Prensip anti-enflamatwa soti nan zegwi yo nan Pinus Taiwanensis Hayata ak nan etid silico sou efè potansyèl anti-aje yo.

Résumé:Pinuste zegwi se trè popilè nan peyi lès tankou Japon, Larisi, Kore di, ak Lachin. Pine zegwi te reklame ke yo gen siyifikatifefè anti-aje,men pa gen okenn prèv klè ki sipòte sa jiska kounye a. Nan etid prezan an, kenz konpoze ki pa dekri (1–5), osi byen ke swasanndis konpoze li te ye, yo te pirifye ak karakterize nan fraksyon nan byoaktif nan ekstrè metanòl nanP. taiwanensiszegwi.

Pi bon anti-aje remèd fèy pwodwi Cistanche

Pifò nan izole yo te egzamine pou yoanti-enflamatwa byoaktivitepa modèl netrofil selilè ak sis konpoze (45, 47, 48, 49, 50, epi51) ekspoze aanpèchman enpòtan sou jenerasyon anion superoksidak elastase lage ak IC50values ​​sòti nan 3.3± 0.9 rive 8.3± 0.8 µM. Sa yoengredyan anti-enflamatwayo te sibi docking informatique pou evalye afinite obligatwa yo sou reseptè ghrelin, ki te jwe yon wòl enpòtan nan reglemante metabolis, akefè anti-aje. Konpoze49, 50, epi51 te fòme yon konplèks ki estab ak reseptè ghrelin atravè lyezon idwojèn ak diferan kalite entèraksyon.

1. Entwodiksyon

Pinusgenus (Pinaceae), ki gen plis pase 100 espès ak sitou distribye nan Emisfè Nò a, se jeneralman pye bwa ki toujou vèt pandan ke kèk yo se touf.1]. Bwa Pine se limyè ak souvan itilize pou mèb. Sepandan, plizyè efè famasi zegwi sou lans pen yo te anrejistre nan ansyen liv medikaman tradisyonèl Chinwa yo. Nan "The Divine Husbandman's Herbal Foundation Canon", zegwi Pine ankouraje kwasans cheve, pwolonje lavi, ak swaf dlo. Nan "Taiping Shenghui Fang", li te anrejistre ke zegwi Pine ta ka kwit ak alkòl ak parèt yon efè anti-aje. Sèjousi, zegwi pine yo trete kòm te epi yo popilè nan pwovens Lazi. Nan Kore di, elektè yo nan laP. densiflorazegwi te osi byen ke liantioksidan ak byoaktivite anti-bakteri yo te envestige anpil [2,3]. Depi kòmansman dènye syèk lan, yo te idantifye plis pase sètsan konpozePinus zegwi. Pifò nan literati a rapòte yo gen rapò ak lwil esansyèl nanP. densiflflora[4,5], P. halepensis[6,7], P. nigra[4,8], epiP. sylvestris[4,9]. Konpozan yo karakterize nanPinuszegwi yo se sitou benzenoid, diterpenoid, flavonoid, lignan, monoterpenoid, ak sesquiterpenoids.10]. Zegwi yo nanP. densifloraepiP. morrisonicolayo te rapòte pou byoaktivite antioksidan yo [11–14]. Anplis de sa, ekstrè acetat etil nan zegwi nanP. morrisonicolainibit ekspresyon an pwoteyin ak mRNA nan NO akiNOS nan makrofaj RAW 264.7 ki te pwovoke LPS, ki montre yon byoaktivite enpòtan anti-enflamatwa [13]. Ekstrè nan flikid superkritik nanP. densiflorazegwi parèt efè inhibition sou LPS-induit NO pwodiksyon pa downregulating ekspresyon deiNOS, epi redwi ekspresyon IL-6 ak IL-1 ak aktivasyon pwoteyin STAT1 ak STAT3 nan macrophages pwovoke pa LPS [15]. Ekstrè etanòl la nanP. thunbergiizegwi te montre yon efè anti-enflamatwa siyifikatif nan makrofaj ak siprime èdèm zòrèy asid arachidonik pwovoke ak inibit aktivite anzimatik myeloperoxidase.16]. Anplis, fèrmante aP. morrisonicolazegwi yo te montre ekselan antioksidan yo ak anti-enflamatwa byoaktivite pa modulation NF-κB chemen siyal [17]. 

