Efè anti-aje Vitamin C sou Cardiomyocytes souch ki sòti nan selil souch imen

Résumé:

Selil souch pluripotent imen (hPSCs) te parèt kòm yon sous selil pou rechèch byomedikal akòz potansyèl devlopman yo. Selil souch yo genyen pwomès pou bay klinisyen yo nouvo tretman pou maladi a epi yo pèmèt chèchè yo jenere modèl metabolis selilè espesifik pou moun. Aje se yon pwosesis natirèl nan òganis vivan, men aje nan selil kè moun difisil pou etidye akòz konsiderasyon etik yo konsènan eksperimantasyon imen ak mank aktyèl la nan modèl eksperimantal altènatif. Cardiomyocytes ki sòti nan hPSC (CMs) gen yon resanblans ak selil kadyak imen e konsa CM ki sòti nan hPSC yo konsidere kòm yon modèl altènatif solid pou etidye aje selil kè moun. Nan etid sa a, nou te itilize CM ki sòti nan hPSC kòm yon modèl in vitro aje. Nou te pwodwi kardyomyosit soti nan hPSCs ak demontre pwosesis la nan aje nan tou de selil souch anbriyon imen (hESC) - ak pwovoke selil souch pluripotent (hiPSC) - ki sòti. Aje nan CMs hESC ki sòti nan korelasyon ak potansyèl manbràn redwi nan mitokondri, akimilasyon nan lipofuscin, yon modèl bat pi dousman, ak règleman desann nan telomeraz RNA imen (hTR) ak sik selil ki kontwole jèn yo. Enteresan, ekspresyon hTR nan CM ki sòti nan hiPSC pa te siyifikativman downregulated, kontrèman ak nan CM ki sòti nan hESC. Pou retade aje,vitamin Cte ajoute nan CM kiltive yo. Lè selil yo te trete ak 100μM nan vitamin C pou 48 h, efè anti-aje, espesyalman sou ekspresyon de jèn ki gen rapò ak telomèr ak fonksyonalite yo nan selil aje, yo te obsève. Ansanm, rezilta sa yo sijere ke CM ki sòti nan hPSC yo ka itilize kòm yon modèl inik kardyomyosit imen an vitro e ke vitamin C montre.efè anti-ajenan modèl sa a.

Mo kle:Aje. Cardiomyocyte. Selil souch pluripotan imen.Vitamin C

Klike La Pou Jwenn Konnen Cistanche Pou Anti-Aging

Entwodiksyon

Selil souch pluripotan imen(hPSCs), ki gen ladan selil souch anbriyon imen (hESCs) (Thomson et al. 1998; Oh et al. 2005a) ak selil souch pluripotent moun pwovoke (hiPSCs) (Takahashi et al. 2007), posede kapasite nan diferansye nan nenpòt nan selil yo nan kò a ki gen ladan cardiomyocytes (CMs) (Kehat et al. 2001; Mummery et al. 2003; Kim et al. 2008; Yokoo et al. 2009). hESC yo sòti nan mas selil enteryè blastocyst la (Thomson et al. 1998) ak hiPSC yo se selil souch ki sòti nan selil somatik adilt ki te repwograme nan yon eta ki sanble anbriyon (Takahashi et al. 2007). Kèlkeswa orijin yo, kit soti nan hESC oswa hiPSC, CM ki sòti nan hPSC yo espere sèvi kòm yon sous san limit nan selil pou terapi selil ki baze sou maladi kadyak ak yon modèl selilè altènatif nan selil imen pou tès depistaj dwòg kadyovaskilè, etid devlopman kè, ak eksperyans moun aje (Kim et al. 2011).

Cardiomyosit imen yo se selil prensipal estriktirèl nan kè a. Selil sa yo esansyèl pou kontraksyon kè a, yon fonksyon ki pèdi nan maladi kadyak tankou enfaktis myokad (Laflamme and Murry 2005) osi byen ke pandan pwosesis aje (Terman and Brunk 1998). Pou mennen ankèt sou efè aje a sou kardyomyosit, yo dwe obsève chanjman ki gen rapò ak laj epi yo dwe dekouvri faktè ki afekte yo. Yo konnen ti kras sou aje selil kadyak yo ak chanjman ki gen rapò ak laj yo (Terman et al. 2003) paske kadyomyosit vivan pa ka fasil jwenn nan kò imen an pou etid an vitro. Se poutèt sa, devlopman nan CM ki sòti nan hPSC ka sèvi kòm yon modèl enpòtan pou etid cardiomyocyte moun ki soti nan laboratwa a.

