Pwoteyin 75 ki kontwole mòtalin/glikoz fè pwomosyon rezistans nan kansè nan gastric Cisplatin.

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé

Tretman dwòg Platinum se youn nan estrateji chimyoterapi ki pi enpòtan pou pasyan ki gen kansè nan gastric (GC). Sepandan, efè a terapetik se mwens pase satisfezan, lajman akòz rezistans nan akeri nan dwòg platinum. Se poutèt sa, yon pi bon konpreyansyon sou mekanis ki kache yo ka amelyore anpil efikasite terapetik nan GC. Nan etid sa a, nou vize pou mennen ankèt sou fonksyon/mekanis ki gen rapò ak chimyo-rezistans ak siyifikasyon klinik pwoteyin 75 ki reglemante glikoz (GRP75) nan GC. Isit la, done nou yo te montre ke konpare ak selil SGC7901, ekspresyon nan GRP75 te ansibleman pi wo nan rezistans cisplatin (selil (SGC7901 *). Knockdown nan GRP75 aboli antretyen nan potansyèl manbràn mitokondriyo (MP) ak inibit faktè nikleyè erythroid {{ 10}}faktè ki gen rapò 2 (NRF2), fosfatidilinositol 3 kinaz/pwoteyin kinaz B (Pl3K/AKT), faktè ipoksi-inducible 1a (HIF-1a), ak c-myc, ki te lakòz bloke aktivasyon an nan sib en yo. Pwosesis sa yo diminye kapasite anti-oksidasyon/apoptoz ak chanje metabolik repwogram nan selil SGC7901 ", ki mennen ale nan re-sansiblite selil sa yo nan cisplatin. Sepandan, twòp ekspresyon nan GRP75 nan selil SGC7901 te lakòz efè opoze. Yon modèl xenografts konfime rezilta yo mansyone anwo a.Nan pasyan GC ki resevwa chimyoterapi platinum ak yon meta-analiz, yon wo nivo GRP75 te asosye pozitivman ak karakteristik agresif ak move pronostik ki gen ladan men pa limite a gastr. kansè nan entesten, e li te yon prediktè endepandan pou siviv an jeneral. Ansanm, etid nou an te endike ke GRP75 te enplike nan rezistans cisplatin nan GC e ke GRP75 ta ka yon sib potansyèl terapetik pou restore repons dwòg la nan selil rezistans platinum ak yon zouti pronostik aditif itil nan gide jesyon klinik pasyan GC.

Tanpri klike isit la pou konnen plis

Entwodiksyon

Kansè gastric (GC) te premye ensidans dirijan ak dezyèm mòtalite dirijan nan kansè nan sistèm dijestif nan peyi Lachin. Tretman aktyèl pou GC avanse yo te operasyon an operasyon konbine avèk chimyoterapi sistemik, men to a siviv alontèm te mwens pase satisfezan paske nan segondè repetisyon apre-chirijikal la. GC chimyoterapi 3. Sepandan, rezistans akeri nan dwòg toujou rive apre sik miltip nan tretman ki baze sou platinum epi li endike yon pronostik pòv.sistanchSe poutèt sa, limine mekanis potansyèl yo ak idantifye nouvo estrateji terapetik yo simonte rezistans platinum dwòg nan pasyan GC yo te ijan esansyèl.

Cistanche ka anti-aje

Pwoteyin glikoz-reglemante 75 (GRP75) se te chaperon molekilè estrès-induzibl ki te fè pati fanmi pwoteyin chòk chalè4. Twò ekspresyon GRP75 te asosye byen ak pwogresyon timè nan divès kansè imen 5-7. Isit la, atravè eksplore yon meta-analiz, nou te jwenn ke yon nivo segondè nan GRP75 endike yon pronostik siyifikativman pòv nan plizyè kansè nan sistèm dijestif (kansè kolorektal, cholangiocarcinoma, ak kansè nan pankreyas). Pou rezistans dwòg, anpèchman nan GRP75 ranvèse rezistans nan cisplatin ak doxorubicin nan karsinom epatoselilè ak kansè nan ovè". timè pozitif te gen yon pi mal pronostik konpare ak timè negatif GRP75 nan GC ak fonksyon nòmal p53. Sepandan, p53 se te youn nan jèn ki pi souvan mitasyon nan GC (ki afekte plis pase 50 pousan nan pasyan) l2-15. Se konsa, nou te fè ipotèz ke anplis de represyon klasik nan aktivite p53, GRP75 ta ka patisipe nan pwovoke / kenbe rezistans nan dwòg platinum nan GC atravè anplwaye yon fason endepandan.