Ghrelin se yon òmòn peptide ki gen vennwit asid amine e li te dekouvwi orijinal nan lestomak la.18,19]. Li se yon ligand andojèn pou secretagogue òmòn kwasans (GHSR), ki se yon manm nan -branch nan klas A GPCRs (G Protein Coupled Receptors) [18,19]. Ghrelin se sèl òmòn peptide ki lakòz grangou ankouraje apeti.20]. Anpil etid te sijere ke ghrelin jwe yon wòl enpòtan nan reglemante metabolis, balans enèji, memwa, kadyovaskilè, ak fonksyon gastwoentestinal nan kò imen an.21–23]. Ghrelin patisipe tou nan divès mekanis fizyolojik ak fizyolojik nan kò imen an tankou aje.24,25], epi li ka gen rapò ak aktivite anti-enflamatwa [26,27]. Nan 2014, gwoup nou an te premye idantifye flavonoid tetra glikozid acylated flavonoid yo te rele teaghrelins, epi yo te demontre aktivite pwomosyon yo nan liberasyon òmòn kwasans (GH).28]. De lòt konpoze ki sanble yo te pirifye nan Shy-jih-chuen oolong te epi yo te verifye byoaktivite yo sou reseptè ghrelin la tou.29]. Kat teaghrelin yo pwovoke grangou atravè menm chemen an regilasyon kòm ghrelin. Pa limite a te, konpoze ak estrikti ki sanble oswa byoaktivite ak teaghrelin yo te eksplore tou nanPolygonum multiflflorum(Li houwu) [30], Jenkgo biloba[31], Morus alba[32], epiCistanche tubulosa [33]. Rezilta sa yo sipòte nou nan rechèch la pou prensip natirèl anti-aje pa tès depistaj te ghrelin-tankou konpoze ki genyen efè anti-enflamatwa. Anplis dirèkteman fè aktivite pwomosyon nan liberasyon òmòn kwasans nan modèl selilè, modèl molekilè nan kèk konpoze potansyèl ta pi efikas nan eksplore kandida posib.34]. Metòd enfòmatik yo te aplike nan devlopman ak evalyasyon ipotèz famasi yo. Docking molekilè se youn nan teknik ki pi souvan itilize epi li prevwa konfòmasyon ak afinite ligand ki lye nan pòch aktif la ak gwo presizyon.35,36]. Metòd Docking efektivman chèche espas ki gen gwo dimansyon pou entèraksyon posib epi sèvi ak yon fonksyon nòt ki byen klase kandida yo [37]. 

Nan 2018, twa konpoze yo te pirifye soti nan zegwi yo nanP. morrisonicolaak ekspoze siyifikatif aktivite vasorelaxant, ak nan mitan elektè sa yo, youn te rapòte ak yon estrikti te ghrelin ki tankou [38]. Nan Taiwan,P. taiwanensiszegwi yo anjeneral seche ak kwit ak Lè sa a, trete kòm yon te akòz byoaktivite pi popilè yo.P. taiwanensisHayata se youn nan espès natif natal ak andemik nan Taiwan. Li rele tou Taiwan wouj Pine, oswa Huangshan Pine. Gen de zegwi nan yon fasik ki gen 8-11 cm nan longè ak yon ti kras rèd ak dwat, epi li ap grandi atravè tout zile a soti nan altitid ba rive segondè, epi li souvan fòme yon forè.39]. Nan yon egzamen preliminè, kouch acetate etil nan ekstrè metanol nanP. taiwanensiszegwi parèt yon anpèchman enpòtan sou jenerasyon anion superoksid ak lage elastase ak IC50 valè 0.8± {{0}}.2 ak 1.0± 0.1 µg/mL, respektivman (Tablo S1). Se poutèt sa, nan etid la prezan, eleman yo byoaktif nanP. taiwanensiszegwi yo te envestige ak konpoze yo pirifye yo te evalye pou anti-enflamatwa yo byoaktivite sou yon modèl netrofil selilè. Anplis de sa, izole yo soti nanP. taiwanensiszegwi ak byoaktivite anti-enflamatwa yo te sibi debakadè informatique akenvestige pou entèraksyon yo ak reseptè ghrelin la.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Pwosedi Jeneral Eksperimantal