Selil kadyak ki sòti nan hPSC ki te pwodwi pa metòd nou te rapòte deja (Kim et al. 2011) epi ki dekri karakteristik selil kadyak ki gen laj natirèlman ki sòti nan hPSC yo. Selil kadyak ki gen laj yo te montre yon modèl bat ki pi fèb ak pi dousman ak ogmante ekspresyon galactosidase ki asosye ak senesans (SA). Anplis de sa, diminye ekspresyon jèn ki gen rapò ak aje hTR ak TRF2 ak sik selil ki kontwole jèn ki gen ladan siklin D1, siklin D2, siklin D3, ak Cdk2, ak yon akimilasyon nan lipofuscin pigman aje yo te obsève. Ekspozisyon a 100 μM nan vitamin C pou 48 èdtan ranvèse efè aje nan CMs hESC ki sòti.

Materyèl ak metòd

Kilti selil souch pluripotan imen ak diferansyasyon nan kadyomiosit SNUhES3, liy ESC imen an, te achte nan men Seoul National University (Oh et al. 2005a) ak hiPSC nan System Biosciences (SBI, Mountain View). , CA, USA). PSC imen yo te kenbe jan yo dekri deja (Oh et al. 2005b). Yo te replate hPSCs endiferansye yo sou selil kouch mitotik inaktive (STO, CRL-1503, ATCC, Manassas, VA, USA) chak 7 jou. DMEM/F12 (Invitrogen, Calsbad, CA, USA) konplete ak 20 pousan ranplasman serom knockout (KO-SR; Invitrogen), 1 pousan MEM NEAA (Invitrogen), 0.1 mM -mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO, USA) , 50 U / ml penisilin (Invitrogen), 50 ug / ml streptomycin (Invitrogen), ak 4 ng / ml debaz faktè kwasans fibroblast (bFGF; Invitrogen) te itilize kòm mwayen kilti pou hPSCs. Pou pwovoke diferansyasyon nan kardyomiosit, yo te trete hPSC ki gen 5-7- jou ak 0.25 pousan tripsin EDTA (Invitrogen) pou 5 min. Lè sa a, selil feeder detache yo te retire, epi hPSC yo te lave ak saline fosfat-tanpon (PBS). Lè sa a, 100 ng / ml nan activin A (R & D Sistèm, Minneapolis, MN, USA) ak 10 ng / ml nan BMP2 (R & D Sistèm) yo te ajoute pou 5 jou. Mwayen diferansyasyon an konsiste de RPMI 1640 (Invitrogen) complétée ak B27 (Invitrogen) (Kim et al. 2011). Pou ranplase selil diferansye yo, yo te trete 1 ml TrypLE Express (Invitrogen) epi enkube pou 5 minit nan 37 degre. Selil dissociated yo te lave ak resuspended ak RPMI 1640 (Invitrogen) complétée ak B27 (Invitrogen) ak plake.

Tretman nan vitamin C

Konsantrasyon eksperimantal asid L-ascorbic (Sigma) yo te 0, 100, ak 250 μM epi yo te trete pou 24 èdtan nan jou 11, 17, ak 23. Pou tretman 48 èdtan, yo te ajoute asid L-ascorbic nan selil nan jou 10–12, 16–18, ak 22–24.

