CRISPRi-medyatè Kontwòl reglabl nan nivo ekspresyon jen ak Enjenieri yon sèl-gid RNA nan Escherichia Coli

REZIME

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-pliye). SgRNAs sa yo te pèmèt tou regilasyon modilè ak divès sekans ADN sib. Nou aplike sistèm sa a pou redistribiye flux metabolik pou pwodwi dérivés violacein nan yon rapò previzib ak optimize pwodiksyon likopèn. Sistèm sa a ta ede akselere pwosesis optimize flux nan jeni metabolik ak byoloji sentetik.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ENTWODIKSYON

Tip II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-asosye (Cas) sistèm se yon sistèm klivaj ADN ki gide RNA ki konpoze de CRISPR RNA (crRNA), trans-aktive CRISPR RNA (tracrRNA) ak yon pwoteyin Cas9 (1). ,2). Cas9 soti nan Streptococcus pyogenes te lajman itilize nan jeni genomic akòz pwopriyete byen karakterize li yo (3,4). Konplèks pwoteyin spCas9, tracrRNA, ak crRNA mare ak klive protospacer ADN sib la konplemantè ak sekans spacer 20 nukleotid (nt) crRNA nan prezans 5'-NGG-3' protospacer adjasan motif (PAM). ) sekans (5,6). Pou senplifye sistèm nan, yo ka itilize RNA gid sèl chimerik (sgRNA) kote crRNA ak tracrRNA yo ansanm ak yon linker atifisyèl ki rele tetraloop (5). Li pèmèt pou ranplase de RNAs separe ak yon sèl molekil RNA, fè sistèm nan pi jere. Youn nan sistèm ki baze sou CRISPR yo, CRISPR entèferans (CRISPRi), itilize yon Cas9 katalitik inaktif (dCas9) lè li ranplase sèten asid amine ki soti nan chak domèn endonukleaz (7). Modifikasyon sa a fè yon konplèks ribonukleoprotein (RNP) ki ka dirije ak mare nan sib ADN ak entèfere ak RNA polymerase (RNAP) pou anpeche inisyasyon transcription oswa elongasyon (7). Kontrèman ak yon knockout pa sistèm CRISPR/Cas9, CRISPR pèmèt pou knockdown revèsib jèn yo lè li eksprime dCas9 oswa sgRNA anba yon pwomotè inducible, sa ki pèmèt pou plis fleksibilite nan règleman jèn (7). Sistèm CRISPRi te efektivman silans jèn sib plizyè santèn fwa (7,8). Represyon jèn espesifik sib pèmèt fenotip wo-debi lè l sèvi avèk yon pisin sgRNA nan tout genòm (9) oswa redireksyon flux kabòn nan bakteri enjenyè nan direksyon chimik sib la (10-12). Anplis de sa, yo te demontre CRISPRi multiplex nan plizyè lame lè l sèvi avèk yon varyete metòd pou eksprime stab plizyè sgRNA, ki gen ladan etalaj crRNA long, entegrasyon switch toehold, ak etalaj sgRNA ekstralong ki pa repetitif (13-16). Teknik sa yo pou anpeche plizyè jèn ansanm yo te itilize pou fè travay pi konplèks, tankou diminye entèmedyè toksik oswa bloke chemen konpetisyon nan fèmantasyon bakteri (13,16-19). Sepandan, represyon konplè pa toujou dezirab pou jeni metabolik. Nivo ekspresyon jèn yo ta dwe kontwole jisteman pou reyalize aktivite anzim optimal ant wout kwasans ak pwodiksyon, balanse nan konsantrasyon précurseur entraselilè epi evite akimilasyon entèmedyè toksik (20-22). Yo devlope plizyè teknik pou enjenyè efikasite represyon CRISPRi. Plizyè faktè yo te manipile, tankou kantite sgRNA ak dCas9 pwoteyin oswa chwa sgRNA. Kontwole ekspresyon dCas9 oswa toude ekspresyon dCas9 ak sgRNA lè l sèvi avèk yon pwomotè enduzib kontwole ekspresyon jèn sib pa plis pase 30-pliye oswa 300-pliye, respektivman (23,24). Sepandan, li te obsève ke modulation konsantrasyon dCas9 ka mennen nan efikasite represyon konsistan sou diferan protospacers (23). Kantite limite pwomotè inductible disponib tou fè defi konsepsyon malgre anpil efò (25). Yon lòt estrateji se ensèsyon yon aptamer RNA ligand-espesifik nan sgRNA a, kote yon ti molekil parèy ka ekspoze spacer la, konsa pèmèt kontwòl dòz CRISPRi (26). SgRNA espesifik ligand la itil si gen yon pè ligand ak aptamer apwopriye ki disponib. Distans ki soti nan sit la kòmanse transkripsyon ak oryantasyon nan dCas9 obligatwa tou afekte efikasite nan CRISPRi (7). Ajiste distans ki genyen ant sit la obligatwa sgRNA ak sit la kòmanse transkripsyon ka optimize chemen an nan jeni metabolik (17,27,28). Efikasite ibridizasyon ant sekans spacer ak protospacer chanje tou RNP efikasite obligatwa konplèks (29-31). Se poutèt sa, dezakò ki fèt deyò rejyon an grenn pou chanje enèji gratis la te prezante pou divèsifye efikasite CRISPRi (31,32). Sepandan, konsepsyon sgRNA a obligatwa pou chak nouvo sekans sib, epi reyalize yon diferans enpòtan nan enèji gratis atravè sèlman yon dezakò ka difisil. Anplis, gen yon posibilite pou ogmante obligatwa nan sib (33). Men, li toujou limite a jisteman reprime ekspresyon jèn miltip nan yon fason modilè kèlkeswa sekans sib la. Nan etid sa a, nou devlope yon sistèm CRISPRi reglabl ki kontwole ekspresyon jèn ak gwo presizyon ak previzibilite. Nan klasman selilè iteratif ki baze sou fliyoresans bibliyotèk sgRNA ki vize tetraloop ak rejyon flanke li yo, nou te reyalize efikasite represyon transcriptional jiska 45-pliye menm lè ADN sib la chanje. Sistèm sa a pèmèt pou redistribisyon previzib nan flux metabolik san yo pa manipile genomic lame a oswa chemen sentetik, bay yon zouti pwomèt pou optimize chemen metabolik yo.