Hitachi U-2001 UV/V se yon espektromètr iltravyolèt (UV). LaYo te egzamine espèk enfrawouj (IR) ak yon espektrofotomèt Jasco FT/IR{0}}.1H-, 13C-, epi yo te anrejistre spectre sonorite mayetik nikleyè (NMR) 2D sou yon Bruker AV-400espektwomèt RMN. Chanjman chimik yo montre nanδ valè (ppm) ak tetramethylsilanekòm yon estanda entèn. LaδH epiδC valè yo te pou chanjman chimik siyal yo,respektivman. High-rezolisyon electrospray ionizasyon mas spectrométrie (HR-ESI-MS) tefèt ak yon espektwomèt JEOL JMS-700 (opere nan mòd negatif-ion).

2.2. Materyèl Plant

Zegwi yo nanP. taiwanensisyo te kolekte nan Puli, Nantou, Taiwan ak idantifyepa Pwofesè Sheng-Yang Wang (Depatman Forestry, National Chung-Hsing University,Taichung, Taiwan). Yo te depoze echantiyon bon an (PCKuo_2016003) nan herbar laium nan Lekòl Famasi, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan.

2.3. Ekstraksyon ak Izolasyon

2.4. Done Spectral ak Fizik nan 1–5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -Dihydroxy-70 -(4-idwoksi-3-metoksifenil)propan-80 -yloxy]-2-asid idroksibenzoik (2)siwo san koulè; [ ]25 D plis 5.3 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(logε) 284 (3.59), 253 (3.80) nm; ECD (c 3.51 × 10−4 M, MeOH)λmax(∆ε) 248 (plis 1.33), 224 (plis 1.03),214(plis 1.10) nm; IR (pwòp)νmax3425% 2c 2927, 1541, 1384, 1271 cm−1;1H ak13C RMN; HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− kalkile pou C17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-Asid Hydroxyagathic (3)

poud san koulè; mp: 263◦C (desanm); [ ]25 D plis 30.8 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(logε) 225 (sh) (3.83) nm; IR (pwòp)νmax3450% 2c 2937, 1648% 2c 1252 cm−1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) δ 0.63 (3H, s, CH3-20), 1.09 (1H, ddd,J = 13.6, 13.6, 3.6 Hz, H-3a), 1.21 (3H, s, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H{{0}b)% 2c 2.08 (3H, s, CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, jj,J = 9.2, 2.8 Hz, H-12), 4.53 (1H, s, H-17a), 4.91 (1H, s, H-17b), 5.88 (1H, br s, H-14);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 13.5 (CH3-20), 14,9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C-19); HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− kalkile pou C20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Isopropyl-3-oxocyclohex-1-ene-1-carboxylic asid (4)