Imunolabeling

Pou evalye lokalizasyon pwoteyin espesifik, selil yo te lave ak PBS (Sigma) epi yo te fikse ak 4 pousan paraformaldehyde (PFA; Sigma) pou 15 min nan tanperati chanm (RT). Pou anpeche lyezon ki pa espesifik, yo te ajoute solisyon 3 pousan albumin serom bovin (Sigma) epi selil yo te enkube pou 1 èdtan nan RT. Antikò prensipal yo (1:100) enkli sourit anti-Nkx2.5 (R&D Systems), lapen anti-Nkx2.5 (Abcam, Cambridge, MA, USA), chèn lou chèn kabrit anti- -myosin (anti- MHC; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), lapen anti-atrial natriuretic faktè (anti-ANF; Santa Cruz Biotechnology), ak sourit troponin I (anti-cTn I: Chemicon, Billerica, MA, USA). Yo te aplike pou 1 èdtan nan RT. Lè sa a, selil yo te lave ak PBS ak Triton X100 (PBST; Sigma) twa fwa. Antikò segondè yo, ki gen ladan Alexa Fluor 488-ki gen etikèt bourik anti-sourit ak lapen IgG, Alexa Fluor 594-ki gen etikèt bourik anti-sourit, ak kabrit ak lapen IgG (Molecular Probes, Calsbad, CA, USA) , yo te aplike pou 1 èdtan nan RT nan fè nwa a epi lave ak PBST twa fwa. Selil yo te trete ak Prolong lò anti-fennen reyaktif ak DAPI (Invitrogen) ak analize lè l sèvi avèk lazè optik mi kwoskopi (BioRad, Carlsbad, CA, USA).

Fig. 1 Reprezantasyon chematik eksperyans yo. Definisyon ak karakteristik CM ki sòti nan hPSCs, ki gen ladan hESCs ak hiPSCs, yo endike pou chak etap tanporèl. Foto reprezantatif bat ak CM ki gen laj yo enkli pou ilistrasyon. a Yon imaj reprezantatif bat CM yo. Flèch wouj la endike rejyon kontraktil la. b Mòfoloji CM ki gen laj. Kòm peryòd kilti in vitro la te pwolonje, selil différenciés yo te montre yon koulè pi fonse nan rejyon sant la ak pousantaj bat la diminye. c Sekansyal imaj k ap deplase nan bat CM yo ranje tanporèman de goch a dwat, epi tan an endike anba-gòch chak imaj an wouj.

Kantitatif RT-PCR

Yo te ekstrè RNA total nan selil yo lè l sèvi avèk Trizol (Invitrogen) dapre enstriksyon manifakti a. cDNA te sentèz soti nan 1 ug RNA lè l sèvi avèk Accute RT Premix (Bioneer, Daejeon, Kore di). Yo te fè PCR quantitative ak RotorGene 3000 (Corbett Life Science, Valencia, CA, USA) lè l sèvi avèk QuantiTectTM SYBR® Green PCR kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Pwogram anplifikasyon an konpoze de yon etap inisyal nan 95 degre pou 15 minit, ki te swiv pa 45 sik denaturasyon nan 95 degre pou 15 s pou chak sik, yon etap rkwir nan 58 degre pou 20 s, ak Lè sa a, yon etap final ekstansyon nan 72 degre pou 30 s. Tout reyaksyon yo te kouri an triple. CT te kalkile anba paramèt default RotorGene 6.0 lojisyèl (Corbett Life Science). Ekspresyon jèn yo te nòmalize nan ekspresyon GAPDH.

Analiz FACS

Yo te separe echantiyon yo nan selil sèl lè l sèvi avèk 0.25 pousan trypsin-EDTA. Selil dissociated yo te fiks ak 4 pousan PFA pou 15 min nan RT. Lè sa a, selil yo te lave ak PBS pa santrifugasyon nan 1,500 rpm pou 5 min. Antikò prensipal yo, sourit anti-Nkx2.5, ak kabrit anti-MHC yo te aplike pou 1 èdtan nan RT. Selil yo te imedyatman lave ak PBS pa santrifujasyon de fwa. Antikò segondè yo, Alexa Fluor 488-ki make bourik anti-sourit, ak Alexa Fluor 594-ki gen etikèt IgG bourik anti-kabrit yo te aplike pou 1 èdtan nan RT nan fè nwa a epi lave ak PBS pa santrifujasyon de fwa. Yo te analize echantiyon yo lè l sèvi avèk FACS Calibur™ ak FACS Aria-I (BD Biosciences, San Diego, CA, USA).

Senesans-asosye tach beta-galactosidase

Yo te retire mwayen an nan echantiyon yo epi lave ak PBS ak anpil atansyon. Lè sa a, 1 × solisyon fikse te ajoute ak enkubasyon pou 10 min nan RT. Apre rense ak PBS de fwa, yo te ajoute 1 × solisyon tach ki gen X-Gal (Intron Biotechnology, Seoul, Kore di) nan echantiyon yo epi enkube lannwit lan nan 37 degre. Apre enkubasyon, yo te retire solisyon an tach epi selil yo te lave ak PBS de fwa. Echantiyon yo te analize anba yon mikwoskòp limyè (Nikon, Tokyo, Japon).

