Diminisyon nan uveit otoiminitè eksperimantal nan rat Lewis pa Betaine

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Uveit otoiminitè eksperimantal (EAU) se yon modèl bèt nan uveit otoiminitè imen ki karakterize pa enfiltrasyon nan selil T otoiminitè ak ogmantasyon konkouran nan sitokin pro-enflamatwa ak espès oksijèn reyaktif. Etid sa a te vize pou evalye si betaine kontwole pwogresyon EAU nan rat Lewis. EAU te pwovoke atravè vaksinasyon ak pwoteyin retinoid-obligatwa interphotoreceptor (IRBP) ak administrasyon oral swa yon machin oswa betaine (100 mg / kg) pou 9 jou youn apre lòt. Larat, san, ak retin yo te pran echantiyon nan rat eksperimantal yo nan moman sakrifis la epi yo te itilize pou tès pwopagasyon selil T, analiz serolojik, reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl, ak imunohistochimi. Egzamen pwopagasyon selil T a te revele ke betaine te gen ti efè sou pwopagasyon selil T larat kont antijèn IRBP nan yon tès in vitro nan jou 9 apre vaksinasyon an. Analiz serolojik la te montre ke nivo serik superoxide dismutase te ogmante nan gwoup la trete betaine konpare ak sa nan gwoup la trete machin.ekstrè cistanche tubulosaEfè anti-enflamatwa betaine konfime pa downregulation nan molekil ki gen rapò ak pro-enflamasyon, ki gen ladan molekil adezyon selil vaskilè I ak interleukin-1 nan retin yo nan rat ak EAU. Konklizyon istopatolojik yo te dakò ak sa yo ki nan molekil adaptè kalsyòm-obligatwa iyonize l imunohistochimik, plis verifye ke enflamasyon nan retin ak kò silyè yo te siyifikativman siprime nan gwoup la betaine-trete konpare ak gwoup la veyikil-trete. Rezilta etid prezan an sijere ke betaine patisipe nan diminye EAU atravè aktivite anti-oksidasyon ak anti-enflamatwa.

Tanpri klike isit la pou konnen plis

Mo kle:Anti-enflamasyon, Anti-oksidasyon, Betaine, uveit otoiminitè eksperimantal, Retin

Entwodiksyon

Homing nan selil T autoraktif ak enfiltrasyon nan selil enflamatwa, tankou monosit, deklanche uveit ak retinit nan EAU [6]. Retin a domaje nan enflamasyon ak aktivasyon nan selil glial ki sibi estrès oksidatif [7].

Betaine, ki rele tou trimethylglycine (CH: NO:), se yon sibstans natirèl alkaloid ak ki pa toksik ki soti nan Fructus Lycia, ak yon sibstans antioksidan reprezantan [8]. Betaine amelyore enflamasyon ki gen rapò ak laj nan rat atravè patisipasyon nikleyè faktè-kB atravè kinaz kinaz faktè nikleyè / I kappa B kinaz ak mitogen-aktive kinaz pwoteyin [9], maladi kadyovaskilè imen pa siprime sitokin enflamatwa, ki gen ladan interleukin (IL) {{ 6}} ak faktè necrosis timè-a (TNF-a) [10], ak silfat dextran sodyòm-induit tumorigenesis kolon [11].revizyon cistanche tubulosa,Anplis de sa, betaine anpeche anjyogenesis patolojik / neovaskularizasyon nan rat ki gen retinit dyabetik [12] ak pwoteje selil ganglion retin yo pou ogmante akwite vizyèl nan yon modèl bèt nan glokòm [13]. Sepandan, gen yon ti kras konnen sou mekanis egzak ki kache efè betaine nan uveit.

Nan etid sa a, yo te evalye efikasite betaine nan soulaje EAU. Nou te envestige efè anti-enflamatwa betaine nan EAU ki baze sou egzamen istopatolojik ak mezi sitokin. Anplis de sa, yo te evalye mekanis espesifik betaine kòm yon antioksidan nan rat ak EAU.

MATERYÈL AK METÒD

Bèt

Tou de sèks rat Lewis (7 ~ 9 semèn; Orient Bio Inc, Gyeonggi-do, Kore) te loje nan etablisman nou an nan kondisyon laboratwa (12-h sik limyè / fè nwa, tanperati 23±2 degre). Tout pwosedi eksperimantal yo te fè swivan Gid pou Swen ak Itilizasyon Bèt Laboratwa nan Inivèsite Nasyonal Jeju (nimewo pèmisyon: 2020-0012). Tout pwotokòl bèt yo konfòme yo ak lwa entènasyonal yo ak règleman NIH, ki gen ladan Swen ak Itilizasyon Bèt Laboratwa yo (piblikasyon NIH No. 85-23, 1985, revize 1996).