MATERYÈL AK METÒD

Tansyon bakteri, plasmid, ak reyaktif

Tansyon Escherichia coli ak plasmid yo itilize nan etid sa a yo endike nan Tablo Siplemantè S1. Jadendanfan yo itilize nan etid sa a yo endike nan Tablo Siplemantè S2. Pwosedi klonaj yo dekri nan metòd siplemantè yo. Jèn sib ak sekans ADN sib yo pou sistèm CRISPR yo montre nan Tablo Siplemantè S3. Yo te itilize Mach1-T1R pou klonaj jeneral. Bibliyotèk la te konstwi ak NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). Kilti woutin pou konstwi plasmid ak tansyon yo te fèt nan 37 ◦C nan bouyon Luria-Bertani (LB) oswa sou yon plak agar LB ki gen antibyotik apwopriye (34 g/ml kloranfenikòl, 50 g/ml spektinomisin). Yo te fè PCR lè l sèvi avèk Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Plasmid ak pwodwi PCR yo te pirifye lè l sèvi avèk GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit ak Gel SV Twous (GeneAll Biotechnology). Efikasite represyon sgRNA mutan yo te rafrechi medya kilti lannwit lan nan OD600 nan 0.05 ak enkubasyon jiskaske li rive nan yon valè ant 0.6 ak 0.8. Lè sa a, medya kilti yo te dilye nan OD600 nan 0.05 ak 20 ng / ml nan aTc ak enkube pou 4 èdtan. Yo te mezire fliyoresans yon sèl koloni nan 575 nm/616 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate Hidex Sense (Hidex), epi yo te detèmine valè OD600 lè l sèvi avèk espektrofotomèt Jenway 7300 (Jenway). Fluoresans relatif la te kalkile kòm inite fliyoresans pou chak valè OD600, ak valè pou PC mete kòm 100%.

Efè Cistanche tubulosa-trete konstipasyon

tès depistaj bibliyotèk sgRNA

Yo te itilize menm metòd kiltirèl ki dekri anwo a. Medya kilti yo te dilye nan [selil]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

RNA ekstraksyon

Total RNA te ekstrè lè l sèvi avèk RNeasy Mini Kit (Qiagen) sèlman lè miRNeasy Mini Kit (Qiagen) pou quantification sgRNA, apre tretman ak RNAprotect Bakteri Reagent (Qiagen) ak depo nan -80 ◦C. Dijesyon ADN sou kolòn lè l sèvi avèk RNase-Free DNase Set (Qiagen) te pote soti pandan pwosesis ekstraksyon an. Kontaminasyon ADN te verifye atravè PCR san transkripsyon ranvèse. Konsantrasyon ak pite chak echantiyon yo te detèmine lè l sèvi avèk yon NanoDrop One (Thermo Scientific), epi yo te evalye bon jan kalite a lè l sèvi avèk yon ADN 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) sou yon LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Analiz RT-qPCR

Jadendanfan pou RT-qPCR yo te swa soti nan stock laboratwa oswa yo te fèt lè l sèvi avèk zouti Primer3Plus la (34) ak ki nan lis nan Tablo Siplemantè S4. Jèn CysG la te itilize kòm yon jèn referans (35) pou tout eksperyans RT-qPCR. Yon koub estanda te pwodwi lè 10-pliye dilye yon modèl soti nan 107 kopi/l rive nan 10−1 kopi/l. Limit quantification te detèmine pa anfòm nimewo kopi ak pousantaj anplifikasyon pozitif nan yon fonksyon sigmoid ak kalkile 95% valè nimewo kopi pozitif. Ranje dinamik lineyè a te defini kòm nimewo kopi ki pi ba nan ki varyasyon Cq tounen kalkile a se mwens pase 35%. Valè Cq pi wo pase 30 oswa sa yo ki pa anplifye nan kontwòl ki pa modèl yo te valide. Done koub estanda yo disponib nan Tablo Siplemantè S5 ak Figi Siplemantè S1. Yo te itilize yon total de 2.5 ng nan RNA total nan yon reyaksyon RT-qPCR 10 l ak Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB). RT-PCR te fèt an triple sou StepOnePlus™ RealTime PCR System (Applied Biosystems) ak etap sa yo: (i) ranvèse transkripsyon nan 55◦C pou 10 min, ki te swiv pa denaturasyon nan 95◦C pou 1 min; (ii) 40 sik tèmik nan 95◦C pou 10 s ak 60◦C pou 1 min; (iii) analiz koub fonn nan 95 ◦ C pou 15 s ak 60 ◦ C pou 1 min, ki te swiv pa yon ranp soti nan 60 ◦ C rive 95 ◦ C nan yon pousantaj de 0.3 ◦ C / min. Yo te detèmine quantification relatif RNA a lè l sèvi avèk metòd delta-deltaCt (36) epi analize ak StepOnePlus™ Software (Applied Biosystems).

RNA-sekans (RNA-seq) ak analiz done

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 ki baze sou FPKM (Fragman pou chak kilobaz relve nòt pou chak milyon lekti kat). Jèn ki eksprime diferan yo te jwenn nan papòt 1.5 (ki baze sou log2-) ak 0.01 (valè q).

Pwodiksyon ak echantiyon pwoviolasein ak prodeoxyviolacein

Pou pwodiksyon violacein ak prodeoxyviolacein, yo te itilize konpozisyon mwayen sa a: 10.7 g/l K2HPO4, 5.2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}}.2 g/l ekstrè ledven, ak 1{{20}} g/l glikoz. Yo te rafrechi yon medya kilti lannwit lan nan yon OD600 nan 0.1 ak kiltive jiskaske OD600 rive ant 0.6 ak 0.8. Lè sa a, medya kilti yo te dilye nan OD600 nan 0.1 ak konplete ak 500 ng / ml aTc, 0.05 mM IPTG, ak 0.1 g / l L-triptofan nan yon volim final nan 5 ml. Yo te pran echantiyon 300 l nan medya kilti ak santrifuje nan 14 000 rpm pou 5 min pou jwenn yon grenn selil pou analiz HPLC, epi yo te pran echantiyon 300 l nan medya kilti pou fè ekstraksyon RNA.

