki evantyèlman asire entèraksyon PIX-PAK1 (pou plis detay, gade Figi 6).

An konklizyon, isit la nou prezante premye prèv byochimik ki ka eksplike kijan yon varyete PAK1-blokatè èrbal tankou CAPE, kurkumin, ak shikonin nan krèm kosmetik ta ka kontribye nan "po-blanchiman"efè. Yon seri etid analogue ak melanosit imen yo ap tann pou plis prèv oswa konfimasyon.

maca ginseng cistanche

Referans

1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Curcumin supprime alfa-melanocyte-estimile òmòn-estimile melanogenesis nan selil B16F10. Int J Mol Med. 2010; 26:101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Kafeyik asid phenethyl ester inibit alfa-melanocyte-estimulasyon òmòn-induit sentèz melanin nan siprime aktivite transactivation nan faktè transkripsyon ki asosye ak mikroftalmi. J Nat Prod. 2013; 76:1399-1405.

3. Maruta H. Terapi èrbal ki bloke onkojenik kinaz PAK1: Yon apwòch pratik nan direksyon pou maladi PAK1-depandan ak lonjevite. Phytother Res. 2014; 28:656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Plizyè konpoze èrbal nan plant Okinawa dirèkteman anpeche onkojenik / aje kinaz PAK1 la. Dwòg Discover Ther. 2014; 8:238-244.

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Konbinezon imunopresipitasyon (IP)-ATP_Glo kinaz tès ak melanogenesis pou evalyasyon PAK1-blockers ki pisan ak san danje nan kilti selilè . Dwòg Discover Ther. 2015; 9:289-295.

6. Li H, Maruta H. Onkogenicty nan PAK ak substrats yo. Nan: PAKs, RAC/CDC42 (p21)-aktive kinases: Vers gerizon kansè ak lòt maladi depandan PAK (Maruta H, ed.). Elsevier, Oxford, 2013; pp 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -Croissance mélanome Catenin-induit mande en sib Microphthalmia ki asosye faktè transcription. J Cell Biol. 2002; 158:1079-1087.

8. Yun CY, Ou ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p21-aktive kinaz 4 reglemante melanogenesis atravè deklanchman CREB/MITF ak -catenin/MITF chemen yo. J Invest Dermatol. 2015; 135:1385-1394.

9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21-aktive kinaz 1 stimul kwasans selil kansè nan kolon ak migrasyon/envazyon atravè ERK- ak AKT-depandan chemen. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803:1106-1113.

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Itilizasyon teknoloji luminesan pou devlope yon tès kinaz: Cdk4 kòm yon sistèm modèl. J Pharm Biomed Anal. 2005; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Efè inhibition nan phlorotannins izole nan Ecklonia cava sou aktivite tirozinaz djondjon ak fòmasyon melanin nan selil melanom B16F10 sourit. J Agric Food Chem. 2009; 57:4124-4129.

12. Li X, Guo L, Solèy Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein inibit melanogenesis atravè aktivasyon chemen an siyal ERK. Int J Mol Med. 2010; 25:923-927.

13. Li H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Faktè kwasans ki sòti nan plakèt mande pou reseptè faktè kwasans epidèm pou aktive p21-kinaz fanmi kinaz aktive. J Biol Chem. 2001; 276:26741-26744.

14. Saito Y, Haendeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk BC. Reseptè etero-dimerizasyon: Mekanis esansyèl pou transactivation reseptè faktè kwasans epidèm ki sòti nan plakèt. Mol selil Biol. 2001; 21:6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Faktè kwasans ki sòti nan plakèt kontwole pwopagasyon ak diferansyasyon melanosit imen nan yon fason espesifik etap diferansyasyon. J Dermatol Sci. 2016; 83:200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Faktè kwasans epidèm (EGF) ankouraje diferansyasyon an vitro nan selil krèt neral nan newòn ak melanosit. Selil Mol Neurobiol. 2009; 29:1087-1091.

17. Roig J, Traugh JA. p21-aktive pwoteyin kinaz gamma PAK aktive pa radyasyon iyonize ak lòt ajan domaje ADN. Resanblans ak diferans ak alfa PAK. J Biol Chem. 1999; 274:31119-31122.

18. Buggy JJ. Liaison òmòn alpha-melanocyte-stimulating la ak reseptè G-pwoteyin-makonnen li sou B-lymphocytes aktive chemen Jak/STAT la. Biochem J. 1998; 331:211-216.

19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. Phosphorylation nan tirozin 285 nan PAK1 fasilite PIX / GIT1 obligatwa ak woulman adezyon. FASEB J. 2015; 29:943-959.

20. Blaskovich MA, Solèy J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Dekouvèt JSI-124 (kucurbitacin I), yon transducer selektif Janus kinaz/siyal ak activateur nan inibitè chemen siyal transkripsyon 3 ak aktivite antitumoral ki pisan kont selil kansè imen ak murin nan sourit. Kansè Res. 2003; 63:1270-1279.

21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaucarubinon ak gemcitabine sinèrjetik redwi kwasans kansè nan pankreyas atravè down-regleman p21-aktive kinaz. Kansè Lett. 2014; 346:264-272.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. Chanjman cytoskeletal reglemante pa PAK4 serin/threonine kinase yo medyatè pa LIM kinaz 1 ak cofilin. J Biol Chem. 2001; 276:32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. LIM kinaz 1 aktive cAMP-reponn eleman-obligatwa pwoteyin pandan diferansyasyon newòn nan selil imòtalize ipokanp yo. J Biol Chem. 2004; 279:8903-8910.