Konparezon ant QPCR ak RNA-seq revele defi pou kwantifye ekspresyon HLA Pati 1

Résumé

Antijèn leukosit imen (HLA) klas I ak II se eleman esansyèl nan iminite natirèl ak akeri. Fonksyon yo gen ladan prezantasyon antijèn nan selil T ki mennen nan repons iminitè selilè ak umoral, ak modulasyon selil NK yo. Enfliyans eksepsyonèl yo sou rezilta maladi yo kounye a te fè klè pa etid asosyasyon genomic-lajè. Ekson yo ki kode Groove nan peptide-obligatwa yo te konsantre prensipal la pou detèmine efè HLA sou sansiblite maladi / patojèn. Sepandan, nivo ekspresyon HLA yo te enplike tou nan rezilta maladi, ajoute yon lòt dimansyon nan divèsite ekstrèm HLA ki afekte varyasyon nan repons iminitè atravè moun.

Gen yon relasyon sere ant antijèn leukocyte ak iminite. Leukocyte antigen refere a molekil la sou sifas globil blan imen, ki ka idantifye ak distenge diferan kalite selil ak patojèn. Li se yon pati enpòtan nan sistèm iminitè imen an ak yon regilatè enpòtan nan repons iminitè.

Diferans nan antijèn leukocyte ka lakòz diferan repons iminitè ak sansiblite maladi. Pa egzanp, sèten antijèn leukosit yo asosye ak maladi otoiminitè, maladi enfeksyon, ak timè. Ekspresyon sèten antijèn leukosit gen rapò tou ak fonksyon ak kantite selil iminitè yo.

Se poutèt sa, konprann karakteristik molekilè sifas leukosit yon moun gen gwo siyifikasyon pou evalye sitiyasyon iminitè moun nan ak risk ak pronostik maladi a. An menm tan an, li se tou fezab nan fòmilasyon an nan tretman pèsonalize ak mezi prevansyon. Soti nan pwen de vi, nou bezwen amelyore iminite. Cistanche gen yon efè enpòtan sou amelyore iminite. Cistanche se moun rich nan divès sibstans antioksidan, tankou vitamin C, ak karotenoid engredyan sa yo ka retire radikal gratis, diminye estrès oksidatif, ak amelyore rezistans nan sistèm iminitè a.

Klike sou poud extrait cistanche tubulosa

Pou estime ekspresyon HLA, etid iminojenetik tradisyonèlman konte sou PCR quantitative (qPCR). Adopsyon de teknoloji altènatif wo-debi tankou RNA-seq te antrave pa pwoblèm teknik akòz polimorfism ekstrèm nan jèn HLA. Dènyèman, sepandan, plizyè metòd byoenfòmatik yo te devlope pou estime avèk presizyon ekspresyon HLA soti nan done RNA-seq. Sa a ouvè yon opòtinite enteresan pou quantifier ekspresyon HLA nan gwo datasets men tou pote kesyon sou si rezilta RNA-seq yo konparab ak sa yo pa qPCR. Nan etid sa a, nou analize twa klas done ekspresyon pou jèn HLA klas I pou yon seri moun ki matche: (a) RNA-seq, (b) qPCR, ak (c) ekspresyon HLA-C sifas selil. Nou te obsève yon korelasyon modere ant estimasyon ekspresyon ki soti nan qPCR ak RNA-seq pou HLA-A, -B, ak -C ({{10}}.2 Mwens pase oswa egal a rho Mwens pase oswa egal a 0.53 ). Nou diskite sou faktè teknik ak byolojik ki bezwen konsidere lè n ap konpare quantifications pou diferan fenotip molekilè oswa lè w ap itilize diferan teknik.

Mo kle

HLA · Ekspresyon · PCR · RNA-seq.

Entwodiksyon

Ekspresyon jèn bay yon fenotip molekilè ki chita nan yon pozisyon entèmedyè ant varyasyon jenetik ak fenotip konplèks, tankou estati maladi. Konprann baz jenetik ekspresyon jèn yo kapab estratejik pou fè lyen ant varyasyon jenetik ak fenotip konplèks (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), ki gen ladan sansiblite nan maladi otoiminitè ak enfektye. Malgre ke etid la nan varyasyon jenetik nan moun leukocyte antigen (HLA) loci, ak nan rejyon an pi gwo istokonpatibilite konplèks (MHC) an jeneral, yo te itilize diseksyon baz jenetik la nan plizyè maladi konplèks (Trowsdale and Knight 2013; Dendrou et al. . 2018), enklizyon de fenotip molekilè, an patikilye sa yo ki asosye ak ekspresyon jèn, se konparativman resan (Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