Analiz HPLC

Pou analiz via biosentetik violacein, grenn selil yo te resuspende nan {{0}}methanol volim, sonike pou 5 min, santrifuje, epi filtre nan yon 0.22-m filtè nilon. Analiz HPLC te swiv metòd (42) ak Poroshell 12 0 EC-C18, 4.6 × 150 mm, 4 m kolòn (Agilent). De faz mobil, A ak 0.1% asid fòmik nan DDW ak B ak 0.1% asid fòmik nan asetonitrile, yo te itilize nan yon pousantaj koule nan 0.6 ml / min ak pwofil gradyan sa a: 95% A pou 1.5 min, ramping A soti nan 95. % a 2% pou 4 min, kenbe 2% A pou 2 min, ramping A soti nan 2% a 95% pou 30 s, epi kenbe 95% A pou 10 min. Echantiyon yo te detekte lè l sèvi avèk yon detektè PDA, epi yo te detèmine zòn HPLC nan 600 nm pou violacein ak 610 nm pou prodeoxyviolacein.

Pwodiksyon likopèn ak echantiyon

Pou pwodiksyon likopèn, yo te itilize konpozisyon mwayen sa a: 13.56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0.1 ml 1 M CaCl2 ak 4 g/l glikoz (22). Yo te itilize 27 g/ml kloranfenikòl ak 50 g/ml spectinomicin. Yo te rafrechi yon medya kilti lannwit lan nan OD600 nan 0.1 nan yon volim final 5 ml. Lè OD600 rive nan ant 0.5 ak 0.6, aTc te ajoute nan konsantrasyon final la nan 500 ng / ml, epi lè OD600 la rive nan ant 0.9 ak 1, IPTG te ajoute nan konsantrasyon final la nan 0.02 mM. Lycopene te ekstrè lè l sèvi avèk asetòn, jan sa dekri nan referans la (22). Yo te jwenn konsantrasyon likopèn nan absòbe a nan 475 nm lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt Jenway 7300 lè l sèvi avèk yon koub estanda. Yo te pran echantiyon 300 l nan medya kilti pou fè ekstraksyon RNA.

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

REZILTA AK DISKISYON

Efè mitasyon yo nan sgRNA sou efikasite represyon nan sistèm CRISPR la

Sistèm CRISPRi a ka reprime ekspresyon jèn lè konplèks ternary dCas9–sgRNA–DNA mare ansanm fòtman. Nou te ipotèz ke efikasite represyon sistèm CRISPRi a ta ka chanje nan yon sèten nivo pa modulation fòmasyon konplèks RNP. Pou mezire efikasite represyon nan sistèm CRISPR, nou te fèt yon sistèm rapò fluoresans ki baze sou sikwi jenetik la kote dCas9 soti nan S. pyogenes pwovoke pa anhydrotetracycline (aTc), epi tou de jèn repòtè (mCherry) ak varyant sgRNA yo eksprime yon fason konstititif (Figi). 1A). Yon fwa yo ajoute aTc nan mwayen an, konplèks dCas9-sgRNA-ADN ternary bloke transkripsyon jèn repòtè a, epi nivo fliyoresans envèsman endike efikasite represyon sistèm CRISPR la. sgRNA a gen 96 nukleotid (nts) nan total. Rejyon spacer la (premye 20 nt yo) mare nan sekans ADN sib la, ak lòt 76 nt yo kontribye nan fòmasyon konplèks la ak estabilite. Depi dezakò nan rejyon spacer la ka pèdi espesifik ak ogmante efè off-sib nan sistèm nan CRISPR ki baze sou (33,43), longè maksimòm sgRNA a ki ka enjenyè se 76 nts. Nan ka sa a, yo ta dwe jwenn yon gwosè bibliyotèk 476 (apeprè 1045), men li twò gwo pou konstwi. Kidonk, li oblije etwat gwosè bibliyotèk la lè w detèmine pozisyon espesifik sou sgRNA la. Nou premye envestige kijan mitasyon nan sgRNA nan chak rejyon afekte represyon nan sistèm CRISPR la. Yon etid anvan te rapòte ke mitasyon nan tij-bouk 1 (sg mut01 ak sg mut02) te mennen nan yon diminisyon enpòtan nan aktivite nukleaz Cas9, pandan y ap mitasyon nan tij-bouk 2 (sg mut03) oswa tij-bouk 3 (sg). mut04) pa afekte aktivite li (44). Yon sgRNA rekonstwi (sg mut05) ki gen mitasyon nan rejyon an tij-bouk 1 ak repete, tetraloop, anti-repete, ak tij-bouk 2 rejyon tou diminye aktivite nukleaz (44). Sepandan, nan sistèm CRISPRi a, tout senk varyant sgRNA te gen yon ti efè sou efikasite represyon an konpare ak sgRNA nan kalite sovaj (sg WT), ak chak varyant montre yon nivo fliyoresan 2-4% konpare ak kontwòl pozitif la san yon rejyon spacer. sg PC) (Figi 1B). Rezilta sa yo sijere ke fòmasyon konplèks dCas9-sgRNA a mwens sansib a modifikasyon sekans nan rejyon tij-bouk 1 nan sistèm CRISPRi a, kontrèman ak sistèm CRISPR/Cas9. Nou te ipotèz ke retire rejyon ki gen rapò ak estabilite nan konplèks la kapab yon pwen depa kontwole ekspresyon an sou plizyè nivo pi lwen. Pou sa ka fèt, nou te konstwi yon sgRNA twonke (sg trcSL1) ki manke linker, tij-bouk 2 ak tij-bouk 3. SgRNA twonke sa a gen yon kantite minimòm konpozan e yo te montre siyifikativman diminye aktivite nuclease nan CRISPR/. Cas9 sistèm (5,44). Lè yo teste nan sistèm CRISPRi a, mutan ki defektye sa a te montre yon nivo fliyoresan 8% konpare ak sg PC, sa ki sijere ke li ta ka toujou mare nan dCas9 ak reprime jèn nan enterè nan yon sèten nivo menm ak diminye estabilite ternary konplèks (Figi 1B). Analiz estriktirèl konplèks RNP la sijere ke rejyon lyetè, tij-bouk 2, ak tij-bouk 3 nan sgRNA a responsab pou estabilize konplèks la atravè entèraksyon yo ak domèn nukleaz dCas9, ki mennen nan yon diminisyon enpòtan nan indel. efikasite nan sistèm CRISPR/Cas9 (44). Kontrèman, repete: rejyon anti repete ak tij-bouk 1 nan sgRNA a sitou kominike avèk domèn rekonesans ak domèn PAM-interakting nan dCas9 epi yo pa afekte siyifikativman efikasite indel nan sistèm CRISPR/Cas9 (44). Rezilta sa a sipòte obsèvasyon ke sg trcSL1 te montre yon rediksyon enpòtan nan aktivite nuclease nan sistèm CRISPR/Cas9 la pandan y ap sèlman yon ti kras afekte afinite obligatwa nan sistèm CRISPRi a.

