Antioksidan ak potansyèl anti-aje nan yon fòmilasyon peptide (Gal2-Pep) konjige ak asid galik Ⅱ

3. Rezilta ak diskisyon

3.1. Sentèz ak konjigezon asid galik ak peptide

Peptid sentèz TPPTTP, galloyl-TPPTTP (Gal-Pep), ak Gal2-Pep yo te jwenn ak pirifye lè l sèvi avèk semi-preparatif RP-HPLC. Fig. 1a ak Scheme 1 montre estrateji konjigezon asid galik ak KTPPTTP kòm Gal2-Pep. Nan metòd SPPS la, enpurte yo pwodwi pandan sentèz peptide anjeneral gen ladan peptides bò-reyaji, gwoup pwoteksyon asid amine, ak solvang yo itilize pou sentèz ak pirifikasyon. Se HOBt ki itilize nan sentèz peptide yo li te ye pou anpeche racemization ak amelyore efikasite nan sentèz peptide.17–19 Yo nan lòd yo retire gwoup ki pwoteje asid amine ak solvang yo itilize pou sentèz, nou te fè lave plizyè fwa lè l sèvi avèk solvang tankou DMF ak DCM pandan pwosesis sentèz peptide. Menm apre dènye etap lave a, enpurte ki gen ladan gwoup ki pwoteje asid amine yo toujou prezan nan kantite tras. Pou satisfè pite peptide ki gen plis pase 90 pousan plizyè chèchè rapòte, yo te fè HPLC semi-prep 20-22 kòm yon etap polisaj pou jwenn peptide final la nan pite 99.2 pousan kòm rezilta analiz HPLC (gade Fig. S1†). Yo te analize pwodwi peptide pirifye a lè l sèvi avèk Q-TOF pou rekonfime sentèz siksè yo (figi 1b-d).

KSL11

Klike la a pou w jwenn plis enfòmasyon sou Cistanche Treat Anti-Aging

3.2. Esay viabilite selil yo

Pou mennen ankèt sou sitotoksisite peptides sentèz yo, yo te trete HaCaT, ak selil fibroblast imen po ak divès konsantrasyon GA, TPPTTP, Gal-Pep, ak Gal2-Pep.pou 24 èdtan epi yo analize avèk tès CCK-8. Se te konfirmed sapeptides sentèz yo pa te gen okenn efè toksiksou selil trete yo,ak viabilite selil omwen 88 pousan pou tout echantiyon ak tout lakonsantrasyon teste (Fig. 2a ak b), ki endike ke TPPTTP,Gal–Pep, ak Gal2–Pep se apwopriye pou itilize nan aplikasyon kosmetikkasyon. Anplis de sa, li te konfipa MTT, LDH, ak Griessesè reyaktif ke apeptide nal pa te lakòz toksisite nan HAak F ak nanflrepons enflamatwa nan kri 264.7. (figi S2–S4†).

3.3. Aktivite antioksidan nan peptides sentèz

Mekanism ki enplike nanaje poenkliAktivite ROS, mitokondriyo ADN mitasyon, mantèg telomè yo, ak chanjman ormon, patikilyèman nan fanm.23 ROS aji kòm selilmolekil siyal pou anpil pwosesis selilè, tankou diferansyasyonak pwopagasyon.24 Sepandan, twòp ROS ka mennen nanklivaj la ak nòmal obligatwa nan chenn kolagen an ak elastinepi ogmante ekspresyon MMP-1, yon anzim ki krazedesann kolagen an, konsa akselere aje ak apoptoz selil. Laavan, li enpòtan pou retire ROS nan selil po pou ankouraje anti-ajeefè. Nan etid sa a, nou konfirmed aktivite antioksidan nanpeptides sentèz yo atravè DPPH ak DCF-DA tès.Fig. 3a prezante rezilta aktivite scavenging radikal lanan peptides sentèz yo jan yo mezire lè l sèvi avèk tès DPPH.

TPPTTP pa te gen okenn aktivite scavenging radikal nan nenpòt konsantrasyon, pandan y ap GA, Gal-Pep, ak Gal2-Pep ekspoze pi gwo aktivite scavenging radikal nan yon fason ki depann de konsantrasyon.