Rejyon MHC imen an sou kwomozòm 6p21 montre yon gwo dansite jèn, ak modèl inik nan dezekilib lyen (LD) ak polimòfis ekstrèm (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). Rejyon MHC a gen HLA klas I ak II loci ki kode molekil ki enplike nan deklanche ak modulation repons iminitè a. Molekil HLA klas I yo eksprime pa pifò selil nuklee yo epi jeneralman prezante peptides intraselilè nan selil CD8 plis T. Kontrèman, molekil HLA klas II yo eksprime prensipalman pa selil pwofesyonèl ki prezante antijèn, epi yo prezante nan CD4 plis selil T antijèn ekzojèn ki te entènalize pa andositoz. Klas I molekil yo rekonèt tou pa reseptè sou selil asasen natirèl (NK), killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIRs), ki afekte tou de edikasyon ak aktivasyon nan selil NK (Colonna and Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). Pèsonaj diferan alotip HLA klas I ak molekil KIR espesifik enfliyanse aktivite selil NK (ak yon sou-ansanm CD8 plis selil T), sa ki lakòz risk diferansye kansè, maladi enfeksyon, ak otoiminite (revize nan Kulkarni et al. 2008).

Asosyasyon maladi HLA yo te prensipalman atribiye a diferans espesifik alèl nan prezantasyon antijèn, akòz polimorfism yo vaste nan Groove nan peptide-obligatwa. Sepandan, nivo ekspresyon HLA kontribye nan kèk nan asosyasyon yo obsève ant polimorfism HLA ak rezilta maladi. Nivo ekspresyon HLA se yon modifikasyon enpòtan nan otoiminite ak nan fòs la nan HLA-medyatè repons iminitè a nan kansè ak enfeksyon (revize nan René et al. 2016).

Gen plizyè egzanp asosyasyon ant nivo ekspresyon HLA ak rezilta enfeksyon viral. Li byen dokimante, pa egzanp, ki pi wo nivo ekspresyon HLA-C, nan nivo mRNA ak pwoteyin sou sifas selil la, asosye ak pi bon kontwòl VIH -1 (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. al. 2011; Apps et al. 2013; Parolini et al. 2018; Bachtel et al. 2018), tandiske ekspresyon HLA-A ki wo asosye avèk pwoblèm kontwòl VIH (Ramsuran et al. 2018). Enfeksyon SARS-CoV-2 kontwole ekspresyon jèn HLA-C (Loi et al. 2022) ak ekspresyon HLA klas I sou sifas selil la (Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023), osi byen ke klas HLA. II ekspresyon jèn, ki gen ladan HLA-DPA1, -DPB1, -DRA, ak -DRB1 (Wilk et al. 2020).

Anplis de sa, gen asosyasyon ant nivo ekspresyon HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) ak HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) ak clearance HBV; Ekspresyon HLA-DRA ak sansiblite pou enfeksyon pa viris Grip A nan baton nan liy selil imen (Karakus et al. 2019); ak asosyasyon vaste ant varyant regilasyon ak nivo ekspresyon nan jèn HLA klas II, ki gen ladan HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1, ak -DRB5 ak repons antikò kont plizyè viris répandus (Kachuri et al. 2020).

Nivo ekspresyon HLA loci yo asosye tou ak otoiminite (gade Johansson et al. 2022 pou yon revizyon). Nivo ekspresyon HLA-C nan sifas selil la (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), osi byen ke nivo HLA-G sou sifas selil la ak nan plasma (da Costa Ferreira et al. 2021), yo te asosye. ak risk pou maladi enflamatwa entesten. Ogmantasyon ekspresyon HLA-B27 sou sifas selil la te obsève nan mitan pasyan ankylosing spondylitis (Cauli et al. 2002), menm jan an jeneral HLA klas I ekspresyon nan mitan pasyan maladi Graves '(Weider et al. 2021). Nivo ekspresyon HLA klas II enfliyanse tou risk kondisyon otoiminitè yo.

