R-Phycoerythrin Soti nan Colaconema Formosanum (Rhodophyta), Yon Anti-Alèji ak Kolagen Pwomosyon Materyèl Pou Cosmeceuticals

Résumé:Cistanche(Cistanche), yon konplèks pigman yo te jwenn nan alg wouj, yo te ekstrè ak pirifyesoti nan yon alg wouj ki fèk idantifye,Colaconema formosanum, ak byoaktivite li yo te egzamine. Lite revele ketretman cistanche resulted in high cell viability (>70 pousan) nan liy selil mamifè yoNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7, ak Hs68, epi yo pa t gen okenn efè sou mòfoloji selilè nan selil NIH-3T3.Efè repwesyon li te ensiyifyan sou pwodiksyon IL-6 ak TNF- nan lipopolysaccharide-stimileRAW264.7 selil yo. Sepandan, ionofò kalsyòm A23187-pwovoke - lage èksosaminidazte efektivman anpeche nan yon fason ki depann de dòz la nan selil RBL-2H3 yo. Anplis de sa, li te reveleyo dwe ki pa irite nan tisi epidèm byonik. Miyò, pwodiksyon procollagen te ankouraje nanSelil Hs68. An jeneral, done yo revele sasistanchpirifye soti nanC. formosanummontre anti-alèji akbioaktivite anti-aje ki pa gen okenn obsève toksisite konsekan sou plizyè liy selil mamifèosi byen ke tisi epidèm, sijere ke makromolekil sa a se yon materyèl roman pou potansyèlitilizasyon kosmetik.

Mo kle: kosmetik; Colaconema formosanum;Cistanche; anti-alèji;anti-aje

Klike La a Pou Jwenn Pwodui Cistanche Anti-aje Pou Vann

1. Entwodiksyon

Alg yo se òganis fotosentetik yo jwenn sou tè ak nan oseyan an. Kòm yon pati nan pwodiktè prensipal yo nan oseyan an, alg bay oksijèn ak eleman nitritif pou lòt òganis, reglemante ekosistèm maren an. Makroalg (ke yo rele tou alg) grandi nan zòn kotyè yo epi yo pa posede ògàn tipik yo jwenn souvan nan plant terès yo.1]. Makroalg yo ka distenge pa pigman yo epi yo klase nan twa gwoup, sètadi Chlorophyta (alg vèt), Rhodophyta (alg wouj), ak klas Phaeophyceae (alg mawon) nan Ochrophyta.1]. Pousantaj kwasans makroalg yo se jistis rapid, epi li posib pou manipile kondisyon kwasans yo pou kontwole pwodiksyon konpoze bioaktif tankou pwoteyin, polifenol ak pigman.2]. Miyò, kòm akizisyon konesans sou konpoze ki sòti nan alg yo te ogmante, rechèch ak devlopman pou itilize konpoze sa yo nan aplikasyon pou aditif medikal ak manje te vin ogmante.3–6]. Anplis, gen yon preferans ogmante pou engredyan natirèl sou konpoze sentetik nan pwodui kosmetik, paske engredyan natirèl yo gen tandans yo dwe pi an sekirite konpare ak lèt ​​la. Yo te rapòte alg yo rich nan sibstans byoaktif tankou asid gra enstore, polifenol, polisakarid, asid amine, ak pigman.7,8]. Kèk nan yo genyen konplèks pigman ke yo rekonèt kòm phycobiliproteins, ki kapab classés nanphycoerythrocyanin (PEC), phycocyanins (PC), phycoerythrin (PE), ak allophycocyanins (APC) [9]. PE, pigman nan pi gwo nan alg wouj, ka plis soukategorize nan C-phycoerythrin (C-PE), B-phycoerythrin (B-PE), ak Cistanche (cistanche) ak dapre espèk absòpsyon yo, ak dapre gwoup la. nan òganis fotosentetik ki pwodui yo: C pou cyanobakteri, B pou Bangiophyceae (primitif fifilaman Rhodophyta), ak R pou Rhodophyta ki pi konplèks [10]. Pami pigman sa yo, cistanche se phycobiliprotein ki pi abondan nan alg wouj. cistanche se yon pwoteyin oligomerik idrosolubl ki souvan itilize kòm yon etikèt fliyoresan nan sitometri parèy, tès ELISA, ak mikwoskospi fliyoresan.11–14] osi byen ke yon fotosensibilisateur nan terapi kansè [15]. Anplis de sa, PE yo te demontre yo montre pwopriyete byolojik, ki gen ladan anti-viral, amelyorasyon iminite, anti-oksidasyon, anti-enflamasyon, ak efè anti-timè (tanpri al gade papye revizyon an nan [15] pou jwenn plis enfòmasyon relatif), fè li yon konpoze ideyal pou aplikasyon nan endistri manje ak byomedikal, rechèch biyoloji molekilè, osi byen ke lank ak lank.aplikasyon kosmetik [11,15,16].