Endiksyon nan EAU

Rat yo te iminize ak 200 ul nan yon emulsyon melanje ki konpoze de yon volim egal nan pwoteyin retinoid-obligatwa entèfotoreseptè bovins (IRBP) (I mg / ml; PTARSVGAADGSS-WEGVGVVPDV, Komabiotech, Seoul, Repiblik Kore di) ak adjuvant konplè Freund a (CFA). )sipleman avèk mwen mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) sou pye pye yo nan branch dèyè yo.

Gwoup eksperimantal

Pou evalye efè betaine (Fig.1A) sou EAU, kat gwoup eksperimantal yo te deziyen jan sa a: kontwòl nòmal (n=8); CFA kontwòl (n=8);EAU plis Veyikil (n=8);ak EAU plis Betaine (n=8).Dòz la nan tretman an pou teste efè terapetik betaine (1). 0 mg/kg pwa kò/jou, B2629, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) te chwazi dapre yon etid anvan [14]. Rat yo te trete oralman 9 ak betaine soti nan jou 0 apre vaksinasyon jiska jou 9 apre vaksinasyon an.

Preparasyon tisi

Rat yo te sakrifye anba anestezi pwofon atravè rale gaz CO2 nan jou 9 apre vaksinasyon an.cistanche UKTisi yo pou egzamen istopatolojik yo te entegre nan sir parafin epi yo te seksyone

ak yon mikrotom (RM 2135; Leica, Nussloch, Almay) nan yon epesè 5 um ak tache ak ematoksilin ak eozin. San ak retin yo te estoke nan -80 degre pou analiz serik la ak analiz an tan reyèl reyaksyon chèn polymerase (PCR).

Tès selil T proliferasyon

Selil mononikleyè larat ki soti nan bèt yo nan chak gwoup yo te disosye ak sispann jan sa dekri nan etid anvan nou an [15]. Lè sa a, 10 ug/ml IRBP (konsantrasyon final) te ajoute nan pwi yo. Apre 48 èdtan nan eksitasyon ak IRBP, selil yo te enkube nan 1 μCi nan 'H-methyl thymidine （aktivite espesifik 42 Ci / mmol; Amersham, Arlington Heights, IL, USA) pou 18 h. Lè sa a, selil yo te rekòlte pou mezire enkòporasyon timidin.

Cistanche ka anti-aje

Analiz serolojik

Yo te sakrifye rat yo nan dat echantiyon an, epi yo te kolekte san nan kè a. Yo te separe echantiyon san antye an serom ak selil san yo lè l sèvi avèk yon santrifujeur (VS-5500CFN; Vision Scientific, Daejeon, Repiblik Kore di). Aktivite superoksid dismutase (SOD) nan serom la te evalye lè l sèvi avèk yon twous SOD (ab65354; Abcam, Cambridge, UK).

Imunohistochimi

Yo te fè imunohistochimi lè l sèvi avèk menm pwotokòl ki dekri nan etid anvan nou an [16]. Antikò prensipal yo ki gen ladan iyonize kalsyòm-obligatwa adaptè molekil (Ibal) (1:1, 000;019-19741, Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Osaka, Japon), CD68(ED1;1:800;MCA341,Serotec,Kidlington,UK), ak glutamin sentetaz(GS)(1:5,000;MAB302,Chemicon In -ternational, Temecula, CA, USA) yo te itilize kòm makè pou microg-lia, macrophage ak selil Müller, respektivman.

PCR an tan reyèl

Yo te izole RNA total nan glob je yo nan tout gwoup (n=5 pou chak gwoup) avèk TRIzol RNA Isolation Reagent (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA), epi cDNA te prepare lè l sèvi avèk CellScript M All-in. -Yon 5X Premye Creole cDNA Synthesis Master Mix (CellSafe, Gyeonggi-do, Repiblik Kore di). Enfòmasyon sou primè a nan Tablo 1. Yo te fè PCR ak yon siklis MIC (BMS, Queensland, Ostrali) lè l sèvi avèk 2x SYBR Green (PhileKorea, Seoul, Repiblik Kore di) ak pwogram sa a: 55 sik denaturasyon (5 s, 95). degre), recuit (20 s, 60 degre), ak ekstansyon (10s, 72 degre).