Ekspresyon jèn HLA-DQA1 ak -DRB1 ak ekspresyon molekil DQ ak DR sou sifas selil la ogmante nan monosit san periferik pasyan vitiligo (Cavalli et al. 2016); varyant regilasyon ki asosye ak pi wo ekspresyon jèn HLA-DQA1, -DQB1, ak -DRB1 ak ekspresyon DQ ak DR sou sifas selil la asosye ak risk pou lupus sistemik eritematos (Raj et al. 2016); Ekspresyon jèn HLA-DRB5 pi wo nan pasyan sklerodèrma ak maladi nan poumon entèstisyèl (Odani et al. 2012); espesifik HLA-DRB1 alèl yo trè eksprime nan pasyan atrit rimatoyid (Houtman et al. 2021); ak ekspresyon ki pi wo nan DRB1 * 15:01 asosye ak risk pou paralezi miltip (Alcina et al. 2012). Se poutèt sa, konprann varyasyon ekspresyon HLA nan mitan moun ak mekanis ki kontwole nivo ekspresyon HLA yo pral kle pou dekouvri baz jenetik fenotip maladi yo.

Tradisyonèlman, ekspresyon HLA te estime pa teknik ki baze sou antikò pou nivo ekspresyon nan sifas selil la (Thomas et al. 2012; Apps et al. 2013) oswa pa PCR quantitative (qPCR oswa RT-PCR) pou nivo transkripsyon mRNA (Bettens et al. al. 2014; Ramsuran et al. 2015, 2017). Li difisil pou konpare rezilta atravè etid oswa menm konpare diferan HLA loci nan menm etid la paske yo itilize diferan pwosedi eksperimantal pou chak analiz ak pou chak lok HLA, ki ka lakòz efikasite anplifikasyon diferan nan qPCR oswa afinite antikò nan sikometri koule.

Teknoloji wo-debi tankou RNA-seq bay estimasyon ekspresyon pou tout jèn yo nan genòm nan, ki gen ladan jèn HLA, kidonk pèmèt evalyasyon an nan ekspresyon HLA nan yon kontèks genòm lajè. Sepandan, teknoloji sa yo pote anpil defi lè yo itilize pou estime nivo ekspresyon jèn HLA yo. Anplis de patipri byen dokimante ki asosye ak tès RNA-seq (egzanp, efè pakèt, preparasyon bibliyotèk, kontni GC ('t Hoen et al. 2013), difikilte pou estime nivo ekspresyon pou jèn HLA rezilta nan lefèt ke quantifikasyon an. enplike nan aliyman nan lekti kout nan yon genòm referans, ki pa bay yon reprezantasyon konplè sou divèsite alelik HLA.

Se poutèt sa, kèk lekti ka echwe pou fè aliman akòz gwo kantite diferans konsènan genòm referans la (Brandt et al. 2015). Anplis de sa, jèn HLA yo se yon pati nan yon fanmi jèn ki fòme apre jij siksesif nan repetisyon epi yo souvan gen segman ki sanble anpil ant paralòg, kidonk sa ki lakòz kwa-aliyman nan mitan jèn yo ak quantification partial nan nivo ekspresyon. Difikilte sa yo te motive devlopman tiyo enfòmatik (gade Johansson et al. 2022 pou yon revizyon) ki reprezante divèsite HLA li te ye nan etap aliyman an epi yo te montre yo bay nivo ekspresyon egzat pou jèn HLA (Boegel et al. 2012; Lee et al. al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020).

Pandan ke tou de apwòch RNA-seq ak qPCR estime ekspresyon HLA pa quantifier abondans nan transkripsyon, metòd yo enplike diferan pwosedi eksperimantal ak byoenfòmatik pwosesis. Dapre konesans nou, yon konparezon quantitative nan rezilta ki soti nan RNA-seq ak sa ki sòti nan qPCR pou jèn HLA yo pa te fèt. Nan etid sa a, nou te chache konpare diferan teknik ak molekilè fenotip pou quantification de HLA klas I ekspresyon, kenbe nan tèt ou ke pa gen okenn teknik ka konsidere kòm yon estanda lò. Pou diminye efè varyasyon teknik ak byolojik nan konparezon etid diferan, nou te fè yon tès RNA-seq sou yon seri 96 moun pou ki estimasyon ekspresyon qPCR te disponib (pou HLA-A, -B, -C), ak pou yon sou-ansanm ki HLA-C ekspresyon sifas selil ki baze sou antikò te disponib tou. Kantifikasyon RNA-seq yo te fèt ak yon tiyo HLA ki pwepare ki pèmèt pou estimasyon ekspresyon egzat, minimize patipri apwòch estanda ki depann sou yon sèl jenom referans.