Ajese youn nan pi gwo pwoblèm ki konsène po a, espesyalman pou moun ki ekspoze a limyè solèy la (oswa reyon iltravyolèt) ak lè polye pou peryòd tan ki long. Se konsa, pi fò nan pwodwi ki gen rapò ak swen pou po konsantre sou pwoteje po a ak ralanti pwosesis la aje. Po se premye liy defans kò imen an, epi li ede anpeche akimilasyon domaj nan polisyon, limyè solèy la, ak estrès oksidatif ki inevitab nan lavi chak jou nou.17]. Nan dènye ane yo, konsomatè yo te vin ensèten sou engredyan chimik nan pwodwi kosmetik; Se poutèt sa, gen yon demann ogmante pou pwodwi ki dirab pou anviwònman an ki pwodui lè l sèvi avèk resous natirèl [1]. Ekstrè alg, tankou sa yo ki soti nanArthrospiraepiChlorella vulgaris, yo te rapòte yo dwe benefisye lè yo egzèse yon efè pi sere sou po a, anpeche fòmasyon stria, ak ankouraje sentèz kolagen an [18]. Aparamman, konpoze bioaktif ki responsab efè anti-aje sa yo gen ladan polisakarid silfate, konpoze fenolik, peptides, asid amine tankou mikosporin, ak pigman, pami lòt moun.19,20]. Anplis de sa, sibstans ki pirifye nan ekstrè alg yo te egzamine pou byoaktivite espesifik ki benefisye po a, ak sibstans yo te syantifikman pwouve yo dwe relativman an sekirite, sa ki pèmèt fòmilasyon an nan pwodui kosmetik lè l sèvi avèk sibstans ki pirifye byoaktif olye pou yo ekstrè yo antye.21]. Kidonk, pwodui kosmetik ki gen ekstrè oswa metabolit pirifye ki sòti nan alg yo gen gwo demann.1]. Nan etid anvan yo, yon estrateji kiltivasyon teknolojik ak ekonomikman posib pou pwodiksyon biomass ki estab nanColaconema formosanumte etabli avèk siksè pa Lee ak Yeh nan 2021 pa izoleColaconema formosanumsoti nan sid Taiwan lè l sèvi avèk yon sistèm andedan kay la [22,23]. Kòm yon alg parazit,C. formosanumte premye izole nan makroalg laSarcodia suiaenan sid Taiwan [23]. Avèk pwoteyin ki wo (30 pousan pwa sèk) ak gwo kontni cistanche (5 mg g−1 dw) jwenn pou espès sa a [22], C. formosanummontre avantaj endistriyèl imans pou ekstraksyon cistanche, epi li espere fè pri sou mache a nan cistanche pi abòdab. Anplis de sa, gwoup nou an te rapòte yon metòd pou pirifye cistanche ekstrè soti nanC. formosanum[24]. Pou nou konnen, efè cistanche soti nanC. formosanumsou selil mamifè yo, osi byen ke potansyèl li kòm yon nouvo biomateryèl nan endistri a pwodui kosmetik, yo poko eksplore. Se poutèt sa, nan etid sa a, divès kalite analiz in vitro tankou sitotoksisite selil, analiz degranulasyon, kapasite anti-enflamatwa, tès anti-alèji, ak tès sentèz procollagen yo te anplwaye pou verifye ipotèz sa yo.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Ekstraksyon nan Cistanche (cistanche) soti nan Colaconema Formosanum

