Otofluoresans kòm yon biomarker ki pa anvayisan nan senesans ak pwodwi fen glikasyon avanse nan Caenorhabditis Elegans

Pou evalye sèvis piblik otofluoresans kòm yon biomarker noninvasive nan senesans nan Caenorhabditis elegans, nou mezire otofluoresans nan nematod endividyèl lè l sèvi avèk spectrofluorimetry. Fliyoresans chak vè ogmante ak laj. Bèt ki gen pi ba entansite fliyoresans te montre esperans lavi ki pi long. Lè pwoteyin ekstrè soti nan vè yo te enkube ak sik, entansite a fliyoresan ak konsantrasyon nan pwodwi fen glikasyon avanse (AGEs) ogmante sou tan. Riboz amelyore chanjman sa yo pa sèlman nan vitro, men tou nan vivo. Rifampicin nan bloke glikasyon siprime ogmantasyon sa a nan fliyoresans. Espektrometri mas segondè-rezolisyon te revele ke vitellogenin akimile nan vè fin vye granmoun, ak vitellogenin glycated emèt sis fwa pi wo fluoresans pase vitellogenin nayif.Ogmantasyon nan fliyoresans ak aje soti nan sibstans glycatedak Se poutèt sa ta ka sèvi kòm yon itil biomarker noninvasive nan AGEs.Cistancheka sèvi kòm yon nouvo modèl pou chèche faktè anti-AGEak etidye relasyon ki genyen ant AGEs ak senesans.

Sispannli remèd fèy pou faktè anti-AJ

ENTWODIKSYON

Yo te pwolonje lavi mwayèn nan moun nan peyi devlope yo pandan dènye mwatye syèk la. Sepandan,domaj pwogresif ak aje lakòz efè prejidis sou fonksyon fizyolojik, ke yo rekonèt kòmsenesans, epimaladi ki gen rapò ak senesanstou ap ogmante nanpwopòsyon ak lonjevite. Ekstansyon nan"sante" se kounye a nesesè olye ke pwolonje lavi a pou kont li. Entèvansyon ki ralanti senesans ak pwolonje span sante a yo vle. Brenner et al. prezanteCaenorhabditis elegans, ki se yon ti nematod tè k ap viv gratis ki manje sou bakteri, pou itilize nanetid jenetik molekilè diferansyasyon ak devlopman.

Imedyatman, vè k'ap manje kadav la te itilize anpil kòm yon sistèm eksperimantal pou etid byolojik, ki gen ladan rechèch sou senesans, akòz bèt sa a.'s senplisite, transparans, fasilite nan kiltivasyon, lavi kout, ak konvnab pou analiz jenetik2. Nan vè k'ap manje kadav la, senesans ka egzamine pa diminisyon nan kapasite locomotive, rezistans estrès, kapasite mantal, ak ponpe farinj, ak akimilasyon nan sa yo rele lipofuscin pigman laj.3–5 .

Yon varyete pwodui chimik, ki gen ladan antioksidan ak plizyè dwòg, se kandida pou anpeche senesans6,7. Anplis de sa, depi nou te rapòte ke span sante ak lavi nematod yo ta ka pwolonje pa manje sou bakteri probyotik.8,9, efè lonjevite bakteri benefisye yo te demontre tou pa yon kantite laboratwa10–12. Efè lonjevite yo te egzamine pa koub siviv, men etid sa yo nan vè mande pou plis pase 3 semèn, malgre lavi a relativman kout nanC. elegans. Pou evalye efè entèvansyon kont senesans, endikatè pratik ak non-invasive nan senesans yo vle trase enfliyans nan vè endividyèl ak (finalman) nan imen kòm sib final la.