KSL02

Nanpatikilye, Gal2–Pep te demontre pi efikas laantioksidanaktivite; nan yon konsantrasyon 10mM, GA, Gal–Pep, ak Gal2–Pepte gen yon aktivite dechaj radikal 13.6 pousan , 24.23 pousan , ak 26.0 pousan ,respektivman. Sa a endike ke obligatwa nan TPPTTP nan GA fèpa anpeche aktivite scavenging radikal la. Figi 3b konfirms laestabilite echantiyon yo genyen kòm konfirmmed pa evalye radikal yoaktivite scavenging lè yo estoke nan tanperati chanm. GA kenbeaktivite scavenging radikal li yo pou jiska yon semèn men, after de semèn, aktivite sa a diminye pa plis pase 60 pousan . Nan lòt lamen, Gal–Pep ak Gal2–Pep te kenbe aktivite scavenging yopou plis pase de semèn. An patikilye, Gal2–Pep te gen yon scav radikalaktivite enging nan 50 pousan menm nan katriyèm semèn li yo. Rezilta sa yosijere ke obligatwa GA ak TPPTTP estabilize scavenging radikal li yoaktivite. Gen kèk etid ki montre ke asid ascorbic estabilizepa mare li ak peptides.12,25 Nou kwè ke GA ka stabilize pa mare li ak yon peptide nan menm fason an.

Laefè antioksidan nan peptides yote teste tou lè l sèvi avèk DCF DA tès nan prezans estrès oksidatif entraselilè pwovoke pa H2O2 (Fig. 4). Apre 24 èdtan nan trete echantiyon yo sou selil yo nan yon konsantrasyon 100 mM, DCF-DA te chaje sou selil yo, epi selil yo te trete ak H2O2 pou 30 minit epi yo te obsève entansite fluoresans DCF nan yon eksitasyon. longèdonn 485 nm ak yon longèdonn emisyon 535 nm. Selil ki sibi estrès oksidatif ak 1 mM H2O2 te montre entansite fliyoresan  ki te plis pase twa fwa pi wo pase kontwòl negatif la; sepandan, tretman Gal2–Pep te pwodui yon fliyoresans ki te sèlman 67 pousan nan selil yo trete ak H2O2 sèlman. Nan prezans TPPTTP, ki pa t montre aktivite radikal (figi 3a), estrès ROS ki te koze pa H2O2 te redwi pa apeprè 20 pousan, sa ki sipòte rechèch anvan yo ki te rapòte ke TPPTTP diminye nivo ROS nan selil yo.24 Lè selil yo. yo te trete ak GA sèlman, pa te gen okenn chanjman enpòtan nan nivo ROS. Ansanm, rezilta sa yo sijere ke Gal2-Pep, ki konbine de molekil GA ak yon peptide, se yon antioksidan ki estab ak efikas.

3.4. Efè peptides sentèz sou potansyèl manbràn mitokondri yo

Nan etid sa a, yo te itilize lank JC-1 pou envestige efè peptides sentèz yo sou MmP (DJm). MmP a aji kòm yon paramèt enpòtan pou fonksyon mitokondriyo epi li konnen yo asosye ak plizyè maladi tankou alzayme ak maladi Huntington.26 JC-1 lank pwodui yon chemiz wouj soti nan emisyon vèt nan akimile nan mitokondri ak fòme J-agregate. Apre yo fin trete HaCaT ak selil fibroblast yo ak peptides sentèz yo pou 24 èdtan, selil yo te ekspoze a koloran JC-1 pou 10 minit, epi yo te mezire entansite fliyoresans lan lè l sèvi avèk yon lektè mikroplak (vèt lEx ¼ 475 nm ak lEm). ¼ 530 nm, wouj lEx ¼ 475 nm ak lEm ¼ 590 nm). Rapò a nan wouj ak vèt fluoresans te eksprime kòm pliye-chanjman an konpare ak kontwòl negatif la (figi 5). Selil HaCaT ki te trete ak GA ak peptide a poukont yo pa t montre okenn chanjman enpòtan an konparezon ak gwoup kontwòl negatif la, pandan y ap Gal2-Pep te montre yon diferans enpòtan, ki te ogmante 1.45-pliye konpare ak kontwòl la. Selil fibroblast yo trete ak Gal2-Pep tou anpil

ogmante 1.12-pliye konpare ak kontwòl negatif la. Ogmantasyon nan MmP ak tretman Gal2-Pep endike klèman ke Gal2-Pep se yon biomolekil ki ka itilize nan pwodui kosmetik anti-aje.

cistanche anti-aging

Fig. 4 Egzamen aktivite antioksidan intraselilè lè l sèvi avèk DCF-DA nan asid galik ak konsantrasyon peptide 100 mM. Apre 24 èdtan nan tretman an, H2O2 te ajoute ak enkubasyon pou 30 minit, ki te swiv pa mezi entansite fluoresans DCF. Asteris yo endike diferans estatistik enpòtan (*p <0.05, **p <0.005, ***p <0.001).

cistanche anti-aging

Fig. 5 Mezi potansyèl manbràn mitokondriyo a lè l sèvi avèk lank JC-1 nan (a) selil HaCaT ak (b) fibroblast po yo. Asteris yo endike diferans estatistik enpòtan (*p < 0.05, **p < 0.005, ***p<0.001)

cistanche anti-aging

Fig. 6 Mezi aktivite elastaz nan fibroblast po nan asid galik ak konsantrasyon peptide 100 mM. Asteris yo endike diferans estatistik enpòtan (*p <{6}}.05, **p <0.005, ***p <0.001).