Figi 1. Konstriksyon sistèm ak efè sou efikasite represyon pa mitasyon sgRNA. (A) De sistèm plasmid pou quantification efikasite represyon an. Yon plasmid ki gen orijin p15A gen jèn dCas9 anba yon pwomotè aTc-induzibl ak jèn mCherry anba yon pwomotè konstititif. Lòt plasmid ki gen orijin cloDF13 gen sgRNA kalite sovaj oswa mutan anba yon pwomotè konstititif. (B) Fliyoresans relatif chak mutan sgRNA (sg mut01 ~ sg mut05 ak sg trcSL1) ak sg WT konpare ak sg PC. +1 rive + 20 se sekans spacer ki konekte ak jèn mCherry la. sg PC: sgRNA san spacer kòm yon kontwòl pozitif, sg WT: sgRNA kalite sovaj. Ba erè yo endike devyasyon estanda (n=3). P-valè yo te detèmine pa tès t ki pa pè. ns: pa enpòtan, **P< 0.01

Varye efikasite fòmasyon konplèks pou yon kontwòl ekspresyon miltip nivo

Tetraloop se yon linker atifisyèl ki konekte crRNA ak tracrRNA nan sistèm CRISPR-Cas9 (5). Estrikti kristal konplèks ternary a, ki konpoze de dCas9, crRNA, ak tracrRNA, te montre ke tetraloop la ak 5 ak 3 rejyon flanke li yo gen ti kontak ak dCas9 (44). An menm tan an, repete: rejyon anti-repete ak tij-bouk 1 yo kritik pou konplèks fonksyonèl la (44). Kòm li pa dirèkteman kominike avèk dCas9, tetraloop la, ak rejyon flank li yo te eksplore kòm sit potansyèl pou jeni sgRNA ak eleman adisyonèl, tankou enkòpore sekans aptamer pou rekrite pwoteyin adisyonèl nan sgRNA a (45,46). Li posib ke mitasyon nan rejyon sa a ta ka divèsifye afinite obligatwa ant sgRNA ak dCas9 san yo pa konplètman deranje konplèks la. Yon 12- bibliyotèk o aza (4 nt nan rejyon an tetraloop ak 4 nt nan 5 ak 3 rejyon flank, respektivman) te konstwi lè l sèvi avèk sg trcSL1 kòm yon modèl pou diminye plis efikasite fòmasyon konplèks ant sgRNA ak dCas9 (Figi 2A). ). Nou aplike yon estrateji klasman de etap pou jwenn divès kalite mutan sgRNA ki kouvri efikasite represyon ant sg WT (eta konplètman-represyon) ak sg PC (eta ki pa represyon). Nou divize bibliyotèk orijinal la an pi piti bibliyotèk ak diferan ranje entansite fliyoresans, ak Lè sa a, endividyèlman idantifye fliyoresans chak varyant sgRNA nan bibliyotèk ki pi piti a. Distribisyon fliyoresan bibliyotèk orijinal la te jwenn pa sikometri koule te prèske idantik ak sg PC (Figi 2B). Sepandan, apre twa etap klasman youn apre lòt, chak bibliyotèk (segondè, mitan, ak ba) te gen 63%, 24%, ak 14% nivo medyàn fliyoresan konpare ak sg PC, respektivman (Figi 2B). Katreven-de koloni yo te izole nan pi piti bibliyotèk sa yo, ak nivo fliyoresan ki sòti nan 8% a 104% (Figi 2C). Rezilta sa yo sijere ke mutation tetraloop ak rejyon flanke li yo nan sgRNA a ka modile afinite obligatwa ant dCas9 ak sgRNA pou efikasite represyon divès kalite. Ranvèse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR) analiz de 10 mutan sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, Tablo Siplemantè S6) ak divès kalite siyal fliyoresan ant sg WT ak sg PC nan mitan 82 koloni sgRNA te montre ke fliyoresans nivo transkripsyon m Cherry ogmante lineyè. , ki endike ke sistèm CRISPRi nou an kontwole ekspresyon jèn nan nivo transkripsyon (Figi Siplemantè S2). Sistèm CRISPRi reglabl nou an itilize sgRNA enjenyè, ki ka reyalize jiska 45-pliye kontwòl represyon, sa ki pèmèt pou ajiste efikasite represyon an san yo pa chanje kantite dCas9 oswa sgRNA. Yon avantaj remakab nan sistèm nou an se ke li ka amann efikasite nan represyon atravè varyant espesifik sgRNA san potansyèl la pou konsekans envolontè, menm si klonaj adisyonèl obligatwa. Anplis, koub kwasans lan sijere sistèm nou an pa enpoze yon fado selilè enpòtan (figi siplemantè S3). Anplis de sa, RNA-Seq sou twa varyant sg trcSL1 ak diferan nivo efikasite represyon te montre ke ekspresyon 51 a 83 jèn yo te chanje, kontrèman ak 262 jèn yo chanje nan sg WT la (figi siplemantè S4). Rezilta sa yo sijere ke varyant sg trcSL1 yo te gen menm pi ba efè sou sib pase sistèm CRISPRi konvansyonèl la. Li se patikilyèman enpòtan nan aplikasyon jeni metabolik, kote optimize chemen metabolik souvan enplike manipilasyon nan jèn miltip. Kapasite nan amann ekspresyon jèn san yo pa lakòz efè segondè negatif ka siyifikativman akselere pwosesis la optimize ak amelyore efikasite an jeneral ak pwodiktivite nan sistèm nan.

Figi 2. Estrikti bibliyotèk sgRNA ak tès depistaj bibliyotèk la. (A) echafodaj sgRNA yo itilize nan etid sa a. 12-Mè ki gen tetraloop ak sekans flank li yo chanje owaza soti nan sg trcSL1 pou jwenn yon bibliyotèk sgRNA. (B) Distribisyon fliyoresans jwenn nan sikometri koule anvan (agòch) ak apre (adwat) klasman. Chak distribisyon gen 100,000 selil. (C) Fluoresans koloni sèl yo jwenn nan (B). Ba erè yo endike devyasyon estanda (n=2).