Analiz Western blot

Western blot analiz te fèt pa menm pwotokòl la kòm sa ki dekri nan etid anvan nou an [16].cistanche wirkungAntikò prensipal yo ki gen ladan Kelch-tankou ECH-asosye pwoteyin 1 (Keap1) (1:1, 000; abl19403, abcam, MA, USA), ak faktè nikleyè erythroid-2-re-lated factor2 (Nrf2 )(1:1,000;sc-722,Santa Cruz,CA,USA).

Analiz estatistik

Tout mezi yo rapòte kòm mwayèn twa eksperyans endepandan. Tout valè yo prezante kòm erè estanda mwayèn nan mwayèn (SEM). Rezilta yo te analize lè l sèvi avèk yon analiz yon sèl-fason nan divèjans ki te swiv pa tès la Student-Newman-Keuls posthoc pou konparezon miltip. Yon p-valè<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">

REZILTA

Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 vs.EAU plis Veyikil). Done sa yo endike ke betaine pa te enplike ak IRBP-espesifik selil T oswa oto-reaktivite yo.

Betaine ogmante nivo SOD serom nan EAU

Nou evalye domaj oksidatif nan serik la, lè l sèvi avèk SOD kòm yon makè modifikasyon oksidatif. Pa gen okenn diferans enpòtan yo te obsève ant nòmal ak gwoup CFA yo. Aktivite SOD diminye anpil nan gwoup EAU plis Veyikil la, konpare ak nivo kontwòl nòmal ak gwoup CFA yo. Tretman Betaine siyifikativman retabli nivo aktivite SOD nan kontwòl nòmal ak gwoup CFA (Fig. 2). Rezilta sa a endike ke tretman an betaine siprime estrès oksidatif nan rat ak EAU.

Betaine redwi enfiltrasyon nan selil Ibal-pozitif nan kò silyè yo ak retin nan rat EAU-induit.

Kò silyè a se sit prensipal enfiltrasyon selil enflamatwa akòz abondans veso sangen yo [18]. Se sèlman kèk selil wonn-kalite yo te detekte nan kò yo silyè nan gwoup nòmal ak CFA (Fig. 3A, 3B), tandiske enfiltrasyon an nan kèk selil wonn-kalite te konfime nan gwoup yo EAU-induit (flèch nan Fig.3C). ,3D). Nòmal (Fig.3E) ak CFA (Fig.3F) gwoup yo toujou parèt rezilta ki sanble ak sa yo obsève pou iminoreaktivite Ibal. Ibal-pozitif iminoreaktivite ogmante nan gwoup EAU plis Veyikil ak EAU plis Betaine (tèt flèch nan Fig.3G, 3H). Sepandan, kantite selil Ibal-pozitif diminye anpil nan gwoup EAU plis Betaine konpare ak gwoup EAU plis Veyikil la (figi 3I). Nou te analize tou lokalizasyon EDI kòm yon apwòch plis pou evalye kote egzak enfiltrasyon selil enflamatwa nan kò silyè a. Selil ED1-pozitif yo te raman detekte nan nòmal (figi 3G) ak CFA (figi 3K). )gwoup. Kontrèman, yo te detekte anpil selil ED1-nan gwoup EAU plis Veyikil ak EAU plis Betaine (doub flèch nan Fig.3L,3M).bioflavonoid CitrusYon analiz semi-kantitatif sou kantite selil ED1-pozitif te konfime ke tretman betaine te siprime enfiltrasyon selil enflamatwa nan kò silyè rat ki te pwovoke EAU yo.

Apre sa, nou te envestige chanjman istopatolojik nan retin lan (Fig. 4). Yon kèk selil enflamatwa yo te detekte nan retin ak EAU, men se pa nan retin nòmal ak CFA rat (Fig.4A ~ 4D). Blesi yo te bay nòt istopatolojik dapre gravite EAU [17], revele soulajman nan enflamasyon retin (Fig.4E). Aktivasyon selil Microglial ak Müller ki endike enflamasyon retin yo te konfime ki baze sou global (Fig.4F ~ 4I) ak iminoreaktivite GS (Fig.4K ~ 4N), respektivman. Lokalizasyon Ibal nan microglia te trè ra nan gwoup nòmal ak CFA (tèt flèch nan Fig. 4F, 4G, respektivman). Aktivasyon nan microglia te inibit nan EAU rat (flech nan Fig.4H) pa tretman an betaine (Fig.4I, 4J). Rezilta iminoreaktivite GS-pozitif la te sanble ak sa mondyal nan retin a (Fig.4K ~ 4N). Selil Müller aktive nan gwoup EAU plis Veyikil la te gen pi ba nivo GS-iminoreaktivite (figi 40).