Nan etid sa a, ekspresyon ki pi wo nan GRP75 kontribye nan rezistans cisplatin nan selil SGC7901 ak nan yon modèl xenografts. Mekanistikman, GRP75 pwovoke / kenbe rezistans cisplatin atravè reglemante kapasite anti-oksidasyon / apoptotik ak pwopriyete metabolik repwogram-ming.cistanche OstraliNan pasyan GC, ekspresyon GRP75 kontribye nan karakteristik agresif yo ak move pronostik. Rezilta nou yo endike ke GRP75 ankouraje rezistans cisplatin nan GC epi li ta ka yon byomarkè pou predi repons lan nan tretman dwòg platinum.benefis cistancheVize GRP75 ta ka bay yon nouvo konpreyansyon sou chimyoterapi sistemik GC.

Rezilta yo

Efè GRP75 sou rezistans cisplatin nan tès viabilite GC selil yo te anplwaye pou verifye rezistans selil SGC7901 ~, Ipsos (uM) cisplatin pou selil SGC7901 ak SGC7901CR yo te: 5.518 vs.72.46 (Fig. 1A). Ki baze sou baz done KM-Plotter, ekspresyon an ogmante nan GRP75 endike yon pronostik pòv (Fig.1B). Anplis, siyifikativman ogmante ekspresyon GRP75 nan selil SGC7901CR konpare ak selil SGC7901 paran li yo (figi 1C), sijere ke GRP75 ta ka kontribye nan rezistans cisplatin la. Pou verifye ipotèz sa a, selil SGC7901 ~ yo te transfekte pa scramble- oswa GRP75 siRNA, ak IC50s yo (uM) nan cisplatin pou scrambled- oswa GRP75 siRNA transfekte SGC7901CK selil yo te: 50.83 vs.20.86, respektivman. .1D). Kontrèman,

twòp ekspresyon nan GRP75 pa transfekte plasmid GRP75 yo nan selil SGC7901 te montre ke IC50s yo nan cisplatin pou scramble- oswa GRP75 plasmid transfekte selil SGC7901 yo te 3.825 vs.6.98 (Fig.1E). Ansanm, rezilta sa yo te revele ke GRP75 te jwe yon wòl enpòtan nan kenbe / pwovoke rezistans cisplatin nan GC, men mekanis yo te rete plis envestigasyon.

Mekanis potansyèl ki kache GRP75 te lakòz rezistans sisplatin

Nou telechaje datasets microarray GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) ak GSE14209 (tisi, cisplatin-rezistan vs cisplatin-sansib) soti nan GEO, Lè sa a, nou fè pwosesis la GO-Biyolojik ak KEGG-Pathway anrichisman analiz ki baze sou DAVID, rezilta yo te montre nan Fig.2A-D. Diferans esansyèl nan pwosesis byolojik ant selil SGC7901C * ak selil SGC7901 yo enkli rediksyon oksidasyon, pwosesis apoptotik (figi 2A), analiz anrichisman KEGG-Pathway te jwenn ke ansanm DEG yo te byen korelasyon ak chemen metabolik, ak fosfatidilinositol 3 kinaz B / pwoteyin kinaz. (PI3K/AKT) chemen (Fig. 2B). Repons nan dwòg la te enkli nan diferans ki genyen esansyèl nan pwosesis byolojik ant cisplatin ki reziste ak tisi timè cisplatin-sansib ak chemen metabolik la te tou lyen debaz la nan analiz anrichisman KEGG-Pathway (Fig.2C, D). Anplis de sa, yon rezo 60 pwoteyin ki te siyifikativman kominike avèk GRP75 te konstwi lè l sèvi avèk baz done a String, Lè sa a, analiz KEGG-Pathway pa-fòme ke chemen metabolik te jwe yon wòl enpòtan ant GRP75 ak entèraktè li yo (Fig. 2E). Dapre rezilta sa yo, nou te sipoze ke anti-oksidasyon / apoptoz ak repwogram metabolik ta ka ankouraje siviv ak kwasans nan GC ki mennen nan rezistans sisplatin. Sepandan, mekanis yo nan patisipasyon GRP75 nan règleman bezwen plis etid (Fig. 2F).