Mikwoskopi elektwonik transmisyon

Echantiyon yo te lave ak PBS epi yo te fikse ak 2.5 pousan glutaraldehyde (Sigma) pou 2 0 minit nan RT. Lè sa a, selil yo te fikse ak 1 pousan osmyòm tetoksid (Sigma) konplete ak 0.14 M sikwoz (Sigma) pou 10 min nan 4 degre. Selil enfiltre ak résine epoksidik yo te transfere nan kapsil gwo bout bwa pou polymerization. Seksyon ultra-mens yo te jwenn lè l sèvi avèk yon ultramicrotome (MT-6000; DuPont Instruments-Sorvall Biomedical Div., Wilmington, DE, USA), ak echantiyon yo te obsève anba yon mikwoskòp elèktron transmisyon (JEM{-1400; JEOL). Ltd., Tokyo, Japon)

Tès TRAP Yo te prepare echantiyon pou tès TRAP la lè l sèvi avèk Twous Deteksyon Telomerase TRAPeze® (Millipore, Bill erica, MA, USA), dapre enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, chak etap nan selil yo te lysed lè l sèvi avèk lysis tanpon ak santrifuge pou 20 minit nan 4 degre. Sipènatant kolekte a te itilize kòm yon modèl pou anplifikasyon PCR. Pwogram anplifikasyon PCR la konsiste de denaturasyon nan 94 degre pou 30 s, annealing nan 59 degre pou 60 s, ak ekstansyon nan 72 degre pou 60 s, pou 60 sik. Pwodwi PCR yo te kouri nan paj ki pa denaturasyon epi yo te visualize lè l sèvi avèk SYBR green I (Sigma) tach.

Fig. 2 Evalyasyon karakteristik kadyak nan CM ki sòti nan hPSC.

Ekspresyon jèn kadyak espesifik yo te evalye nan nivo mRNA ak pwoteyin. Chak etap nan diferansyasyon nan hPSC yo demontre ekspresyon de jèn kadyak kadyak kritik yo. Yon Immunostaining nan CM ki sòti nan hPSC. Ekspresyon jèn espesifik kadyak nan CM ki sòti nan hESC (a–e) ak CM ki sòti nan hiPSC (f–j) nan chak etap. Faktè transkripsyon kadyak Nkx2.5, pwoteyin pou kontraksyon troponin kadyak I (cTnI), pwoteyin estriktirèl MHC, ak pwoteyin kardyomyosit ki sekrete ANF yo te imunolabeled ak evalye lè l sèvi avèk mikwoskòp optik lazè. Imaj yo te kaptire nan 200 × agrandisman (inserts) ak imaj elaji nan 800 × agrandisman yo reprezante. a, f Etap 1 (jou 12), Nkx2.5 (vèt), cTn I (wouj); b, g etap 2 (jou 18), Nkx2.5 (vèt), MHC (wouj); d, mwen etap 3 (jou 24), Nkx2.5 (vèt), ANF (wouj). Imaj replated hESC ki sòti (c, e) ak CMs ki sòti nan hiPSC (h, j) yo te kaptire nan 200 × agrandisman (inserts) ak imaj elaji nan 1,200 × agrandisman yo reprezante. c, h Etap 2 (jou 18), Nkx2.5 (vèt), MHC (wouj); e, j etap 3 (jou 24), Nkx2.5 (vèt), ANF (wouj). B Ekspresyon jèn kadyak espesifik nan CM ki sòti nan hPSC lè l sèvi avèk qRT-PCR. Nivo ekspresyon an te nòmalize nan GAPDH epi kouri an triple. C yo te evalye popilasyon pozitif pou Nkx2.5 ak MHC. Plis pase 60 pousan selil différenciés te pozitif pou Nkx2.5 ak MHC jan analiz FACS te mezire.

JC{{0}} tach Yo te ajoute medya ki fèk prepare nan echantiyon yo epi yo te ajoute 10 ug/ml solisyon JC-1 (Invitrogen). Yon enkubasyon pou 10 minit nan 4 degre swiv, ak selil yo te Lè sa a, lave ak medya kilti. Fluoresans selil ki make yo te obsève lè l sèvi avèk mikwoskospi fliyoresan (Nikon, Tokyo, Japon) ak mikwoskospi konfokal lazè optik. Nan preparasyon pou analiz fliyoresan, selil ki tache JC-1 yo te disoye ak 0.25 pousan trypsin-EDTA. Selil dissociated yo te resuspende nan PBS ak analize lè l sèvi avèk FACS CaliburTM (BD Biosciences).