Efè kantite dCas9 ak sgRNA sou efikasite represyon

Depi modile kantite swa dCas9 oswa sgRNA ta ka chanje efikasite represyon nan sistèm CRISPRi (23,24), li esansyèl pou egzamine enpak dCas9 ak kantite sgRNA sou efikasite represyon. Nou teste pèfòmans sistèm nou an nan diferan kondisyon lè nou chanje kantite dCas9 ak sgRNA lè l sèvi avèk dis mutan sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10). Twa konsantrasyon diferan (20, 100, ak 500 ng/ml) nan induktè a te itilize pou ekspresyon dCas9. Konpare ak nivo mRNA dCas9 lè yo te itilize 20 ng/ml induktè, li te ogmante plis pa 15-pliye (100 ng/ml) ak 22- pliye (500 ng/ml) (figi siplemantè S5A). ). Gen enkyetid sou twòp eksprime dCas9 paske yon wo nivo dCas9 ta ka toksik pou selil yo (47,48) oswa pafwa pa (49). Sepandan, to kwasans lan te redwi pa mwens pase 10% lè yo te itilize jiska 500 ng / ml aTc, dapre koub kwasans yo nan divès konsantrasyon endiktè (Figi Siplemantè S6). Sa a sijere ke kantite lajan an nan dCas9 pa t 'gen yon efè toksik sou E. coli anba kondisyon yo teste. Efikasite represyon an te chanje yon ti kras lè yo te eksprime kantite diferan nan dCas9 (Figi 3A). Li te konsistan avèk yon etid anvan ke sistèm CRISPRi te rive nan maksimòm efikasite represyon nan [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Figi 3. Karakterizasyon ak modilarite sistèm tunable CRISPRi a. (A) Fliyoresans relatif anba diferan konsantrasyon aTc (20, 100, ak 500 ng / ml). (B) Fliyoresans relatif anba pwomotè diferan (J23100 ak UPJ23119). (C) Fluoresans relatif anba diferan protospacers. Aks x la endike fliyoresans relatif mCherry, ak aks y endike fliyoresans relatif lacI33-mCherry (wouj) ak araC33-mCherry (ble). 33 bp nan sekans adisyonèl soti nan lacI ak araC yo te ajoute nan 5-fen mCherry (56). (D) Enèji gratis 12-mer ak fliyoresans relatif la. Liy tirè yo endike yon entèval prediksyon 95% ak liy solid yo endike yon liy regresyon. Valè dG nan sg trcSL1c2 pa t 'kapab jwenn lè l sèvi avèk mFold e konsa eskli nan analiz la. (A–D) Tout ba erè endike devyasyon estanda (n=3).

Modularite nan sistèm CRISPRi reglabl la

Apwòch nou an lè l sèvi avèk varyant sgRNA espesifik pou kenbe yon sèten nivo ekspresyon pou yon ADN sib gen potansyèl pou yo itilize kòm yon sistèm modilè. Pou demontre posibilite sistèm CRISPRi reglabl la pou vize diferan protospacers, nou te konstwi de jèn fizyon (lacI{{0}}mCherry ak araC33-mCherry) lè nou ajoute 33 bps sekans soti nan lacI ak araC. jiska 5 -fen mCherry (56). Genomic E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) genyen de kopi sekans protospacer pou lacI33- mCherry ak yon kopi pou araC33-mCherry. Sepandan, sekans kwomozòm sa yo pa gen sekans PAM e, kidonk, konplèks dCas9-sgRNA pa ka vize (43). Lè siRNA yo te fèt pou vize chak protospacer, efikasite represyon an te toujou kenbe pou tout protospacers soti nan lacI33, araC33, ak mCherry (Figi 3C). Konklizyon sa yo sijere ke sistèm CRISPRi reglabl nou an ka efektivman kontwole ekspresyon jèn nan yon sèten nivo kèlkeswa sekans protospacer la. Yon eksplikasyon potansyèl pou relasyon obsève ant fòmasyon konplèks RNP ak efikasite represyon se chanjman nan enèji gratis lè konplèks la fòme. Linker tetraloop atifisyèl la ak rejyon flanke li yo genyen de pè baz A: U ak G: C Watson-Crick ak yon pè baz A: G ki pa Watson-Crick (44). Kòm obligatwa nan crRNA ak tracrRNA enpòtan anpil pou fòmasyon konplèks la, mitasyon ki vize tetraloop ta afekte afinite obligatwa ant dCas9 ak sgRNA. Yo ka kalkile afinite sa a apati diferans enèji gratis ant eta ki gen limit ak eta ki pa limite. Sepandan, kalkile enèji gratis nan eta limite se yon defi (57). Nou te sipoze ke estrikti jeneral eta limite a ak estabilite pa chanje depi sgRNAs klase nan bibliyotèk la pa t 'antyèman deranje fonksyon li yo. Anplis, tetraloop la ak rejyon flanke li yo gen ti kontak ak dCas9 (44). Se poutèt sa, afinite obligatwa ant dCas9 ak sgRNA ta dwe sitou afekte pa estabilite nan estrikti segondè nan tetraloop la ak sekans flanke li yo. Baze sou lide sa a, nou kalkile enèji gratis tetraloop la ak sekans flanke li yo lè l sèvi avèk mwazi (58). Diferans nan enèji gratis nan plisman akòz mitasyon yo defini kòm diferans ki genyen ant enèji gratis nan sekans yo mitasyon ak kalite sovaj. Li ta ka dirèkteman kalkile apati enèji gratis nan plisman nan mutan depi enèji ki sekans nan kalite sovaj plisman se konstan nan -4.3 kcal/mol. Kòm enèji gratis nan plisman ogmante, siyal la fliyoresan ogmante (Figi 3D). Efikasite represyon te pi wo lè enèji plisman nan rejyon ki gen tetraloop la te tou pre oswa pi ba pase 0 kcal/mol epi li te diminye lineyè lè enèji plisman an depase 0 kcal/mol. Obsèvasyon sa a sijere ke efikasite fòmasyon konplèks ant dCas9 ak sgRNA detèmine pa estrikti segondè nan rejyon an tetraloop, ki ede eksplike modilarite nan sistèm nou an. Efikasite represyon yon lòt 85 sgRNA ak diferan 12-mer sekans nan bibliyotèk la te mezire pou plis valide relasyon sa a. Li te montre tou korelasyon yo obsève nan varyant sg trcSL1 (Figi 3D ak Tablo Siplemantè S7), sijere ke tetraloop linker jwe yon wòl enpòtan nan fòme konplèks RNP la e ke mitasyon nan rejyon sa a ka afekte efikasite nan sistèm CRISPR. Anplis de sa, relasyon sa a montre posiblite pou konsepsyon ki baze sou òdinatè nan varyant sgRNA ak efikasite represyon vle.