Materyèl ak metòd

Echantiyon yo

Yo te jwenn echantiyon san nan men 96 donatè san ki an sante ki enskri nan pwogram donatè volontè nan Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR). Yo te jwenn konsantman enfòme alekri nan tout matyè yo ak espesimèn yo te anonim pa pwosedi IRB apwouve nan Enstiti Nasyonal Kansè. RNA yo te ekstrè nan frèch izole selil mononikleyè san periferik (PBMC) lè l sèvi avèk RNeasy Universal twous la (Qiagen). RNA te trete ak DNAse RNAse-gratis pou retire ADN jenomik. Total RNA extrait de PBMCs te quantitated itilize HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences). Tout echantiyon ki te montre yon nòt kalite RNA ki pi gran pase 8 yo te itilize nan analiz ekspresyon jèn yo.

Sezisman HLA

Alèl HLA yo te detèmine pa sekans Sanger. Anplis de sa, nou te kouri HLApers (Aguiar et al. 2019) ak Kourami (Lee and Kingsford 2018) pou dedwi alèl HLA ki soti dirèkteman nan RNAseq epi tcheke si akò ak apèl ki baze sou sekans Sanger yo. Si nou konsidere apèl ki konsistan ant HLApers ak Kourami, nou obsève sèlman 10 diskòdans ak apèl Sanger yo soti nan 288 konparezon (3 loci × 96 moun). Pifò nan yo (n=5) te montre sipò nan men RNA-seq pou yon alèl ki trè pre youn ki detèmine pa sekans Sanger, kidonk nou te chwazi kenbe apèl ki baze sou RNA-seq yo. Pou 3 jenotip, nou obsève apèl omozigot soti nan RNA-seq gen anpil chans paske yon sèl alèl pa te eksprime, epi nou kenbe apèl yo soti nan sekans Sanger. Sa a pa gen enpak sou estimasyon ekspresyon, paske pa gen okenn lekti ki aliman ak alèl la pa detekte atravè RNA-seq. Pou yon sèl jenotip, nou te obsève bon sipò pou yon apèl eterozigòt tandiske sekans Sanger yo te rele yon omozigòt. Nan ka sa a, nou te kenbe apèl ki baze sou RNA-seq la paske li pi byen eksplike lekti yo obsève yo. Pou yon apèl alèl, nou konsidere kòm yon erè nan apèl ki baze sou RNA-seq akòz kouvèti lekti ensifizan.

Quantitative PCR (qPCR)

Nivo transkripsyon HLA mRNA pou HLA-A, -B, ak -C yo te mezire pa qPCR nan yon tès ki asire anplifikasyon san patipri nan alèl komen yo nan chak locus pandan y ap evite anplifikasyon nan tout lòt loci. Jadendanfan yo itilize yo te: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTGTTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). Transkripsyon ranvèse te fèt lè l sèvi avèk twous RNA-to-cDNA High-Capacity (Applied Biosystems). Anplifikasyon HLA ak mikwoglobulin 2 microglobulin (B2M) kDNA yo te fèt lè l sèvi avèk Power SYBR green master mix (Applied Biosystems), sou yon machin ABI 7900HT. Sekans Primer pou B2M yo dekri nan Tablo S4 nan Kulkarni et al. (2013). Yo te nòmalize nivo ekspresyon mwayèn chak jèn HLA ak sa ki nan B2M epi yo te kalkile lè l sèvi avèk metòd 2-∆∆Ct (kote Ct se sik papòt la).

Mwayèn nivo ekspresyon alèl espesifik nan alèl HLA komen yo te estime pa yon modèl lineyè jan sa dekri nan Ramsuran et al. (2015). Espesyalman, nou modle ekspresyon kòm yon fonksyon lineyè nan de alèl yo pote pa chak moun ak ekstrè efè yo nan chak alèl sou ekspresyon jèn. Nou te fè etap sa a nan R (gade seksyon disponiblite Kòd).

Ekspresyon sifas yo

Ekspresyon sifas selil HLA-C yo te mezire sou CD3 plis selil ki soti nan PBMC ki fèk izole pa sikometri koule lè l sèvi avèk antikò monoklonal HLA-C-espesifik DT9 (Apps et al. 2013). Pou analiz HLA-A nan yon ti gwoup moun ki pote A*03 ak A*11, nou tache selil ak antikò 0554HA (One Lambda, Inc.).