Lipofuscin, yon sa yo rele pigman laj, yo te itilize anpil kòm yon endikatè nan senesans. Sepandan, relasyon egzak ant otofluoresans, senesans, ak lavi nan vè k'ap manje kadav la te rete klè. Gerstbrein et al. rapòte ke pigman laj yo se repòtè valab nan sante nematod13, tandiske Coburn et al. rapòte ke fliyoresans ble (longèdonn eksitasyon/emisyon santre sou 340/430 nm) sèvi kòm yon makè lanmò pandan plizyè èdtan anvan ak apre lanmò nanC. elegans14. Li te sijere ke ogmantasyon nan otofluoresans ble sou tan obsève nan popilasyon ki ajeC. elegansta ka reflete pa pousantaj moun ki aje oswa eta sante nan popilasyon an poukont li, men olye de fraksyon nan moun ki mouri oswa ki prèske mouri nan echantiyon an.15.

Pwodui fen glikasyon avanse (AGEs) te atire atansyon syantifik16 paske yo fòme nan gwo kantite nan ka dyabèt, men tou, pandan aje fizyolojik, epi mennen nan estrès oksidatif. AGE yo se konpoze konplèks ki fòme pa reyaksyon ki pa anzimatik ant sik rediksyon ak gwoup amine nan pwoteyin, lipid, oswa asid nikleyik; Lè sa a, baz Schiff ak pwodwi Amadori yo fòme atravè reyaksyon Maillard, ki bay AGEs. Kontni AGE se wo nan pasyan ki gen dyabèt, atrit rimatoyid, alzayme'maladi a, ak lòt maladi17–19. Nan pasyan ki gen dyabèt, akimilasyon AGE korelasyon byen ak gravite a nan maladi mikwovaskilè a epi li ogmante ak laj. Sepandan, si wi ou non AGE yo reprezante yon kòz patojèn oswa yo se sèlman pwodwi segondè rete yo dwe klè. AGE yo konsidere tou kòm kòz posib senesans20,21, jan yo sijere nan rezilta nan aC. elegansmodèl toksisite sik22,23.

Yo te devlope yon metòd sistematik tès imunosorban ki lye ak anzim (ELISA) pa anplwaye antikò ak espesifik pou plizyè konpoze AGE.24–26. Sepandan, metòd non-invasive pou pèmèt estimasyon ki graj nivo AGE yo obligatwa tou. Depi plizyè AGE yo rapòtefluoresan ak asosye yoflentansite uoresans montre yon siyfifipa ka korelasyon ak nivo yo mezire pa ELISA27, nou egzamine si sa afluorescence ta ka itilize kòm yon makè altènatif pou trase estati AGEs ak senesans nan yonC. elegansmodèl.

Pou verifye si yo obsèvefliyoresansjis reflete lanmò afliyoresansrapòte pa Coburn et al., vè yo te egzamine pa trase afluoresans nan vè endividyèl pandan y apdistribisyon bèt yo respektif yo. Anplis de sa, laefè inhibiteurs nan fòmasyon AGE soufliyoresansak akimilasyon AGE yo te envestige tou pou valide sèvis piblik laC. eleganskòm yon bèt modèl pou rechèch AGE.

REZILTA

Autofluorescence nan pwoteyin ekstrè kòm yon biomarker nan aje ak AGEs nan vè

Spèktrofotometri fliyoresan nan pwoteyin ekstrè endike ke eksitasyon nan 325–365 nm te fè 17-vè ki gen yon joufluoresce ak emisyon ki pi wo nan 400 la–430 nm (pik 420 nm) entèval (Fig.1a). Ble afluoresans te konparativman pi ba pandan jèn adilt (3-jou jiska 5-jou) men li te ogmante avèk tan (nan 7-animal ki gen yon jou) (Fig.1b). Lipofuscin, yon sa yo rele pigman laj, emèt woujfluoresans (eksitasyon nan 530–560 nm, emisyon nan 585–645 nm)15; nan etid anvan nou an, yo te detekte makè sa a nan vè ki gen plis pase yon jou (plis pase 13-jou).9. 