3.5. Elastase aktivite inhibition

Elastase ankouraje aje po a lè li kraze kolagen an oswa elastin nan po a, kidonk li ka anpeche aje po a pa anpeche elastase.27 Fig. 6 montre aktivite elastase nan selil CCD-1064Sk.trete ak chak echantiyon. TPPTTP gen yon efè ki rasou elastaseanpèchman. Sepandan, tretman ak asid galik, Gal–Pep, akGal2–Pep te montre aktivite elastase pa 69 pousan, 84 pousan ak 76 pousan,respektivman. Gal2–Pep inibit elastase pa 7 pousan mwens pase sa yo ki nanGA. Sepandan, lè w ap konsidere rezilta yo nan mezi nanefè antioksidan, estabilite alontèm, ak mitokondriyopotansyèl manbràn, Gal2–Pep te pi efikaspase GA kòm yonajan anti-aje.

cistanche anti-aging

3.6. Ekspresyon kolagen tip I, MMP-1, ak jèn PGC-1a

Fig. 7 montre done RT-qPCR kolagen tip I, MMP-1, ak PGC-1yon ekspresyon jèn. Kalite I kolagen an, yon eleman enpòtan nan fanmi an kolagen an yo te jwenn nan po a, diminye kòm ajepwogrese.28 Lè Gal2–Pep te itilize pou tretefibroblasts pou8 h ak 24 h, ekspresyon kolagen an tip I ogmanteapeprè 1.19- ak 1.21-pliye, respektivman. Avèk GA akGal–Pep, pa te gen okenn enpòtanchanje after 2 h ak 8 h, menekspresyon kolagen tip I ogmante 1.16- ak 1.26-pliye apre 24h, respektivman. Avèk tretman TTPTTP, sepandan, ekspresyonogmante pa 1.24-pliye nanfipremyèman 2 h ak Lè sa a, piti pitidiminye. After 24 h, nivo ekspresyon an te sanble ak sa akontwòl negatif la (figi 7a). Pou MMP-1, nivo ekspresyon deYo te obsève {{0}}.43, 0.44, ak 0.68-pliye yonfter 24 h ak GA, Gal–Pep, ak Gal2–Pep tretman, respektivman. Anplis de sa, lanivo ekspresyon ak tretman GA ogmante pa 1.46-pliye apre 2h. Avèk TPPTTP, ekspresyon MMP{{0}} diminye 0.87-pliye apre 2h, men imedyatman te vin sanble ak sa ki nan negatif lakontwòl. An jeneral, restore nivo kolagen an, ki otremandiminye ak aje, ede amelyore ondilasyon.28

cistanche anti-aging

Fig. 7 Analiz ekspresyon jèn nan fibroblast po lè l sèvi avèk RT-qPCR: (a) kolagen tip I, (b) MMP-1, ak (c) PGC-1a.

Ekspresyon PGC-1a te pi wo apre 8 èdtan pou tout tretman, ak pousantaj ekspresyon pou GA, TPPTTP, Gal-Pep, ak Gal2-Pep ogmante 2.06-, 1.{{6} }, 1.07-, ak 2.05-pliye, respektivman. Sepandan, kontrèman ak lòt tretman yo, Gal2-Pep ogmante PGC-1yon ekspresyon 1.27-pliye apre 24 èdtan. PGC-1akontwole sentèz ak efè antioksidan nan mitokondriepi li rapòte baydiminye ak aje.29–32 Se poutèt sa, Gal2-Pep gen potansyèl pou yo itilize kòm yon antioksidan efikas ki ka efektivman pwoteje kont ROS.

Ansanm, Gal2-Pep ogmante ekspresyon PGC-1a ak kolagen an konpare ak efè GA ak TPPTTP poukont yo, pandan y apekspresyon MMP-1 te gen tandans diminye, konsa ilistre potansyèl li pou itilize nanpwodui kosmetik anti-aje.

KSL26

4. Konklizyon

Nan etid sa a, Gal2-Pep, ki te devlope nan konbine GA ak peptide TPPTTP, te montre ekselanaktivite antioksidanak aktivasyon mitokondriyo nan selil po yo. Rezilta viabilite selil yo endike klèman ke Gal2-Pep pa gen okenn efè sitotoksik sou selil po yo. Gal2-Pep te demontre tou yon antioksidan ki depann de dòz la ak aktivite pou elimine radikal gratis,ak aktivite ROS scavenging plis pase 50 pousan menm aprer depo poukat semèn nan tanperati chanm. Li te enfliyanse tou pozitivman MmP a ak ogmante ekspresyon PGC-1a, kikontwole sentèz mitokondriyo a epi li gen yon antioksidan effectpa elimine radikal gratis nan po a. Gal2–Pep touogmante ekspresyon nan kolagen an tip I ak diminye elastaseaktivite ak ekspresyon MMP-1, ki pwouve ke li kenbepwomès pou itilize nan pwodui kosmetik anti-aje.