Betaine siprime molekil adezyon ak medyatè pro-enflamatwa nan EAU

Apre sa, nou egzamine ekspresyon molekil adezyon lè l sèvi avèk PCR an tan reyèl (figi 5A). Yo te obsève yon gwo diminisyon nan nivo adezyon selil vaskilè 1(VCAM1)mRNA nan gwoup EAU plis Betaine (p).<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">

Betaine ogmante anzim antioksidan katalaz (CAT) ak SODinEAU

Etid la nan nivo domaj oksidatif nan serik la pouse nou mennen ankèt sou sitiyasyon repons antioksidan nan anzim antioksidan, ki gen ladan CAT, SOD1, SOD2, ak SOD3(Fig.5C). Nou te obsève nivo ekspresyon siyifikativman regilasyon nan CAT, SOD1, SOD2, ak SOD3 nan je yo nan gwoup EAU plis Betaine konpare ak gwoup EAU plis Veyikil la.

Betaine aktive chemen Keapl-Nrf2

Pou sipòte efè anti-oksidatif betaine, yo te egzamine chemen Keapl-Nrf2 (figi 6). Nivo pwoteyin Keapl (0.75±0.05 pliye chanjman,p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">

konpare ak kontwòl nòmal la. Nan lòt men an, Keapl la ak Nrf2 te montre swa 1.46±0.00 chanjman pliye oswa 1.13±0.34 chanjman pliye nan sa yo ki nan EAU plis Vehide gwoup la (p<0.01 and=""><0.001,>

DISKISYON

Sa a se premye etid ki rapòte ke betaine diminye pwogresyon patojèn EAU atravè efè anti-enflamatwa ak anti-oksidan, men se pa pa siprime pwopagasyon selil T (Illustrasyon Schematic nan Fig.7).

Efè regilasyon betaine nan maladi otoiminitè kòm evidans lè l sèvi avèk EAU, yon pwototip nan maladi otoiminitè, yo panse ke yo dwe akòz rediksyon nan estrès oksidatif ak medyatè pro-enflamatwa, men se pa pwopagasyon selil T, pa betaine [19]. Menm jan an tou, etid prezan an te revele ke betaine te gen ti efè sou pwopagasyon selil T ak pwofil cytokine nan supernatant kilti a nan yon modèl EAU, sijere ke betaine pa enfliyanse repons iminitè a nan pwopagasyon selil T otoiminitè nan EAU. Uvea a se yon ògàn sib nan EAU. Uvea a ak retin yo se ògàn iminolojik izole san lenfatik [20]. Selil T otoiminitè yo nan EAU yo anvayi atravè yon branch nan atè silyè ak oftalmik [21]. Estrès oksidatif se yon siyal enpòtan nan pwogresyon repons enflamatwa ak ogmante espès oksijèn reyaktif la lakòz malfonksyònman andotelyal ak blesi tisi [22]. Selil andothelial yo detounen mennen nan pwomosyon nan pasaj nan selil enflamatwa ak molekil enflamatwa [22]. Medyatè enflamatwa ak selil nan uvea yo deklanche nan selil epitelyal pigman retin yo, ki deranje jonksyon ki genyen ant selil baton ak kòn ak selil epitelyal pigman, ki mennen nan yon retin detache [23]. Kò silyè a se yon sit antre pou enflamasyon okulèr. Enflamasyon tipik retin enplike nan aktivasyon an nan microglia rezidan ak enfiltrasyon nan selil enflamatwa akòz dekonpozisyon nan baryè san-retin [24]. Anba kondisyon neropatolojik yo, ki gen ladan timè nan sèvo [25], axotomi [26], ak enfeksyon viris [27], macrophages aktive yo ak mikroglia yo te distenge pa Ibal. Anplis de sa, aktive microglia rezidan yo patisipe nan chanjman patolojik ki fèt nan maladi dejeneratif retin yo ak lage medyatè enflamatwa ki agrave pwosesis maladi a [28]. Rezilta sa yo sijere ke betaine egzèse efè anti-enflamatwa nan kò a uvea ak silyè, objektif prensipal yo nan EAU, epi li ka diminye estrès oksidatif nan serik la. Sepandan, mekanis egzak la rete yo dwe etidye.