Depi oto afluorescence yo te jwenn nan etid la prezan parèt nan yon etap pi bonè ak ogmante sou tan, ble otofluoresans te espere yo dwe yon pi bon biomarker pou trase senesans. Depi plizyè konpoze AGE yo konnen yo oto-fluoresan27, nou egzamine relasyon ki genyen ant kontni AGE ak ble.fluoresans pa Western blotting kote yon antikò pou Nε- (carboxymethyl) lysine (CML), yon reprezantan AGE, te itilize. Blotting la te montre ke yon bann eksepsyonèl te anplifye sou tan (Fig.1c ak Figi Siplemantè 1). Vreman vre, kantite rejyon an te endike ogmante AGE (Fig.1d), byenke CML se pa otofluoresan.

Pou detèmine si oto afluorescence endirèkteman endike yonogmantasyon nan AGEs ki te fòme pa reyaksyon Maillard, pwoteyinekstrè soti nan omojene vè k'ap manje kadav yo te enkube aseptik pou jiska 4 semèn ak sik rediksyon tankou glikoz, riboz, ak fruktoz. Lafluoresans nan pwoteyin yo te ogmante sou tan nan prezans sik, pandan ke pa te gen okenn ogmantasyon make nanfluoresans nan reyaksyon ki fèt san sik (Fig.2a). Pwoteyin vè vin tounenfluoresan atravè glikasyon menm nan vitro. Pami reyaksyon yo fèt ak chak nan twa sik yo, moun ki gen riboz pwodui pi wo afluorescence, ki te swiv pa de lòt sik yo. Sa afikseYon rapò Bunn ak Higgins te kapab eksplike rezilta a nan ki reyaksyon chak mono-sakarid ak gwoup amine pou fòme lyen baz Schiff depann de limit li egziste nan estrikti ouvè (carbonyl) olye ke nan yon bag. emiacetal oswa emiketal), ak pousantaj reyaksyon yo ogmante nan lòd riboz (10.{0), fruktoz (4.5), ak glikoz (0.6) (×10).−3 mm−1 h−1 ), respektivman28.

Fig. 1 Spèktrofotometri fluoresans ak AGEs echantiyon pwoteyin vè k'ap manje kadav. yonMatrice emisyon eksitasyon (EEM) trase otofluoresans soti nan vè lysed nan 3-jou ak 17-jou. LaflNivo uoresans nan longèdonn emisyon an nan simit EEM yo parèt tankou kat chalè ki gen koulè. Te gen san (100) vè (tip sovaj N2) chak nan 3-jou ak 17-jou fin vye granmoun nan 3 µL tanpon liz ak 4 µL nan 15 pousan SDS. Pwoteyin yo te lage pa sik friz-dekonjle, ak spectre fotoluminesan yo te kolekte ak yonflespektrofotomèt uoresans (Hitachi FL-4500). Pwopriyete fluoresans nan nematod lysed yo te analize lè l sèvi avèk EEMflespektroskopi uoresans. Eksitasyon nan 325–365 nm te fè 17-vè ki gen yon joufluoresce ak emisyon ki pi wo nan 400 la–430 nm entèval korespondan trajectoire kòm yon seri deflentansite uoresans, tandiske 3-jenn vè ki gen yon jou pa t 'fluoresce. Analiz miltivarye (ekitasyon yon sèl longèdonn ak emisyon miltip longèdonn, ak analiz synchronefluorometry) te bay simit EEM ki gen ladan eksitasyon yon sèl-eskanè.b Nivo otofluoresans (ansyen 340/em 360–600) pa echantiyon pwoteyin vè k ap soti nan bèt chak gwoup laj (3–13 jou). Vè (n2 kalite sovaj) yo te kolekte nan tib, lavesenkfwa, ak lysed nan chak tib. Lè sa a, echantiyon yo te tè lè l sèvi avèk yon Mini moulen san fil (Funakoshi, Tokyo, Japon) yo lage pwoteyin. Kontni pwoteyin yo te mezire quantitativeman jan sa dekri nan Metòd yo. Aflyo te detèmine spectre uoresans pou chak echantiyon 30-µL (ki gen 1.5μg nan pwoteyin total) lè l sèvi avèk yon griyaj miltimodèl lektè mikroplak modèl SH -9000Lab (Corona Electric, Ibaraki, Japon). Chak mezi te fèt twa fwa.c Western blotting analiz de AGE CML la nan echantiyon ekstrè nan popilasyon vè k'ap manje kadav (n2 kalite sovaj) ki gen laj diferan. Yo montre yon foto reprezantan twa eksperyans repwodiktif. Blots yo te sòti nan diferan pati nan menm jèl la (yo montre nan Figi Siplemantè 1) epi yo te trete an paralèl.d Quantifikationnan AGEs nan tach lwès lè l sèvi avèk densitometri. Gwoup ki antoure pa ankadreman rektangilè nan Fig.1c yo te quantifye, epi done ki soti nan twa eksperyans repwodiktif yo montre kòm vle di ± SE.