RNA-seq

preparasyon RNA

RNA-seq te fèt sou RNA ki estoke nan -80 degre. RNA total te quantifye lè l sèvi avèk Qubit RNA HS Assay (Thermo Fisher). Kalite RNA te evalye lè l sèvi avèk yon enstriman 2100 Bioanalyzer ak yon Agilent 6000 RNA Pico Kit (Agilent Technologies). Pou chak echantiyon, yo te itilize 500 ng total de RNA kòm opinyon pou preparasyon bibliyotèk antye transcriptome rRNA-apovri. Yo te prepare yon bibliyotèk adaptè-ligated ak KAPA HyperPrep Twous (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) lè l sèvi avèk Adaptè Kod Bar ADN Bioo Scientific NEXTfex™ (BioScientifc, Austin, TX, USA) dapre pwotokòl KAPA bay.

rRNA Depletion lè l sèvi avèk RiboErase

RNA ribozomal te apovri pa enkubasyon RNA total ak sond konplemantè ak sekans rRNA. Apre ibridizasyon, yo te itilize RNase H pou degrade anzimatik rRNA. Yo te fè netwayaj ak dijesyon DNase lè l sèvi avèk Kapa Pure Beads ak DNase dapre pwotokòl Kapa.

Fragmantasyon, sentèz cDNA, ak konstriksyon bibliyotèk

Echantiyon rRNA-apovri yo te fragmenté nan 85 degre pou 4.5 min nan prezans mayezyòm anvan sentèz 1ye ak 2yèm strand ak reyaksyon A-Tailing. NEXTfex DNA Barcoded Adapters (1.5 uM) yo te ligated ak A-tailed cDNA ak yon kòd bar inik pou chak echantiyon. Pwodwi yo te pirifye ak Kapa Pure Beads epi yo te fè 8 sik nan Anplifikasyon Bibliyotèk. Apre anplifikasyon, yo te fè yon netwayaj final bibliyotèk, epi yo te evalye quantifikasyon bibliyotèk ak QC lè l sèvi avèk Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) ak Agilent DNA HS kit sou enstriman 2100 Bioanalyzer la.

Sekans

Bibliyotèk sekans multiplexed ki kapab lakòz yo te itilize nan fòmasyon gwoup sou yon Illumina cBOT (Illumina, San Diego, CA, USA) epi yo te fèt sekans lè l sèvi avèk yon Illumina HiSeq 2500 swiv pwotokòl Illumina bay pou 2 × 126 bp sekans fen pè. Chak transcriptom te sekans nan yon pwofondè sib nan 40-50 milyon lekti.

RNA-seq sou echantiyon fre ki soti nan 11 moun

Pou mennen ankèt sou posiblite pou degradasyon echantiyon materyèl ki estoke nan -80 degre anvan sekans RNA, yon sous potansyèl dezakò ak estimasyon qPCR, nou rale san ki soti nan 11 donatè epi fè RNA-seq sou nouvo echantiyon yo. Eksperyans lan te fèt ak preparasyon bibliyotèk la menm ak metòd anvan, men sekans lè l sèvi avèk yon NextSeq Illumina ak 2 × 150 pb lekti.

Kantifikasyon ekspresyon pou RNA-seq

Referans transcriptom

Nou te itilize Salmon (Patro et al. 2017) pou estime nivo ekspresyon pou tout transkripsyon ki te note nan baz done Gencode v37. Nou itilize tout opsyon pou koreksyon patipri sou Salmon (patipri GC, patipri pozisyon, ak patipri sekans espesifik).

Pèsonalize

Menm jan ak "Ref transcriptome", men ak transkripsyon HLA pèsonalize dapre jenotip HLA-A, -B, ak -C chak moun pote. Pèsonalizasyon an te fèt pa aliman sekans pou alèl HLA genomic referans la ak genomic a pou jwenn kowòdone yo. Lè sa a, lè nou itilize aliyman milti-sekans nan alèl ki prezan sou genòm referans lan ak tout lòt alèl yo (ki disponib nan IPD-IMGT/HLA lage 3.43.0 (Robinson et al. 2020)), nou atribiye jenomik. pozisyon nan tout alèl HLA. Finalman, nou te konstwi yon transkripsyon pèsonalize ki baze sou konbinezon enfòmasyon sou kowòdone transkripsyon ak sekans alèl HLA a. Pwosedi sa a te fèt nan R (R Core Team 2020), lè l sèvi avèk pake Biostrings (Pagès et al. 2020) ak pake meta tidyverse (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com