Analiz estatistik

Done yo te analize ak yon sèl-fason ANOVA, epi yo te fè yon konparezon posthoc nan mwayen pa tès Duncan a. Tout eksperyans yo te fèt an triple. Yo te aksepte siyifikasyon pou yon valè p ki mwens pase 0.05 (p<0.05). Calculations were conducted with the Statistical Package for the Social Sciences for Windows (version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Rezilta yo

diferansyasyon hPSC nan kadyomiosit

hESCs ak hiPSCs diferansyasyon te pwovoke lè l sèvi avèk metòd nou te dekri deja (Kim et al. 2011). Konplo eksperimantal la reprezante nan Fig. 1. Nou klasifye selil diferansye yo an twa etap dapre peryòd kilti vitro yo: jou 12 (etap 1), jou 18 (etap 2), ak jou 24 (etap 3). Imaj fonksyonèl, hESC ki sòti CM (Fig. 1a) ak CM ki gen laj (Fig. 1b) te montre mòfoloji tipik nan CMs différenciés ak chanjman ki gen rapò ak laj yo. Fonksyonèl cardiomyo sit te montre bat regilye nan vitro ak imaj sekansyèl an tan reyèl nan bat yo te akeri (Fig. 1c).

Karakterizasyon CM ki sòti nan hPSC

Pou konfime idantite selil ki sòti nan hPSC, nou evalye ekspresyon faktè transkripsyon espesifik kadyak ak jèn estriktirèl nan chak etap diferansyasyon. Ekspresyon nan Nkx2.5, faktè enpòtan transkripsyon kadyak la, yo te obsève pandan tout peryòd diferansyasyon an nan tou de hESC- (Fig. 2A a, b, ak d) ak hiPSC ki sòti CMs (Fig. 2A f, g, ak i). Pwoteyin kadyak-espesifik la, troponin kadyak (Tn) I, ki kontwole kontraksyon selil kadyak yo, te eksprime tou nan CM ki sòti nan hESC ak hiPSC nan jou 12 (Fig. 2A a ak f); sepandan, ekspresyon te pi wo nan hESC-sòti CMs (Fig. 2A a). Jèn estriktirèl kadyak la, MHC, te eksprime nan selil jou 18 (Fig. 2A b ak g), ak ANF, yon faktè andokrin sekrete pa kardyomiosit frelikè, te eksprime trè nan CM ki sòti nan hPSC nan jou 24 (Fig. 2A d ak mwen).

Pou konfime ekspresyon de makè espesifik nan yon sèl CMs, chak etap CM yo te replate ak kiltive. Nikleyè NKx2.5 (vèt) ak cytoplasmic MHC ak ANF (wouj) ekspresyon yo te obsève nan replated CMs. (Fig. 2A c, e, h, ak j). Ekspresyon jèn yo te evalye pa PCR transkripsyon ranvèse quantitative (qRT-PCR). Selil diferansye ki soti nan tou de hESCs ak hiPSCs eksprime faktè transkripsyon kadyak Nkx2.5 ak Tbx5 (Fig. 2B), ak nivo ekspresyon yo te pi wo nan jou 18 nan CMs hESC ki sòti. Ekspresyon nan MHC diminye kòm diferansyasyon pwogrese. Kontrèman ak CM ki sòti nan hESC, CM ki sòti nan hiPSC eksprime jèn kadyak-espesifik, men ekspresyon yo pa t ogmante osi dramatikman jan li te fè nan CM ki sòti nan hESC.