respektivman.

Pou evalye dirèkteman si ogmantasyon nanfluorescence nan prezans sik yo te akòz fòmasyon AGE, ELISA te itilize yo detekte reprezantan AGE konpoze CML la. CML te ogmante nan reyaksyon sa yo, ak nivo nan echantiyon enkubasyon ak riboz te jiska prèske sèt fwa pi wo pase sa yo nan kontwòl enkubasyon san sik pou 4 semèn (Fig.2b). Konpare ak riboz, kantite CML ki te pwodwi ak glikoz oswa fruktoz te ba, menm jan ak CML nan kontwòl la; sa ajwennkonkòdans ak yon rapò anvan29.

Autofluorescence kòm yon biomarker nan aje ak AGEs nan vivo

Nou pwochen teste si wi ou non laflte kapab detekte uorescence pa sèlman nan pwoteyin ekstrè, men tou nan vè k ap viv. Lè yo te li otofluoresans vè endividyèl yo sou fim vlope plastik ki te lonje sou 384-plak byen ak yon lektè mikwoplak griyaj multimode, rezilta espektrofotometri yo te sanble ak sa yo ki nan pwoteyin ekstrè (Fig.3a). Entansite endividyèl ble afluoresans ogmante ak tan (Fig.3b ak Figi Siplemantè 2), pandan ke pa gen woujfluoresans te detekte ak metòd sa a. Depi bleflte deja rapòte uoresans (340/430 oswa 350/460 nm) ki asosye ak lanmò.14,15, analiz la te fèt lè yo ekskli done yo jwenn nan 2 jou anvan yon bèt'lanmò a. Sepandan, ble afluoresans nan vè yo toujou ogmante sou tan: ogmantasyon nanflSe poutèt sa, uoresans dwe pasyèlman endepandan de lanmò afluoresans. Pou teste si otofluoresans la ta ka yon byomarkè senesans, nou te egzamine konbyen jou vè yo te kapab siviv apre yo te mezire otofluoresans lan sou 13-vè ki gen yon jou. Esperans lavi chak vè a te envers ki gen rapò ak entansite otofluoresans (Fig.3c).

Laflentansite uoresans te ogmante tou nan vè ki grandi ak riboz (Fig.4a); lavi a nan vè sa yo te signififika pi kout pase vè kontwòl yo (Fig.4b). Kontrèman, vè ki grandi sou mwayen ki gen rifampicin, yon bloke AGEs, emèt mwens.fluoresans konpare ak vè kontwòl ki grandi san rifampicin (Fig.4c); efè pro-lonjevite rifampicin te deja rapòte30. Anplis de sa,daf-2, yon mutan reprezantan pro-lonjevite, tou oto-fluoresce mwens konpare ak kalite sovaj la (Fig.4d), pandan y ap laflentansite uorescence nan kalite sovaj la ogmante ak aje.