Aplike yon sistèm CRISPRi reglabl pou redistribisyon flux nan chemen byosentetik violacein nan E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-pli) konpare ak lòt jèn lè yo kalkile apati koub estanda yo. Kontrèman, ekspresyon lòt anzim ki pa reglemante nan chemen violacein (vioA, vioB, ak vioE) te rete san okenn chanjman. Rezilta sa yo sijere ke sistèm nou an ka espesyalman vize ak modile ekspresyon jèn endividyèl yo san yo pa afekte lòt jèn nan chemen an. Kantifikasyon dirèk nan PV ak PDV pa t posib akòz mank nan estanda ki disponib nan komèsyal pou analiz HPLC. Se konsa, nou mezire tit yo nan inite abitrè lè l sèvi avèk zòn pik HPLC. Titer la nan pwodwi a te rive nan yon maksimòm nan 8 èdtan apre endiksyon ak Lè sa a, piti piti diminye (figi siplemantè S8), petèt akòz konvèsyon nan pwodwi a nan lòt pwodwi bò, tankou chromoviridans, pa yon mekanis enkoni (42,64). Pik minè yo obsève sou spectre HPLC te endike prezans lòt pwodwi lòt minè. Rechèch anvan yo te demontre ke logaritm nan tit la nan chak pwodwi nan inite abitrè yo ta ka prevwa pa konbinezon lineyè nan fòs la pwomotè nan chak jèn ki enplike nan chemen an biosentetik violacein (42). Modèl regresyon log-lineyè sa a te valab tou nan sistèm nou an, epi ogmante transkripsyon vioD yo te asosye ak ogmante pwodiksyon PV (Figi 4B). Li konnen ke jeni pwomotè oswa 5 -UTR chak jèn ki enplike nan chemen biosentetik violacein te pèmèt redistribisyon flux ak optimize chemen (65,66). Sistèm nou an ta ka travay kòm yon metòd altènatif ilistre kontwòl transkripsyon an san yo pa manipile pwomotè ki enplike nan chemen an lè l sèvi avèk sgRNA sentetik, ki kout epi yo ka reyini ak metòd yon sèl etap. Depistaj atravè sistèm CRISPRi tunable a fè li posib pou redireksyon chemen an ak yon flux previzib anvan yo manipile dirèkteman tansyon lame oswa kasèt jèn, potansyèlman akselere pwosesis la.

Aplike sistèm CRISPRi reglabl la pou balanse flux kabòn nan E. coli ki pwodui likopèn.

Pwodiksyon efikas konpoze ki gen anpil valè nan jeni metabolik mande pou balanse flux kabòn. Chemen methylerythritol 4-fosfat (MEP) se yon chemen metabolik ki sèvi ak précurseurs senp tankou piruvat ak glyceraldehyde 3-fosfat (GAP) pou pwodui blòk bilding izoprenoid, dimethylallyl pyrophosphate ak isopentenyl pyrophosphate (67,68) . Molekil sa yo fè sentèz geranyl pyrophosphate, ki konvèti nan farnesyl pyrophosphate (FPP) (67,68). Lycopene, yon karotenoid ki gen anpil valè ak pwopriyete antioksidan ki pisan ak aplikasyon divès nan divès endistri (69), se sentèz soti nan FPP atravè yon seri de reyaksyon anzimatik soti nan crtE, crtB, ak crtI (Figi 4C) (22,70). Précurseur GAP esansyèl pa sèlman pou chemen MEP a, men tou pou chemen glikoliz la (22). Diminye ekspresyon jèn gapA a, ki kode glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) nan chemen glikoliz la, yo montre amelyore pwodiksyon likopèn lè yo ogmante pisin GAP (22). Se poutèt sa, nou vize gapA ak senk varyant, ki gen ladan twa sg trcSL1 varyant (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, ak sg trcSL1c6) ki te montre divès kalite efikasite represyon, sg PC, ak sg WT. Sepandan, gapA se yon jèn esansyèl ki pa ka konplètman kraze (71,72). Tantativ pou reprime gapA ak CRISPRi konvansyonèl lè l sèvi avèk sg WT te san siksè menm ak leakiness ki ba nan dcas9 anba tet pwomotè (73). Nan lòt men an, represyon nan plizyè nivo nan ekspresyon jèn gapA lè l sèvi avèk sistèm CRISPRi tunable a te reyalize san defo kwasans e li te lakòz yon ogmantasyon 2.7-pliye ak sg trcSL1c6 nan pwodiksyon likopèn konpare ak yon souch konplètman eksprime jèn gapA. apre 15 h nan kiltivasyon (Figi 4D ak Figi Siplemantè S9). Yo te rapòte ke sèlman 10% nan ekspresyon natirèl jèn gapA a mennen nan yon pisin GAP ogmante san yo pa yon chanjman enpòtan nan metabolit en nan chemen glikoliz la, tankou 2-fosfogliserat ak 3-fosfogliserat ( 22). Ansanm, rezilta sa yo demontre ke CRISPRi reglabl ka jisteman reprime ekspresyon jèn nan plizyè nivo san jeni kwomozòm.