Fig. 3 Fenomèn aje nan CM ki sòti nan hPSC. Divès tès yo te itilize pou evalyasyon fenomèn ki gen rapò ak aje. Yo te fè yon tach SA- -gal nan chak etap nan CM ki sòti nan hPSC. Selil beta-gal-tache yo te obsève anba mikwoskòp la, ak ti (40 × agrandisman, inset) ak imaj elaji (100 × agrandisman) yo reprezante: a–d hESC-derived CMs; e–h CM ki sòti nan hiPSC. a, e Beta-gal-tache CM nan yon plak antye; b, f etap 1 (jou 12); c, g etap 2 (jou 18); d, h etap 3 (jou 24); i te konte kantite selil ki tache SA- -gal anba yon mikwoskòp. Jan sa endike nan ba yo trase, kantite selil pozitivman tache ogmante kòm diferansyasyon in vitro pwogrese ak nimewo sa a ogmante siyifikativman nan etap 2 (jou 18) ak etap 3 (jou 24). B analiz ultrastruktural nan CM ki gen laj lè l sèvi avèk mikwoskospi elektwonik transmisyon. Obsèvasyon nan lipofuscin, yon pigman aje, nan selil ki gen laj nan chak etap yo te fèt. Asterisk jòn endike prezans pigman. yon CM ki sòti nan hESC nan jou 18 (etap 2) te montre presipitasyon endispoze nan pigman aje; b hESC-sòti CM nan jou 24 (etap 3) te montre akimile tach pigman lipofuscin; c CM ki sòti nan hiPSC nan jou 18 (etap 2) te montre relativman abondan ti tach lipofuscin; d hiPSC ki sòti CM nan jou 24 (etap 3) te montre pi gwo, akimile pigmantasyon lipofuscin. C Ekspresyon jèn ki gen rapò ak aje nan CM ki sòti nan hPSC mezire pa qRT-PCR. Ekspresyon hTR, yon jèn ki kode konpozan RNA telomeraz yo, diminye nan jou 18 ak 24 CM ki sòti nan hESC. Ekspresyon TRF2 tou diminye nan jou 18 ak 24 CM. Modèl ekspresyon hTR ak TRF2 nan CM ki sòti nan hiPSC diferan de CM ki sòti nan hESC, paske yo pa t demontre siyifikativman diminye ekspresyon nan etap 2 ak 3. D Ekspresyon jèn ki gen rapò ak sik selil nan CM ki sòti nan hPSC mezire pa qRT PCR. . Ekspresyon cyclin D1, cyclin D2, cyclin D3, ak Cdk2 diminye ak chak etap pwogrese nan diferansyasyon. Ekspresyon cyclin D3 ak Cdk2 diminye kòm diferansyasyon te kontinye nan tou de CM yo

Analiz FACS mezire omojèn popilasyon selil différenciés.

Nan jou 24 nan CMs hESC ki sòti, Nkx2.5-populasyon pozitif la te gen 60.5 pousan nan selil yo ak selil MHC-pozitif te konte pou 43.7 pousan (Fig. 2C). Selil makè-pozitif kadyak nan CM ki sòti nan hiPSC te reprezante 50 pousan nan popilasyon an (done yo pa montre). Nou izole ak replated rejyon an omojèn nan selil différenciés ak trete yo pou plis analiz. Rezilta sa yo demontre ke selil différenciés de hPSC yo genyen karakteristik kadyak, epi pwouve ke metòd diferansyasyon gwoup nou an te dekri deja ka lajman aplike pou jenerasyon cardiomyocytes lè l sèvi avèk plizyè liy hPSC.

Fenomèn aje nan CM ki sòti nan hPSC

Pou elimine kondisyon ki pa pi bon ki ka enfliyanse pwosesis aje a, nou konfime ke valè pH mwayen an te varye ant 7.23 ak 7.41 nan tout etap kilti kèlkeswa ajoute vitamin C. Diferansye hPSC ki sòti nan CM yo te demontre yon mòfoloji ki pa transparan ki fè nwa (Fig. 1b). Pou evalye ak quantifier fenomèn aje a, nou te fè tès beta-galactosidase (SA- -gal) ki asosye ak senesans pou chak etap diferansyasyon (Fig. 3A a ak e). Jan yo montre nan Fig. 3A, tou de selil ki sòti nan hPSC yo te pozitivman tache. Selil 12 jou yo te tache ak -gal nan tou de CM ki sòti nan hPSC (Fig. 3A b ak f). Jou 24 selil différenciés (Fig. 3A d ak h) yo te fòtman tache konpare ak jou 12 ak 18 selil (Fig. 3A c ak g). Nimewo a nan selil -gal-tache ogmante nan korelasyon ak jou yo nan diferansyasyon pou tou de hESC- ak hiPSC-sòti CMs (Fig. 3A i).