Efè GRP75 sou anti-oksidasyon ak anti-apoptoz Isit la, nivo ROS intraselilè a te elve nan selil SGC7901CR an konparezon ak tokay paran li yo (Fig. 3A), sijere ke selil SGC7901Ck yo te ekspoze a relativman pi wo kondisyon estrès oksidatif. Yon etid anvan te revele ke GRP75 te enplike nan estabilizasyon MMP, yon sous enpòtan nan jenerasyon ROS. Isit la, knockdown nan GRP75 aboli antretyen nan MMP nan selil SGC7901CK pwovoke pa cisplatin, ak twòp ekspresyon nan GRP75 te gen efè opoze a nan selil SGC7901 (figi 3B).kolestewòl cistancheLè sa a, nou valide relasyon ki genyen ant GRP75 ak anti-oksidasyon ak anti-apoptoz. Jan yo montre nan Fig. 3C, knockdown nan GRP75 diminye nivo faktè nikleyè erythroid-2-faktè 2 (NRF2) ak jèn en sib li yo (HO-1 ak NQO-1) nan SGC7901. ~ selil, ak ekspresyon GRP75 te montre efè opoze a nan selil SGC7901 yo. Anplis, knockdown nan GRP75 oswa NRF2 nan selil SGC7901CR plis amelyore jenerasyon entraselilè ROS yo, apoptoz (figi 3D), ak aktivite caspase -3 (figi siplemantè S1) pwovoke pa cisplatin. Kontrèman, twòp ekspresyon GRP75 nan selil SGC7901 siyifikativman atenue jenerasyon ROS ki te pwovoke cisplatin, apoptoz selil (figi 3E), ak aktivite kapase -3 (figi siplemantè S1). Rezilta sa yo revele ke GRP75 kenbe / pwovoke sisplatin-rezistans ta ka atravè pwovoke anti-oksidasyon ak anti-apoptoz nan selil GC.

Efè GRP75 sou rprogramasyon metabolik Apre sa, nou te envestige plis kote GRP75 pwovoke chanjman nan repwogram metabolik. Ogmante prèv te montre ke metabolis selil timè yo pa t 'yon chanjman nòmal nan yon sèl chemen metabolik, men yon repwogram nan tout rezo metabolik selilè a. Anpil onkogen klasik oswa chemen siyal yo te enplike dirèkteman oswa endirèkteman nan repwogram metabolik, tankou PI3K / AKT, ipoksi-induzibl faktè la (HIF-la), c-myc, ak sou sa "'819. Se poutèt sa, nou verifye si GRP75 te Patisipe nan repwogram metabolik selil GC Jan yo montre nan Figi 4A, nou te obsève nivo p-AKT, HIF-la ak c-myc ogmante nan selil SGC7901CR konpare ak selil SGC7901 paran li yo. GRP75 diminye nivo pwoteyin cisplatin-induit p-AKT, HIF-la, ak c-Myc, ak objektif en yo ki gen rapò ak glikoliz (HK2: hexokinase 2; PDK1: pyruvate dehydrogenase kinase l; ak LDHA: lactate dehydrogenase A chèn). Okontrè, twòp ekspresyon nan GRP75 nan selil SGC7901 te montre efè opoze a (figi 4B, C). Anplis de sa, kraze GRP75 oswa AKT nan selil SGC7901CR te montre yon diminisyon enpòtan nan absorption glikoz ak viabilite / kwasans selil ki pwovoke pa cisplatin; sepandan, twòp ekspresyon nan GRP75 nan selil SGC7901 ansibleman ogmante kapasite nan absorption glikoz ak viabilite / kwasans selil ki te koze pa cisplatin (Fig. 4D-F). Ansanm, done sa yo endike ke GRP75 kenbe / pwovoke rezistans cisplatin nan selil GC yo ta ka atravè patisipe nan p-AKT, HIF-la, ak c-myc medyatè repwogram metabolik.