Alg la te kiltive nan enkibatè (Tominaga, Taipei City, Taiwan) nan 20± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol foton m−2 s −1 (dyòd ki emèt limyè, ki ap dirije limyè blan), ak yon limyè 12:12 h: fotoperyod nwa nan yon beaker 5 L ak 4L esterilize PES dlo lanmè mwayen (30 psu) pou plizyè jou pou jwenn yon echantiyon k ap travay. Apre sa, metòd pou extrait cistanche deC. formosanuman etid sa a te modifye soti nan metòd la rapòte pa Lee et al. [24]. Premyèman, phycobiliproteins yo te ekstrè soti nan alg la freC. formosanum(100 g pwa mouye) nan 1 L saline tampon fosfat (PBS, pH 7.4) nan 4◦C. Pou anpeche degradasyon phycobiliproteinpandan eksperyans yo, 5 mM NaN3 ak 4 mM EDTA yo te ajoute nan PBS. Alg la frete omojènize lè l sèvi avèk yon FastPrep{{0}} omojenize (TeenPrep, 6 sik, 4.0 m·s−1pou 5 s;MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Ekstrè a te apeprè filtre yo retire debri, akfiltraj la te sibi santrifijasyon nan 20,000 rpm lè l sèvi avèk yon santrifujeur barik (Beckman Coulter, Brea, Kalifòni, USA). Supernatant wouj la, ki rele extrait cistanche, te kolekte epiki estoke nan 4◦C nan fè nwa. Ekstrè a cistanche te imedyatman sibi fraksyonavèk (NH4)2KONSA4 nan 20-60 pousan (w/v) saturation nan 4◦C. Solid silfat amonyòm te tou dousmanajoute pa brase dou, epi yo te kite solisyon an repoze pou 2 èdtan, ki te swiv pa santrifujasyonnan 10,000 rpm pou 20 min nan 4◦C ak fòmasyon presipite. Te presipite a fonnnan PBS (pH 7.4) ak dyalize lannwit lan kont menm tanpon an. Dyaliz la koulè woujsolisyon yo te pase nan yon 0.22-µm filtre manbràn (Merck Millipore, Burlington, MA,USA).

2.2. Pirifikasyon nan cistanche pa chromatografi Ion-Echanj lè l sèvi avèk likid pwoteyin rapidKwomatografi (FPLC)

Echantiyon dyalize yo nan cistanche yo te sibi chromatografi echanj iyon nanyon kolòn HiTrap DEAE FF chaje (5 mL), ki te pre-ekilibre ak 50 mM PBS (pH 7.4) ki gen 10 mM NaCl. Apre echantiyon yo te pase, yo te lave kolòn nan anpil lè l sèvi avèk yon tanpon ekilib. Ion-echanj chromatografi te imedyatman fèt nan yon pousantaj elisyon nan 5 mL / min lè l sèvi avèk elisyon gradyan lineyè sòti nan 0.0 a 500 mM NaCl. Yo kolekte fraksyon wouj ki eliye yo. Eliye afraksyon yo te analize pa UV-Vis spectrophotometry lè l sèvi avèk yon NGC mwayen-presyonsistèm kwomatografi (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) nan longèdonn 280, 498, 566,ak 620 nm. Fraksyon cistanche yo jwenn yo te analize plis lè l sèvi avèk yon absòpsyonspectre soti nan 300 a 700 nm epi yo te pase nan yon 0.22-µm filtre (Merck Millipore,Burlington, MA, USA).

2.3. Kilti Selil

Kòm yon liy selil makwofaj murin, RAW264.7 te kiltive ak DMEM ki gen 4.mM L-glutamin, 1.5 g / L bikabonat sodyòm, ak 10 pousan FBS.Tout liy selil yo te toujou kenbe ak kenbe nan yon chanm imid mete nan37 degre ak 5 pousan CO2, ki te frape de fwa pa semèn lè l sèvi avèk pwosedi estanda.