Lipofuscin pigman ki byen koni ki gen rapò ak aje yo te obsève nan CM ki sòti nan hESC ak hiPSC (Fig. 3B a-d). Lipofuscin te diman obsève nan jou 18 hESC ki sòti nan CM; sepandan, nan jou 24 hESC-sòti CM, lipofuscin akimile te byen klè obsève (Fig. 3B b). Nan CM ki sòti nan hiPSC, lipofuscin te obsève nan yon etap pi bonè (jou 18, Fig. 3B c) pase nan CM ki sòti nan hESC (Fig. 3B a) e li te plis pwononse nan jou 24 CMs (Fig. 3B d). Rezilta sa yo demontre akimilasyon ki depann de tan nan pigman makè aje nan CM ki sòti nan hPSC ak akimilasyon relativman pi bonè li yo nan CM ki sòti nan hiPSC. Ekspresyon jèn ki gen rapò ak aje hTR ak TRF2 te evalye (figi 3C). hTR, ki kode eleman RNA telomeraz, te montre diminye ekspresyon nan CM ki sòti nan hESC. Sepandan, ekspresyon hTR nan CM ki sòti nan hiPSC pa t diminye anpil nan kilti. Yon lòt faktè enpòtan nan senesans, TRF2, ki responsab pou pwoteksyon an nan telomè imen, demontre downregulation nan ki gen laj hESC ki sòti CM; sepandan, pa gen okenn diferans enpòtan yo te obsève ant etap nan diferansyasyon nan CMs ki sòti nan hiPSC. Aje nan CM ki sòti nan hPSC te akonpaye pa downregulation nan jèn ki gen rapò ak sik selil yo. Ekspresyon cyclin D1, cyclin D2, cyclin D3, ak Cdk2 diminye nan hESC- ak hiPSC-sòti CMs ak chak etap siksesif (Fig. 3D).

Efè anti-aje vitamin C sou CM ki sòti nan hESC

Depi fenomèn aje natirèl la te obsève pi klè nan CM ki sòti nan hESC, selil sa yo te sèvi kòm modèl nou an pou plis etid. Nou te ajoute vitamin C ki byen koni faktè anti-aje pou evalye efè li sou aje. Pou evalye efè li yo, yo te ajoute vitamin C nan 0, 100, ak 250 μM nan jou 12, 18, ak 24 hESC ki sòti nan CM. Tretman Vitamin C nan 100 μM te pwouve yo dwe konsantrasyon ki pi efikas, ak dire ki pi efikas nan tretman an te 48 èdtan. Vitamin C-trete CMs (Fig. 4A c ak d) te montre relativman pi ba entansite nan SA - -gal tach lè yo konpare ak selil ki pa trete (CTL) (Fig. 4A a ak b). Efè vitamin C te konfime tou nan jou 18 ak 24 hESC ki sòti nan CM kòm kantite tach ki gen SA - -gal-pozitif tou diminye nan selil sa yo (Fig. 4A e).

Nou analize tou efè vitamin C sou aktivite telomeraz ak ekspresyon jèn ki gen rapò ak telomeraz. Aktivite Telo merase te ranvèse nan gwoup la vitamin C-trete, ak rezilta sa a te pi aparan nan pita-etap selil différenciés (Fig. 4B a). Nou menm tou nou evalye ekspresyon hTR, hTERT, ak TRF2 (Fig. 4B b). Nan jou 12 selil, ekspresyon hTR pa t 'siyifikativman ogmante apre tretman vitamin C; sepandan, ekspresyon an te ogmante nan jou 18 ak 24 hESC ki sòti nan CM. Ekspresyon hTERT ak TRF2 te ogmante tou nan CM ki sòti nan hESC nan twa etap diferan. Rezilta sa yo endike ke efè a nan vitamin C te pi aparan nan selil ki gen laj e li te nan peryòd kilti vitro depandan.