Konfimasyon done yo in vitro nan yon modèl xenograft Lè sa a, nou envestige potansyèl enpòtans klinik GRP75 nan vivo. Done xenograft yo endike ke tretman ak cisplatin pou kont li oswa knockdown nan GRP75 pou kont li ta ka anpeche kwasans lan timè; sepandan, tretman cisplatin konbine avèk knockdown GRP75 siyifikativman fasilite anpèchman sisplatin-induit nan kwasans timè (figi 5A). Anplis, tès IHC ak qPCR te montre ke cisplatin plis GRP75 siRNA siyifikativman diminye ekspresyon yo nan Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT, ak sib en konpare ak tretman cisplatin pou kont li, men ogmante apoptoz la (jan yo detèmine pa tach TUNEL, Fig. 5B. , C). Kolektivman, rezilta sa yo endike ke, atravè reglemante kapasite yo anti-oksidasyon / anti-apoptoz ak repwogram metabolik, GRP75 ankouraje siviv nan vivo ak kwasans ki an vire mennen nan rezistans cisplatin nan GC.

Idantifikasyon GRP75 kòm yon faktè karakteristik kansè-pwomosyon ak siyifikasyon klinik GRP75 nan GC

Lè sa a, nou evalye ekspresyon GRP75 nan seksyon youn apre lòt nan echantiyon GC. Jan yo montre nan Fig. 6A, konpare ak tisi gastric adjasan ki pa timè, yo te obsève yon elevasyon konsiderab nan ekspresyon GRP75 nan tisi GC. Yo te demontre twòp ekspresyon nan GRP75 nan tisi GC pa nòt IHC-entansite (figi 6B). Pi fò tach pou GRP75 te tou obsève ak ogmante TNM Klasifikasyon nan etap timè malfezan (Fig. 6C, D). Lè sa a, nou divize 116 espesimèn GC sa yo an de gwoup ("GRP75 low" vs." GRP75 high", dapre IHC-entansite, Fig. 6E). Dyamèt transverse timè yo nan gwoup "GRP75 segondè" yo te siyifikativman pi gwo pase sa yo ki nan gwoup "GRP75 ba" (figi 6F). Nou plis valide pronostik klinik GRP75 nan GC. Analiz siviv Kaplan-Meier te montre tou ke pasyan GC nan gwoup "GRP75 segondè" te gen yon siviv pi mal pase sa yo ki nan gwoup "GRP75 ba" (Fig. 6G).

Analiz miltivarye idantifye ke GRP75 te yon prediktè endepandan pou siviv an jeneral (Tablo 1).efè segondè cistanche deserticola,An rezime, rezilta sa yo sijere ke GRP75 te gen yon wòl karakteristik nan dirijan pwogresyon GC, rezistans cisplatin, ak move pronostik. Meta-analiz nan nivo segondè nan GRP75 ak pronostik dyagram nan koule nan rechèch la literati ak seleksyon ak meta-analiz yo te montre nan Figi siplemantè S2. Modèl efè o aza ak modèl efè fiks yo te itilize pou kalkile ak analize valè HR, tou de nan yo te montre nivo segondè nan GRP75 yo siyifikativman asosye ak rezilta pasyan pòv yo. HR nan pisin te 1.91 (95 pousan CI 1.62 a 2.25), ak etewojenite (I'=0.0 pousan, p =0.559) (Fig. 7A). Lè sa a, nou te fè yon analiz sougwoup, ki te montre ke nivo ekspresyon GRP75 nan kansè nan gastwoentestinal (rezidan HR te 1.99,95 pousan CI 1.64 a 2.43), gen yon relasyon enpòtan ak pronostik siviv pòv. Sètènman, rezilta menm jan an yo te jwenn tou nan lòt timè (poz HR te 1.74,95 pousan CI 1.29 a 2.33) (Fig.7B). Tou de