Tabular san koulè kristal; mp: 235◦C (desanm); [ ]25 D plis 28.6 (c 0.3, MeOH); UV (MeOH)λmax(logε) 237 (sh) (3.40) nm; IR (pwòp)νmax3456% 2c 2925, 1635, 1395 cm-1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) 0.88 (3H, d,J = 6.8 Hz, CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2.02 (1H, m, H-4b), 2.09 (1H, m, H-5), 2.31 (1H, hept,J = 6.8 Hz, H-8), 2.50 (1H, dddd,J = 19.2, 9.2, 4.8, 2.4 Hz, H-6a), 2.70 (1H, dddd,J = 19.2, 5.2, 5.2, 1.2 Hz, H-6b), 6.32 (1H, dd,J = 2.4, 1.2 Hz, H-2);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6), 27.1 (C-8), 53.7 (C{-5), 128.7 (C-2), 160.6 (C{-1), 174.8 (C-7), 205.7 (C{-3); HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− kalkile pou C10H13O3, 181.0865).

2.4.5. Asid Styraxinolic (5)

siwo san koulè; UV (MeOH)λmax(logε) 308 (2.89), 237 (sh) (3.37), 222 (sh) (3.70) nm;IR (pwòp)νmax3421% 2c 2926, 1572, 1395, 1268 cm-1;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) 1.82 (2H, tt,J {{0}}.0, 6.8 Hz, H-8), 2.61 (2H, t,J {{0}}.0 Hz, H-7), 3.56 (2H, t,J = 6.8 Hz, H-9), 3.83 (3H, s, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 7.31 (1H, d,J = 2.4 Hz, H-6);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ 32.7 (C-7), 35.6 (C{-8), 56.6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6), 131.9 (C-5), 149.2 (C{-3), 150.7 (C{-2), 176.2 (C{-10); HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−kalkile pou C11H13O5, 225.0763).

2.5. Egzamen Bioaktivite Anti-enflamatwa

2.5.1. Preparasyon netrofil imen

Etid la te fèt ak apwobasyon Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl Chang Gung Memorial Hospital (IRB No. 201800369A3). Yo te pran echantiyon san nan men donatè moun ki an sante (20 a 30 ane), epi yo te izole ak pirifye netrofil yo dapre pwotokòl yo te dekri anvan [1].40]. 

2.5.2. Jenerasyon anion superoksid

Mezi Egzamen pou mezire jenerasyon anion superoksid te baze sou rediksyon SOD-enibit nan ferricytochrome.c jan sa dekri deja [40].

2.5.3. Elastase Release Assay

Degranulasyon granules azurofil yo te detèmine lè yo mezire liberasyon elastase jan sa te dekri anvan an.40]. 

2.5.4. Analiz Estatistik Rezilta yo eksprime kòm mwayen± erè estanda nan mwayen an (SEM). Kalkil 50 pousan konsantrasyon inhibitor (IC50) te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl PHARM/PCS v.4.2. Konparezon estatistik yo te fè ant gwoup yo lè l sèvi avèk Elèv lat-tès. Valè nanp < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Etid debakabl molekilè

Laan silicoevalyasyon te fèt sou lojisyèl AutoDock Vina [41]. Yo te karakterize estrikti kristal reseptè ghrelin la [42], ak yon . Fichye PDB te telechaje nan Databank Pwoteyin (PDB ID: 6KO5). Estrikti 3D ligand yo te konstwi nan pwogram Chem3D. Sipleman idwojèn, mezi chaj Gasteiger pou atòm pwoteyin, ak seleksyon torsion fleksib pou ligand yo te fèt. pa AutodockTools (ADT ver. 1.5.6). Gwosè kadriyaj la fèt nan 18.5 Å× 18.5 Å × 18.5 Å ak yon sant kadriyaj nan dimansyon (x, y, ak z, respektivman): 9.7, -19.2, 14.6 te detèmine. Enèji afinite obligatwa yo te bay kòm nòt debakadè epi yo montre an kcal/mol. Pi bon entèraksyon an te konsidere kòm sèlman tèt ki fè nòt poze. Vizyalizasyon pi bon entèraksyon debakadè yo te analize nan kliyan Biovia Discovery Studio 2020 [43].