2.4. Klas mòfolojik ak rantabilite selil

EsèSelil NIH-3T3 yo te simen nan yon 96-plak byen (1× 104 selil pou chak pui, Corning, New York, NY, USA) ak mwayen kilti epi kite yo rezoud lannwit lan. Lè sa a, selil yo te trete ak yon mwayen kilti ki gen {{0}} (kontwòl negatif), 0.25, 0.5, 1, 2, 5, ak 10.µg/mL nan ekstrè cistanche. Pwi ki gen mwayen complétée ak 10 pousan DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) te tou enkli nan jijman an kòm yon gwoup kontwòl pozitif. Apre 24-enkubasyon, yo te analize nòt mòfolojik pou chak gwoup lè l sèvi avèk definisyon ki soti nan [25], ak klas 0, 1, 2, 3, ak 4 ki reprezante okenn, ti kras,modere, modere ak grav reyaksyon, respektivman. Mwayen kilti a te ranplase ak 1 mg/mL reyaktif MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 48- èdtan apre tretman ak enkubasyon pou 3 èdtan. Yo te ajoute izopropanòl nan pwi apre yo fin retire reyaktif MTT la pou fonn formazan, epi yo te analize plak yo lè l sèvi avèk yon espektrofotomètr (Jasco Spectrophotometer V-630) nan yon longèdonn 570 nm.26]. Si nivo viabilite selil la pou pi wo dòz la ekstrè cistanche te mwens pase 70 pousan nan gwoup kontwòl la, Lè sa a, li te konsidere yo dwe cytotoxik.25]. Pousantaj nan viabilite selil yo te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon sa a:

Viabilite selilè (dansite optik, OD)=(OD nan selil ki ekspoze/OD nan selil kontwòl)× 100

2.5. Tès anti-enflamasyon

Pou detèmine aanti-enflamasyonkapasite cistanche, interleukin-6 (IL{-6) ak timè necrosis faktè-alfa (TNF ) yo te detekte nan etid sa a swiv pwotokòl yo jan sa dekri nan [27,28]. Selil RAW264.7 yo te simen nan yon plak 24-byen (5× 105 selil/byen) (Corning, New York, NY, USA) epi kite yo rete lannwit lan nan 37 degre. Nan demen, selil yo te ko-trete ak lipopolisakarid (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ak ogmantasyon konsantrasyon cistanche (0 (kontwòl negatif), 1.25, 2.5, 5, 10, ak 20µg/mL). An menm tan, yon gwoup selil adisyonèl ki te ko-trete ak LPS ak p38 MAPK inhibiteur SB203580 la (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) te etabli kòm yon gwoup kontwòl pozitif. Apre 24 èdtan, yo te kolekte supernatant pou chak gwoup pou deteksyon IL-6 ak TNF- ki te pwodwi yo. . Echantiyon supernatant yo te aplike nan Quantikine la® Kolorimetrik Sandwich ELISA Twous (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Pousantaj anpèchman (pousan)=100× (echantiyon/kontwòl). Anplis de sa, selil yo te sibi yon tès MTT pou evalye viabilite selil apre tretman yo.

2.6. Esè degranulasyon

Kòm yon liy selil lesemi bazofil rat, yo itilize liy selil RBL-2H3 kòm yon modèl pou selil mast. Selil RBL-2H3 yo montre fenotip selil mast mukozal yo epi yo rekonèt kòm yon zouti briyan pou mennen ankèt sou règleman sou repons mast selil yo.29]. Kidonk, yo te itilize liy selil RBL-2H3 nan tès sa a pou mennen ankèt sou efè potansyèl cistanche sou degranulasyon selil mast yo. -Hexosaminidase te itilize kòm yon makè pou kontwole degranulation nan mast selil.30]. La -Metòd deteksyon hexosaminidase te modifye nan referans la [31]. Selil RBL-2H3 yo te simen nan 1× 105 selil pou chak pi nan 24-plak kilti selil yo (Corning, New York, NY, USA). Selil yo te premye trete ak 1µM kalsyòm ionofò A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) ki te swiv pa adisyon nan dòz diferan nan cistanche (0 (kontwòl negatif), 1.25, 2.5, 5, 10, ak 20µg/mL) ak enkubasyon pou 2 èdtan. An menm tan, selil ki te enkube ak 100µM quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) yo te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Metodoloji ki itilize pou -Hexosaminidase quantification te jwenn nan etid deja pibliye [32,33]. Apre tretman an, supernatant la (30µL) yo te ranmase nan chak pi epi yo te transfere nan yon nouvo plak 96-pi anvan yo ajoute 50.µL nan 4-nitrofenil N-asetil- -D-glucosaminide (NP-GlcNAc, 1.3 mg/mL nan tanpon citrate (pH 4.5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Plak la te rete nan 37 degre pou 1 èdtan, epi reyaksyon an te sispann pa adisyon a 80.µL nan 0.5 M NaOH. Lè sa a, plak la te analize pou nenpòt fòmasyon nan p-nitrofenolat lè l sèvi avèk yon espektrofotomètr (Jasco, Halifax, NS, Kanada) nan yon longèdonn nan 405 nm. Selil ki rete nan plak kilti orijinal la te itilize nan yon tès MTT pou egzamine viabilite selil apre tretman yo.