Yo te itilize trase antonwa Begg a ak tès Egger a pou evalye patipri piblikasyon posib etid enkli yo. Nan analiz asosyasyon ki genyen ant GRP75 ak OS, valè p tès Begg ak tès Egger yo te 0.0 76 ak 0.024, respektivman (Fig.7C ak D). Sepandan, tès Egger a gen yon pi gwo sansiblite nan evalye patipri piblikasyon. Kidonk, metòd taye ak ranpli yo te itilize pou fè rezilta nou yo pi kredib. Jan yo montre nan Fig. 7E, HR ajiste nan modèl efè fiks la te 1.785 (95 pousan CI 1.530 a 2.081, p.<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Diskisyon

Nan etid sa a, nou te itilize youn nan ajan chimyoterapi premye liy pou pasyan ki gen GC, dwòg platinum. Klasikman, dwòg platinum ta ka kovalans mare nan guanine sou chèn ADN la epi konsa, bloke replikasyon an ak transkripsyon nan DNA2. Sepandan, akòz rezistans dwòg ak efè segondè endezirab, idantifye nouvo estrateji ki ka geri pou ranvèse rezistans nan pasyan GC te ijan esansyèl. Anplis de sa, pasyan GC devlope rezistans dwòg apre yo fin resevwa plizyè kou nan cisplatin, ak rezilta nou yo te montre ke SGC7901 ~ selil yo te montre siyifikatif rezistans nan cisplatin an konparezon ak selil SGC7901.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) te jwe yon wòl kle nan reglemante inisyasyon ak pwogresyon kansè imen-7. Plis dènyèman, li te vin klè ke GRP75 tou te gen yon wòl kritik nan rezistans chimyoterapi ". Anplis GRP75, lòt pwoteyin chòk chalè te jwe wòl enpòtan nan rezistans sisplatin atravè PI3K/AKT/NF-KB ak lòt chemen 21-24 Sepandan, mekanis molekilè GRP75 ak rezistans cisplatin te raman rapòte.Isit la, etid nou an te revele ke GRP75 ankouraje kapasite anti-oksidasyon / apoptoz ak chanje repwogram metabolik, ki mennen nan rezistans cisplatin nan selil GC. Nou te jwenn tou ke GRP75 te regilasyon nan SGC7901 ~ selil yo ak nan echantiyon tisi ki soti nan pasyan yo, epi li te korelasyon ak rezistans dwòg, pro-siviv, kwasans, ak rezilta pòv. Pandan se tan, analiz miltivarye idantifye ke GRP75 te yon prediktè endepandan pou siviv an jeneral. Anplis, meta-analiz endike ke yon nivo segondè nan GRP75 te montre move pronostik ki gen ladan men se pa sa sèlman GC, ki te trè konsistan avèk rechèch nou an. Tout rezilta ki anwo yo valide ke vize GRP75 te kapab. dwe espere vin yon nouvo apwòch ranvèse rezistans nan cisplatin ak amelyore pronostik la nan pasyan GC.