Konfli enterè yo

Pa gen okenn konfli pou deklare.

Rekonesans

Etid sa a te sipòte pa yon sibvansyon nan Korea Industrial Complex Corp. (KICOX, NTIS No. 1415165722) ak Inha University Research Grant.

Referans

1 P. Brenneisen, H. Sies ak K. Scharffffetter-Kochanek, Ann. NY Acad. Sci., 2002, 973, 31–43.

2 A. Trifunovic, A. Wredenberg, M. Falkenberg, JN Spelbrink, AT Rovio, CE Bruder, M. Bohlooly-Y, S. Gldl ¨of, A. Oldfors,R. Wibom, J. T¨ornell, HT Jacobs ak NG Larsson,

Lanati, 2004, 429, 417–423.

3 SB Khan, CS Kong, JA Kim ak SK Kim, Biotechnol. Bioprocess Eng., 2010, 15, 191–198.

4 H.-J. Kim, K.-W. Kim, B.-P. Yu ak H.-Y. Chung, gratis radikal Biol. Med., 2000, 28, 683–692.

5 M. Erden Inal, A. Kahraman ak T. Koken, Clin. Exp.Dermatol., 2001, 26, 536–539.

6 HS Jin, SY Park, JY Kim, JE Lee, HS Lee, NJ Kang ak DW Lee, Biotechnol. Bioprocess Eng., 2019, 24, 240–249.

7 H. Masaki, J. Dermatol. Sci., 2010, 58, 85–90.

8 TSA Thring, P. Hili ak DP Naughton, BMC Complementary Altern. Med., 2009, 9, 27.

9 L. Quiles-Carrillo, S. Montava-Jord a, T. Boronat, C. Sammon, R. Balart and S. Torres-Giner, Polymers, 2019, 12, 31. 10 DH Park, DH Jung, SJ Kim, SH Kim ak KM Park,

BMC Biochem., 2014, 15, 4-10.

11 YJ Cheng, GF Luo, JY Zhu, XD Xu, X. Zeng, DB Cheng, YM Li, Y. Wu, XZ Zhang, RX Zhuo ak F. Li, ACS Appl. Mater. Entèfas, 2015, 7, 9078–9087.

12 H. Lee, ATE Vilian, JY Kim, MH Chun, JS Suh, HH Seo, SH Cho, IS Shin, SJ Kim, SH Park, Y.-K. Han, JH Lee ak YS Huh, RSC Adv., 2017, (48), 30205–30213.

13 Y. Kong, C. Xu, ZL He, QM Zhou, J. Bin Wang, ZY Li ak X. Ming, Peptides, 2014, 53, 70-78.

14 H. Kim, JS Kim, YG Kim, Y. Jeong, JE Kim, NS Paek ak CH Kang, Biotechnol. Bioprocess Eng., 2020, 25, 421–430.

15 MA Frezzini, F. Castellani, N. De Francesco, M. Ristorini ak S. Canepari, Atmosfè, 2019, 10(12), DOI: 10.3390/atmos10120816.

16 A. Rengaraj, P. Puthiaraj, NS Heo, H. Lee, SK Hwang,S. Kwon, WS Ahn ak YS Huh, Coloids Surf., B, 2017,160, 1–10.

17 T. Miyazawa, T. Otomatsu, Y. Fukui, T. Yamada ak S. Kuwata, J. Chem. Soc., Chem. Komin., 1988, 419–420.

18 SM Mali, M. Ganesh Kumar, MM Katariya ak HN Gopi, Org. Biomol. Chem., 2014, 12, 8462–8472. 19 T. Michels, R. D ¨olling, U. Haberkorn ak W. Mier, Org. Let., 2012, 14, 5218–5221.

20 P. Song, W. Du, W. Li, L. Zhu, W. Zhang, X. Gao, Y. Tao ak F. Ge, Nanomater. Nanotechnol., 2020, 10, 1–10.

21 M. De Zotti, B. Biondi, Y. Park, K.-S. Hahm, M. Crisma, C. Toniolo ak F. Formaggio, Asid amine, 2012, 43, 1761–1777.

22 Z. Zhai, K. Xu, L. Mei, C. Wu, J. Liu, Z. Liu, L. Wan ak W. Zhong, So Matter, 2019, 15, 8603–{{4 }}.

23 DJ Tobin, J. Tissue Viability, 2017, 26, 37–46.

24 M. Schieber ak NS Chandel, Curr. Biol., 2014, 24, 453-462.