Yon pòsyon nanfluoresans espere soti nan konpoze ki pwodui an asosyasyon ak lanmò bèt. Ble afluorescence ta ka makè lanmò ki Coburn et al. obsève nanC. eleganspandan plizyè èdtan anvan ak apre lanmò; limyè ble a ta soti nan asid antranilik ki fòme imedyatman apre vè mouri14. Rapòte, lanmòfluoresans emèt pa fòm glikozile asid antranilik ki pwodui nan chemen kynurenine.14. kyu-1Vè mutan, ki manke kynureninase a, yo te kòmsadwa espere pa emèt lanmò afluoresans. Sepandan, menm nan prezans mitasyon sa a, vè ki gen laj toujou parèt emèt pi wofliyoresanspase vè ki pi piti yo (Fig.5a), ak vè ki grandi sou mwayen kwasans nematod (NGM) ki te konplete ak riboz te montre siy.fifipi wofluoresans pase sa yo grandi nan absans la nan riboz siplemantè oswa ak kontwòl sik sorbitol la (Fig.5b). Viv vè yo kenbe ak riboz te evidamman pi kout pase sa lòt yo (Fig.5c), sijere efè pro-aje nan AGEs nan vè.

Idantifikasyon materyèl otofluoresan yoPou idantifye sibstans kifluoresced nan bèt ki aje, yo te fè yon tès LC MALDI sou pwoteyin ekstrè yo. Sis pwoteyin ki pi abondan yo jwenn nan chak echantiyon yo endike nan Tablo a1; miyò, vitellogenin ak faktè elongasyon yo te rich nan mitan tèt yo-45fluorescing pwoteyin nan vè ki pi gran yo. Anplis de sa, lè l sèvi avèk MS gwo rezolisyon ak anviwònman enfòmatik Mascot la, nou te chèche pwoteyin ki te pi abondan nan 15-vè ki gen yon jou pase nan 3-vè ki gen yon jou epi nou te idantifye 180 pwoteyin (Tablo Siplemantè 1).–3). Malgre ke vitellogenin ankò yo te rich (prezan nan nivo sis fwa pi wo nan vè ki pi gran pase nan jèn adilt), nivo faktè elongasyon yo te menm jan an nan de gwoup yo (Siplemantè Fig. 3). Pou verifye si pwoteyin sa yo ta ka glycated pou fòme AGEs otofluoresan, faktè elongasyon pirifye ak vitellogenin yo te enkube ak riboz nan vitro. Fliyoresans ki emèt nan vitellogenin glycated te montre spectre menm jan ak sa yo te jwenn ak ekstrè brit yo te refè nan 17- vè ki gen yon jou (Fig.6a). Malgre ke riboflavin konnenfluoresce, nou te jwenn ke longèdonn nan emisyon nan riboflavin te diferan desa a nan ekstrè vè k'ap manje kadav. Fliyoresans FL nan vitellogenin glycated ak faktè elongasyon yo te sis- ak twa-pliye (respektivman) sa yo ki nan pwoteyin ki pa glicate yo pa 23 jou nan vitro (Fig.6b).

AGE yo te detekte pa Western blotting ak antikò anti-CML yo te ogmante tou sou tan soti nan 3-jou a 13-vè ki gen yon jou nan vivo (Fig.1c). Pa similtane blotting lwès ak antikò anti-vitellogenin, nou te jwenn ke siyal anti-CML yo te menm gwosè ak vitellogenins (Fig.6c). Malgre ke vitellogenin YP170 ak YP115 akimile ak laj pandan peryòd sa a, entansite siyal AGE yo te ogmante pi wo pase ogmantasyon nan kantite vitellogenin YP170 (Fig.6d). Mikwoskopi fluoresans te revele ke 13-vè ki gen yon jou (Fig.7d–f, kolòn 2 ak 3) emèt signififilimyè ble ki pi entans pase 3-jenn adilt ki gen yon jounen (Fig.7a–c, kolòn 2 ak 3; Fig.7g); gonad yo te parèt pi klere tou (Fig.7d–f, kolòn 1 ak 2). CML se yon AGE reprezantan, byenke CML se pa li menm ft fliyoresan. Pentosidine, yon lòt AGE, yo konnen yo dwe fliyoresan. Sepandan, immunostaining ki pa gen ni anti-CML ni anti-pentosidine anti-kò bay diferans enpòtan ant vye ak jèn vè (done yo pa montre). Anti-CML sepandan te montre difize gaye atravè tisi, pandan y ap anti-pentosidine diman te montre sa a.