Mikroglia aktive se sous prensipal sitokin pro-enflamatwa anba kondisyon dejeneratif retin [29]. Sitokin pro-enflamatwa, ki gen ladan IL ak TNF, yo fòtman asosye ak enflamasyon okilè [30] ak retinit [6,29]. Anplis mikroglia a, selil Müller yo aktive anba tout evènman patolojik ki rive nan retin la [31]. Selil Müller aktive yo patisipe nan efè neuroenflamatwa nan retin a lè yo fè sentèz ak divilge molekil ki gen rapò ak enflamasyon [31]. Nou postule ke betaine diminye repons enflamatwa nan rat EAU-induit pa siprime aktivasyon an nan mikroglia ak selil Müller. Regilasyon VCAMl trè enplike nan enfiltrasyon selil enflamatwa yo [32].VCAMl se akselere nan CD4 Tlym-fagosit atravè diskisyon kwaze ak antijèn an reta -4[3].Anplis de sa, Serpina3n, yon anzim ki inisye. enflamasyon [34], yo te detekte nan selil Müller, astrosit, ak epiteli pigman retin nan retin ki domaje limyè [35] e li gen nivo siyifikativman varyab nan retin Nrl'mouse ak selil kòn ki gen pwoblèm [36].Serpina3n ogmante nan EAU. rat ak enflamasyon retin grav men diminye anpil nan gwoup EAU trete betaine. Yo te rapòte yon rezilta menm jan an pou eskizofreni ak neroenflamasyon [34], kòm murin Serpina3n se yon orthologue nan Serpina3 imen [37]. Anplis de sa, yo te obsève yon ogmantasyon nan IL-1 nan blesi retinn ki te lakòz gwo fruktoz [38]. Nou postule ke efè anti-enflamatwa betaine ki asosye ak règleman desann nan VCAM1, Serpina3n, ak IL-1 nan rat EAU-induit. Yo itilize chemen Keep-Nrf2 pou kontwole estrès oksidatif [39]. Betaine te konnen kòm yon molekil anti-oksidan, ki te asosye ak chemen Keapl-Nrf2 nan modèl blesi egi nan fwa asetaminofèn [40]. Anplis de sa, yo te fè pwofil ekspresyon jèn epatik la apre tretman 3H-1,2-dithiole-3-thione, ki gen wòl nan amelyore dezentoksikasyon nan kanserojèn ak pwoteje kont neoplasi [4]. Rezilta profilage sa a te revele ke Keap1-Nrf2 reglemante nrf2-depandan 3H{-1,{2-dithiole-3-thione-induire jèn, ki gen ladan AF033381, kòm betaine homocysteine ​​methyl transferase, te ogmante, ak patisipe nan dezentoksikasyon an ak anti-oksidasyon [41]. Repons enflamatwa nan EAU te pwovoke pa enfiltrasyon selil enflamatwa, tankou selil T ak makrofaj [42], ak pwodiksyon estrès oksidatif, espesyalman nan fotoreseptè mitokondri nan etap bonè [43]. Dapre rezilta sa yo, tretman betaine te yon kandida pou soulaje domaj tisi EAU-induit pa modulasyon chemen Keap1-Nrf2 a, kòm yon chemen kle nan règleman estrès oksidatif.

Efè antioksidan betaine te lajman evalye nan modèl blesi radikal-induit [44].Nan levodopa-induit oksidatif-domaj sèvo a, betaine te amelyore nan nivo yo nan CAT ak SOD, ki se reprezantan anzim antioksidan [4]. SOD1, SOD2, ak SOD3 yo aktive pa diferan mekanis epi yo lokalize nan sitoplasm, mitokondri, ak matris ekstraselilè, respektivman [45]. Betaine, kòm yon molekil anti-oksidatif, patisipe nan diminye domaj oksidatif [46]. Estrès oksidatif redwi a te pwolonje pou rezoud enflamasyon an, ki endike nan Ibal-pozitif macrophages/microglia nan anpil maladi, ki gen ladan maladi alzayme a, maladi Parkinson la, ak paralezit miltip [47]. Tretman an betaine te kontwole nivo mRNA nan makè estrès oksidatif, konpare ak sa yo ki nan gwoup la EAU plis Veyikil. Rezilta sa a implique ke tretman an betaine redwi estrès oksidatif nan sistèm sikilasyon an san yo pa entèfere ak pwopagasyon selil T nan ògàn iminitè yo nan modèl EAU rat la.

Ansanm, etid prezan an sijere ke betaine ka bese enflamasyon nan retin yo ak kò silyè nan rat EAU-induit, petèt atravè mekanis anti-oksidasyon ak anti-enflamasyon.

Atik sa a soti nan https://doi.org/10.5607/en21011