Chanjman nan fonksyonalite nan CM ki sòti nan hESC ak efè vitamin C

Pou evalye fonksyonalite CM ki sòti nan hESC ak chanjman yo pandan aje, nou tache selil yo ak lank mitokondriyo manbràn potansyèl espesifik JC -1. Koulè JC-1 anjeneral chanje soti nan wouj ak vèt selon potansyèl manbràn mitokondriyo redwi. Nou kontwole fliyoresans hESC ki sòti nan CM pou chanjman kromatik sa a (figi 5A). Popilasyon selil vèt-wouj-pozitif la te gen rapò ak rezilta mikwoskopi nou yo. Nan jou 24, hESC ki sòti nan CM yo te montre potansyèl manbràn redwi jan sa endike nan fliyoresans vèt (Fig. 5A a), ak potansyèl manbràn yo ogmante nan gwoup la vitamin C-trete kòm evidans ogmante tach wouj. Chanjman sa a nan potansyèl manbràn te enpòtan nan 100 μM, 48 h-trete gwoup yo (figi 5A c), lè yo konpare ak 100 μM, 24 h-trete gwoup la (figi 5A b). Tretman nan vitamin C amelyore fliyoresans wouj, kòm pousantaj selil pozitif nan gwoup trete a te varye ant 30 a 40 pousan (Fig. 5B b ak c), yon pwopòsyon siyifikativman pi wo an konparezon ak selil ki pa trete (Fig. 5B a) . Modèl bat CM ki sòti nan hESC te afekte tou pa vitamin C. Anjeneral, nan kilti, CM ki sòti nan hESC montre yon diminisyon nan bat pou chak minit (bpm) pandan y ap laj. Tretman ak vitamin C ogmante bpm nan CM ki sòti nan hESC (Fig. 5C). Epitou, dire bat la te pi long nan CM yo trete ak vitamin C.

Fig. 4 Efè anti-aje vitamin C sou CM ki sòti nan hESC. Pou ranvèse fenomèn aje nan hESC ki sòti nan CM, yo te ajoute vitamin C nan 100 ak 250 μM pou 24 ak 48 èdtan. SA - -gal tach nan jou 24 hESC sòti CMs apre tretman nan vitamin C (100 μM). Kantite selil ki tache SA- -gal ak entansite tach yo te tou de redwi anpil. a, b -gal tache, hESC-derive CMs (150 × agrandisman); c, d -gal-tache, hESC-derivé CMs apre 24 h vitamin C tretman (150 × agrandisman); e dapre mezi FACS, kantite selil tache siyifikativman diminye apre tretman vitamin C. B Aktivite telomeraz ak ekspresyon jèn ki gen rapò ak telomè hTR ak hTERT nan chak etap diferansyasyon CM ki sòti nan hESC. yon aktivite Telomerase nan CM ki sòti nan hESC. Pwodwi a nan chak gwoup te sekans chaje. Liy gòch la kenbe kontwòl ki pa trete ak liy dwat la kenbe gwoup yo respektif vitamin C 100 μM 48 h-trete. b Ekspresyon jèn ki gen rapò ak telomeraz, hTR ak hTERT, ak TRF2 yo te analize pou chak etap nan CM ki sòti nan hESC. Ekspresyon jèn ant gwoup kontwòl la ak gwoup trete vitamin C yo konpare

Fig. 5 Chanjman nan fonksyonalite nan CM ki sòti nan hESC. Anplis de sa nan vitamin C amelyore fonksyon an mitokondriyo ak bat frekans nan hESC ki sòti nan laj CMs. Yon JC-1, ki montre akimilasyon depandan potansyèl nan mitokondri, yo te itilize kòm yon endikatè nan potansyèl mito kondriyo. Tretman Vitamin C amelyore siyifikativman JC-1 fliyoresans wouj (polarizasyon, gwo potansyèl manbràn). Kontrèman, JC -1 fliyoresans vèt (depolarizasyon, potansyèl manbràn ki ba) te redwi nan CM ki sòti nan hESC nan jou 24 lè yo te trete ak vitamin C. yon Kontwòl; b vitamin C 100 μM, 24 h; c vitamin C 100 μM, 48 h. B Popilasyon JC-1 selil pozitif. JC -1 tache, CM ki sòti nan hESC nan jou 24 yo te disosye nan selil sèl epi imedyatman analize lè l sèvi avèk sitometri koule. Popilasyon wouj fluoresans pozitif la te ogmante lè yo te trete ak vitamin C. a Kontwòl; b vitamin C 100 μM, 24 h; c vitamin C 100 μM, 48 h. C Efè vitamin C sou bat frekans hESC sòti CM. CM trete yo te montre yon pi piti rediksyon nan frekans bat yo konpare ak kontwòl la