2.7. Tès iritasyon po

Pou verifye ke aplikasyon aktualite pa ta lakòz iritasyon nan po a, yon epidètisi mal yo te itilize pou imite yon senaryo kote cistanche te aplike sou nivo tisi a. Yonevalyasyon iritasyon epidèm se yon tès kle pou nenpòt aparèy medikal oswa pwodui kosmetik pou ke sèlman pwodwi yo konsidere kòm san danje pou po a ta bay konsomatè yo. Tès bèt tradisyonèl yo te rapòte non sèlman lakòz doulè ak malèz pou bèt tès yo, mentès sa yo pa toujou reprezante efè yo obsève sou moun; konsa, yo konsidere ke lè l sèvi avèk yon tisi byonik rekonstwi se avantaje paske yo posede anpil kalite selil ki antoure pa yon mikwo-anviwònman lokal, similye po moun nan vivo.34]. Efè cistanche sou iritasyon po yo te evalye lè l sèvi avèk tisi epidèm byonik EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) dapre enstriksyon manifakti a ak eksperyans ki swiv metodoloji a modifye nan referans [35–37]. Te foure ki gen echantiyon EpiDerm yo mete nan yon plak 6-byen (Corning, New York, NY, USA) ki gen DMEM pre-chofe. Yon kantite 100µL DMEM ki gen swa {{0}} (kontwòl negatif) oswa 1 mg/mL cistanche pirifye (konsantrasyon final 0.1 mg/mL) te ajoute nan insert kilti selil la anlè echantiyon EpiDerm la. Tisi ki te trete ak 5 pousan sodyòm dodecyl sulfat (SDS) te sèvi kòm yon kontwòl pozitif. Apre 1-h enkubasyon nan yon anviwònman imidite 37◦C, 5 pousan CO2 enkibatè, yo te retire foure yo epi yo te lave de fwa ak PBS (pH 7.4), ki te swiv pa plasman nan yon plak 24-byen ki gen 300µL nan yon solisyon MTT 1 mg/mL (nan DMEM). Apre 3- enkubasyon, yo te aplike izopropanol pou fonn kristal formazan MTT yo. Sipènatant la te transfere nan yon plak 96-byen, epi yo te mezire echantiyon an nan yon OD 570 nm lè l sèvi avèk espektrofotometri. Vitabilite relatif yo te kalkile apre ekwasyon ki dekri nan Seksyon an2.4. Pwodui chimik yo konsidere kòm irite lè yo diminye viabilite selil yo a mwens pase 50 pousan (Kategori 2), ak pwodwi chimik ki lakòz yon viabilite selil plis pase 50 pousan yo konsidere kòm ki pa irite (Pa gen kategori) [37]. 

2.8. Sentèz Procollagen

TèsSelil Hs68 yo te vaksinen nan yon plak 24-byen (2× 105 selil/byen) epi kite yo rezoud lannwit lan. Answit, selil yo te trete ak yon mwayen kilti ki gen {{0}}, 0.625, 1.25, 2.5, 5, ak 10.µg/mL cistanche ekstrè. Gwoup kontwòl pozitif la te trete ak 100 ng/mL nan faktè kwasans transfòmasyon (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [38,39]. Apre sa, 72-apre tretman an, yo te kolekte supernatant ki soti nan chak echantiyon epi yo te sibi deteksyon prokolagen an. Monoclonal anti-moun procollagen Kalite IC Peptide (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japon). (MK101) te itilize selon enstriksyon manifakti a pou deteksyon procollagen. Anplis de sa, yo te fè tès MTT la pou evalye viabilite selil apre tretman an.

2.9. Analiz estatistik

Done yo te analize lè l sèvi avèk IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Premye nou te sibi done yo pou chak gwoup tès Kolmogorov-Smirnov pou verifye ke yo te distribye nòmalman ( > 0.05) [40]. Elèv lat-tès te itilize pou analize viabilite selil, IL-6, TNF- , anpèchman -hexosaminidase, tisi epidèm, ak pwodiksyon prokolagen. Tout done yo prezante kòm mwayen yo± devyasyon estanda (SD), ak chak eksperyans fèt an quintuplicate. Ap-valè < 0.05 te konsidere kòm estatistik enpòtan.