Anba kondisyon fizyolojik, selil yo te inevitableman ekspoze a ROS soti nan faktè ekstèn ak metabolis aerobic entraselilè. Kòm yon nepe de bò, ROS apwopriye yo te molekil siyal enpòtan ki kontwole fonksyon nòmal selil yo, pandan y ap twòp ROS te mennen nan apoptoz. Se poutèt sa, yon sistèm règleman antioksidan egzak te egziste nan kò a pou kenbe balans redox ak pwosedi apoptotik 20. Sepandan, kontrèman ak kondisyon fizyolojik, nivo ROS nan timè yo te jeneralman siyifikativman pi wo pase kontwòl nòmal nan menm orijin tisi a, ki te detèmine egzistans lan nan yon espesyal. sistèm anti-oksidan nan selil timè yo, espesyalman pou selil timè ki reziste dwòg 27-29. Rezilta nou yo te konfime ke selil SGC7901CR te montre yon nivo relativman pi wo nan ROS an konparezon ak selil SGC7901 e ke, GRP75 elve kapasite yo nan anti-oksidasyon / apoptoz. Selil timè yo te gen yon istwa long nan anomali metabolik yo. Osi bonè ke ane 1930 yo, Otto Warburg te dekouvri ke selil timè yo prefere glikoliz. Menm anba kondisyon oksijèn ase, selil timè yo toujou kenbe gwo pousantaj glikoliz pou jenerasyon ATP. Modèl metabolik nòmal sa a te rele "efè Warburg" 3031. Efè Warburg te dirije chanjman metabolik dènyèman yo te refere yo kòm repwogram metabolik, ak etid sou chanjman sa yo te bay yon konpreyansyon pi fon nan metabolis selil GC. Li te demontre ke selil GC ak selil nòmal yo te montre diferans metabolik pa sèlman nan metabolis glikoz, men tou nan metabolis lipid ak asid amine³2-35. Nan rechèch sa a, nou te jwenn ke chanjman nan metabolis glikoz se te youn nan debaz yo. lyen kenbe kwasans selil, evantyèlman mennen nan rezistans GC cisplatin.

Kòm nou mansyone, onkogen klasik ak chemen siyal tankou PI3K / AKT, HIF-la, ak c-myc te patisipe dirèkteman oswa endirèkteman nan repwogram metabolik. Aktivasyon chemen PI3K/AKT nan selil timè yo te ogmante anpil aktivite metabolik yo. Premyèman, li pèmèt selil yo absorption nan glikoz, asid amine, ak lòt eleman nitritif. Dezyèmman, AKT ogmante glikoliz ak pwodiksyon laktat atravè efè li sou ekspresyon jèn ak aktivite anzim e li te ase pou pwovoke yon efè War-burg nan selil kansè yo. Twazyèmman, deklanchman chemen sa a amelyore byosentèz makromolekil ak ankouraje ekspresyon jèn lipojenik ak sentèz lipid. Anplis de sa, GRP 75-aktive AKT ak kinaz pwoteyin ekstraselilè ki kontwole siyal 1 ak 2 inibi chanjman konformasyon Bax ak apoptoz 8. Selil timè yo adapte ak ipoksi ki enplike repwogram metabolik yo atravè regilasyon jèn HIF-la sib pou ankouraje absorption glikoz, glikoliz, pwodiksyon ak sekresyon nan asid laktik, depo glikojèn, glutamin chat-abolism³, ak ankouraje akimilasyon nan trigliserid nan ti gout lipid³. VDAC1 ak HK2, ki anpeche apoptoz '. C-myc te kapab medyatè rprogrammasyon metabolik nan yon kantite fason, ak c-myc-medyatè repwogram metabolik te lajman reyalize pa afekte mitokondri. Sou yon bò, c-myc tou ankouraje glikoliz pa dirèkteman reglemante ekspresyon de glycolytic ki gen rapò ak anzim, ki gen ladan LDHA, HK2, ak PDK11938.On lòt men an, c-myc aktive anzim ki enplike nan metabolis glutamin atravè transcription ankouraje itilizasyon an nan glutamin pa mitokondri nan selil timè yo. Efè sa a rele "glutaminolysis". Anplis de sa, GRP75-ekspresyon twòp redwi Cyclin-B1 epi kontwole Cyclin-D1 ak c-myc pou ankouraje kwasans selil kansè nan ovè*. Dapre rezilta prezan nou yo, nou bay yon nouvo konpreyansyon sou rezistans GC cisplatin atravè GRP75 kòm yon lyen potansyèlman enpòtan nan règleman an nan rezo repwogram metabolik timè yo.

Konklizyon

An konklizyon, nou demontre ke twòp ekspresyon nan GRP75 ta ka ankouraje siviv / kwasans nan selil GC pa reglemante anti-oksidasyon / apoptoz ak rezo repwogram metabolik, kidonk pwovoke rezistans cisplatin.