Figi 4. Aplikasyon sistèm tunable CRISPRi pou chemen biosentetik violacein. (A) Chemen biosentetik vyolasein ak konstriksyon plasmid la. Yo te klonaj senk jèn (vioA, vioB, vioC, vioD, ak vioE) ki responsab pou pwodui violacein nan yon plasmid ki eksprime dCas9-. Kat gwo pwodwi yo (vyolasein, proviolasein, deoxyviolacein, ak prodeoxyviolacein) yo pwodui. sg WT pou vioC ak senk variants sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 ak sg trcSL1c9) pou vioD, ki montre diferan efikasite represyon, yo te klonaj nan lòt plasmid la. Trp: L-triptofan, V: violacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoxyviolacein, DV: deoxyviolacein, PDVA: asid protodeoxyviolaceinic, PVA: asid protoviolaceinic. (B) Relasyon ant transkripsyon vioD, fliyoresans mCherry, ak tit PDV ak PV. Aks x la endike RNA vioD relatif yo jwenn nan RT-qPCR, aks y sou bò gòch la endike fliyoresans mCherry relatif nan Figi 3, ak aks y sou bò dwat la endike rapò zòn HPLC a. Echantiyon ki gen pi wo valè vioD RNA yo te mete a 100% pou nòmalizasyon. (C) Chemen biosentetik Lycopene ak konstriksyon plasmid la. Twa jèn (crtE, crtB, crtI) ki responsab pou pwodui likopèn yo te klonaj nan yon plasmid ki eksprime dCas9-. gapA te vize ak sg trcSL1 variants (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) ak sg PC te klonaj nan plasmid lòt la. Glc: Glikoz, GAP: glyceraldehyde 3-fosfat, 1,3-BPG: 1,{3-bisphosphoglycerate, DMAPP: dimethylallyl pyrophosphate, IPP: isopentenyl pyrophosphate, FPP: farnesyl pyrophosphate. (D) Relasyon ant transkripsyon gapA, fliyoresans mCherry, ak pwodiksyon likopèn. Aks x la endike diferans relatif RNA ki te jwenn nan RT-qPCR, aks y sou bò gòch la endike fliyoresans mCherry relatif nan Figi 3, ak aks y sou bò dwat la endike tit likopèn. (B, D) Tout ba erè endike devyasyon estanda (n=3).

KONKLIZYON

Nou te fèt yon sistèm CRISPRi reglabl ki ta ka jisteman kontwole ekspresyon jèn nan nivo vle a. Lè yo mitasyon tetraloop la ak rejyon flanke li yo, sgRNA sentetik ki vize divès sekans protospacer te kapab kontwole jèn nan nan yon sèten nivo. Nou aplike sistèm sa a avèk siksè pou redireksyon flux metabolik enterè nan chemen biosentetik violacein pou pwodui dérivés indol nan yon rapò previzib. Anplis de sa, nou te montre ke itilizasyon CRISPRi tunable te mennen nan yon ogmantasyon 2.7-pliye nan pwodiksyon likopèn, mete aksan sou adaptabilite nan sistèm nou an pou amelyore pwodiksyon an nan lòt konpoze ki gen anpil valè. Sistèm sa a ta akselere pwosesis optimize flux yo anvan yo manipile pou tout tan enfòmasyon jenetik lame a, tankou ranplase pwomotè a oswa sekans 5-UTR yo.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

REFERANS

1. Sapranauskas,R., Gasiunas,G., Fremaux,C., Barrangou,R., Horvath,P. ak Siksnys,V. (2011) Sistèm Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas bay iminite nan Escherichia coli. Asid Nukleik Res., 39, 9275–9282.

2. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. ak Siksnys,V. (2012) Cas 9-crRNA ribonukleoprotein konplèks medyatè espesifik ADN klivaj pou iminite adaptasyon nan bakteri. Pwosedi. Natl. Acad. Sci. USA, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran,FA, Cox, D., Lin,S., Barretto, R., Habib,N., Hsu, PD, Wu,X., Jiang, W., Marraffini, LA et al. . (2013) Multiplex genomic engineering using CRISPR/Cas system. Syans, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu,PD, Wright,J., Agarwala,V., Scott,DA ak Zhang,F. (2013) Jeni genòm lè l sèvi avèk sistèm CRISPR-Cas9 la. Nat. Pwotok., 8, 2281–2308.

5. Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I., Hauer,M., Doudna,JA ak Charpentier,E. (2012) Yon endonuclease ADN pwogramasyon doub-RNA-gide nan iminite bakteri adaptasyon. Syans, 337, 816–821.

6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A. ak Jinek,M. (2014) Baz estriktirèl nan rekonesans ADN sib PAM-depandan pa Cas9 endonuclease la. Lanati, 513, 569–573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP ak Lim, WA (2013) Repurposing CRISPR kòm yon platfòm RNA-gide pou kontwòl sekans-espesifik nan ekspresyon jèn. Cell, 152, 1173–1183.

8. Larson,MH, Gilbert,LA, Wang,X., Lim,WA, Weissman,JS ak Qi,LS (2013) CRISPR entèferans (CRISPRi) pou kontwòl sekans-espesifik nan ekspresyon jèn. Nat. Pwotok., 8, 2180–2196.

9. McGlincy, NJ, Meacham, ZA, Reynaud, KK, Muller, R., Baum, R. ak Ingolia, NT (2021) Yon bibliyotèk gid entèferans CRISPR nan echèl jenomik pèmèt pwofil fenotip konplè nan ledven. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yoon, J. ak Woo, HM (2018) CRISPR entèferans-medyatè jeni metabolik nan Corynebacterium glutamicum pou pwodiksyon homo-butyrate. Biotechnol. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto, S., Jensen, JV, Wendisch, VF ak Lu, TK (2016) Corynebacterium glutamicum jeni metabolik ak entèferans CRISPR (CRISPRi). ACS Synth. Biol., 5, 375-385.

12. Zhang, GQ, Ren, XN, Liang, XH, Wang, YQ, Feng, DX, Zhang, YJ, Xian, M. ak Zou,HB (2021) Amelyore pwodiksyon mikwòb nan asid amine: soti nan apwòch konvansyonèl nan dènye tandans. Biotechnol. Bioproc. E, 26, 708–727.

13. Kim, SK, Seong, W., Han, GH, Lee, DH ak Lee, SG (2017) CRISPR entèferans-gide represyon multiplex nan endogenous konpetisyon jèn chemen pou redireksyon flux metabolik nan Escherichia coli. Mikwòb. Cell Fact., 16, 188.

14. Ellis,NA, Kim,B., Tung,J. ak Machner,MP (2021) Yon zouti entèferans CRISPR multiplex pou entèwogasyon jèn virulans nan Legionella pneumophila. Komin. Biol., 4, 157.

15. Siu,KH ak Chen,W. (2019) gRNA riboregulated toehold-gated pou fonksyon pwogramasyon CRISPR-Cas9. Nat. Chem. Biol., 15, 217-220.