Materyèl ak metòd

Selil, reyaktif, ak kondisyon kilti

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 pousan pite), yo te achte nan men Sigma-Aldrich (Shanghai, Lachin). Selil yo te kiltive nan mwayen RPMI-1640(Gibco, Grand Island, NY, USA), konplete ak 10 pousan serom fetal bovine (FBS), 100 U/ml penisilin, 100 ug/ml streptomycin (Gibco), epi yo te enkube. nan 5 pousan CO2 nan 37 degre. Pou antretyen fenotip rezistans cisplatin, selil SGC7901CR yo te enkube nan yon mwayen ki gen cisplatin （5μM）.

Xenografts ak tretman

Etid sa a te apwouve pa Nanjing Medikal Inivèsite Enstitisyonèl Swen bèt ak Komite Itilizasyon, ak bèt yo te trete imanite ak ak konsiderasyon soulajman nan soufrans. Sourit toutouni BALB/c yo te jwenn nan SLRC Laboratory Animal Center (Shanghai, Lachin) ak konvansyonèl kenbe jan nou te dekri deja * l. Pou etid la xenograft, 2 × 10 degre selil SGC7901CK nan 100ul matrigel yo te enjekte anba lar nan flan sourit yo pou 5 semèn. Pou detèmine efè GRP75 sou rezistans cisplatin nan GC, nou te fè tès piki intratumoral ak entraperitoneal la. Yon ti tan, sourit yo te owaza divize an 4 gwoup (5 sourit pou chak gwoup): (1)MOCK, (2)GRP75KD, (3)MOCK＋cisplatin, ak （4） GRP75 KD＋cisplatin. 100ul nan siRNA (si-Con oswa si-GRP75, 100nM) yo te piki entratumoral chak 3 jou. Gwoup yo sibi terapi cisplatin (5 mg / kg) yo te piki entraperitoneal 3 fwa pa semèn ak lòt gwoup yo te perfused ak yon volim egal nan saline. Yo te mezire timè yo chak semèn epi yo te kalkile volim yo avèk fòmil la: V=Y (lajè2 longè). Apre 5 semèn, sourit yo te sakrifye, ak tisi timè yo te retire pou plis envestigasyon.

Pasyan ak tisi espesimèn

Etid sa a te apwouve pa Komite Etik Medikal nan Dezyèm Lopital Afilye, Nanjing Medical University, ak Afilye Changzhou No 2 Lopital Nanjing Medical University ak konsantman ekri patisipan an te jwenn nan chak pasyan. Done klinik-patolojik yo te ekri nan Tablo Siplemantè S1. Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Shanghai, Lachin) te konstwi microarray tisi a jan nou te dekri deja*

Transfèksyon selilè

Pou transfèksyon, grenpe ak pcDNA-3.1-GRP75-Jeneral Biotech (Shanghai, Lachin) te sentèz drapo; pandan y ap siRNA yo te nan lis nan Tablo Siplemantè S2. Selil yo te transfekte tanporèman atravè reyaktif lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, USA), dapre pwotokòl manifakti a. Yon ti tan, selil yo te plake sou plak 6-byen nan yon dansite 1 × 10 degre selil nan mwayen RPMI 1640 ki gen 10 pousan FBS san antibyotik. Apre enkubasyon pou 24 èdtan, selil yo te transfekte tanporèman ak 5 ng/ml grenpe oswa GRP75-Flag, oswa 20 nM si-Con oswa si-GRP75 pou 12 èdtan. Apre transfeksyon, selil yo te kiltive nan yon mwayen fre ki te konplete ak 10 pousan FBS pou yon lòt 24 èdtan anvan yo te itilize pou lòt eksperyans.

Kantitatif reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl (qPCR) Jadendanfan yo itilize yo te ki nan lis nan Tablo Siplemantè S3. Izolasyon total RNA, transkripsyon RNA pou cDNA, ak pèfòmans qRT-PCR ak Applied Biosystems 7300HT machin yo te tout dapre etid anvan nou an 2. -aktin a te amplifiée pou asire cDNA entegrite ak pou nòmalize ekspresyon. Chanjman pliye nan ekspresyon chak jèn yo te kalkile pa yon metòd konparatif papòt sik (Ct) lè l sèvi avèk fòmil 2-(4ACt)

Atik sa a soti nan Dai et al. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w