16. Reis, AC, Halper, SM, Vezeau, GE, Cetnar, DP, Hossain, A., Clauer, PR ak Salis, HM (2019) Represyon similtane nan plizyè jèn bakteri lè l sèvi avèk etalaj sgRNA ki pa repetitif ekstra-long. Nat. Biotechnol., 37, 1294–1301.

17. Tian, ​​T., Kang, JW, Kang, A. ak Lee, TS (2019) Redireksyon flux metabolik atravè represyon multiplèks CRISPRi-medyatè pou pwodiksyon izopentenol nan Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 8, 391-402.

18. Gauttam,R., Seibold,GM, Mueller,P., Weil,T., Weiss,T., Handrick,R. ak Eikmanns, BJ (2019) Yon senp sistèm entèferans CRISPR doub-induzibl pou vize jèn miltip nan Corynebacterium glutamicum. Plasmid, 103, 25-35.

19. Yao, L., Cengic, I., Anfelt, J. ak Hudson, EP (2016) Represyon jèn miltip nan sianobakteri lè l sèvi avèk CRISPRi. Acs Synth. Biol., 5, 207-212.

20. Lim, HG, Noh, MH, Jeong, JH, Park, S. ak Jung, GY (2016) Optimal re-balans nan chemen pwodiksyon asid idroksipropionik soti nan gliseryòm nan Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 5, 1247-1255.

21. Yang,Y., Lin,Y., Li,L., Linhardt,RJ ak Yan,Y. (2015) Regilasyon metabolis malonyl-CoA atravè RNA antisans sentetik pou biosentèz amelyore nan pwodwi natirèl. Metab. Ang., 29, 217–226.

22. Jung, J., Lim, JH, Kim, SY, Im, DK, Seok, JY, Lee, SV, Oh, MK ak Jung, GY (2016) Rebalansman egzak précurseur pou pwodiksyon isoprenoid pa kontwòl amann nan ekspresyon gapA nan Escherichia coli. Metab. Ang., 38, 401–408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL ak Jun,S. (2016) tCRISPRi: reglabl ak revèsib, kontwòl yon sèl etap nan ekspresyon jèn. Sci. Rep., 6, 39076.

24. Fontana, J., Dong, C., Kam, JY, Zalatan, JG ak Carothers, JM (2018) Ekspresyon reglemante nan melodi sgRNAs CRISPRi nan E. coli. Biotechnol. J., 13, e1800069.

25. Kim, NM, Sinnott, RW ak Sandoval, NR (2020) Transcription faktè ki baze sou biodetèktè ak sistèm inducible nan bakteri ki pa modèl: pwogrè aktyèl ak direksyon nan lavni. Curr. Opinyon. Biotechnol., 64, 39-46.

26. Kundert,K., Lucas,JE, Watters,KE, Fellmann,C., Ng,AH, Heineike,BM, Fitzsimmons,CM, Oakes,BL, Qu,J., Prasad,N. et al. (2019) Kontwole CRISPR-Cas9 ak sgRNAs ligand aktive ak ligand dezaktive. Nat. Komin., 10, 2127.

27. Ferreira,R., Skrekas,C., Hedin,A., Sanchez,BJ, Siewers,V., Nielsen,J. ak David,F. (2019) Modèl-asistans ajisteman metabolis santral kabòn nan ledven atravè dCas 9-règleman ki baze sou. ACS Synth. Biol., 8, 2457–2463.

28. Su, T., Guo, Q., Zheng, Y., Liang, Q., Wang, Q. ak Qi, Q. (2019) Amelyore hemB lè l sèvi avèk CRISPRi pou ogmante pwodiksyon asid aminolevulinik nan Escherichia coli. Devan. Microbiol., 10, 1731.

29. Zheng,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . et al. (2017) Profiling yon sèl-gid espesifik RNA revele yon sekans debaz sansib dezakò. Sci. Rep., 7, 40638.

30. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. ak Marraffini, LA (2013) koreksyon RNA-gide nan jenom bakteri lè l sèvi avèk sistèm CRISPR-Cas. Nat. Bioteknoloji,

31, 233–239. 31. van Gestel, J., Hawkins, JS, Todor, H. ak Gross,CA (2021) Konpitalasyon tiyo pou desine gid RNAs pou dezakò-CRISPRi. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins,JS, Silvis,MR, Koo,BM, Peters,JM, Osadnik,H., Jost,M., Hearne,CC, Weissman,JS, Todor,H. and Gross,CA (2020) Mismatch-CRISPRi revele relasyon ekspresyon-fòmasyon ko-varye nan jèn esansyèl nan Escherichia coli ak Bacillus subtilis. Cell Syst., 11, 523–535.

33. Fortin,J.-P., Tan,J., Gascoigne,KE, Haverty,PM, Forrest,WF, Costa,MR and Martin,SE (2019) Vize plizyè jèn ak tolerans dezekilib ka konfonn analiz de jenom- lajè pisin ekran CRISPR. Genome Biol., 20, 21.

34. Rozen,S. ak Skaletsky, H. (2000) Primer3 sou WWW pou itilizatè jeneral yo ak pou pwogramè byolojis yo. Metòd Mol. Biol., 132, 365-386.

35. Zhou,K., Zhou,L., Lim,Q., Zou,R., Stephanopoulos,G. ak Too, HP (2011) Nouvo jèn referans pou quantifier repons transkripsyon Escherichia coli sou ekspresyon pwoteyin pa PCR quantitative. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak,KJ and Schmittgen,TD (2001) Analiz de done ekspresyon jèn relatif lè l sèvi avèk PCR quantitative an tan reyèl ak Metòd 2(-Delta Delta C(T)). Metòd, 25, 402–408.

37. Andrews, S. (2010) FastQC: Yon Zouti Kontwòl Kalite pou Done Sekans Gwo Debi. v0.11.9 ed.

38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. ak Salzberg, SL (2009) Aliyman ultrarapid ak memwa efikas nan sekans ADN kout nan genomic imen an. Genome Biol., 10, R25.

39. Danecek,P., Bonfield,JK, Liddle,J., Marshall,J., Ohan,V., Pollard,MO, Whitwham,A., Keane,T., McCarthy,SA, Davies,RM et al. (2021) Douz ane SAMtools ak BCFtools. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell,C., Williams,BA, Pertea,G., Mortazavi,A., Kwan,G., van Baren,MJ, Salzberg,SL, Wold,BJ ak Pachter,L. (2010) Asanble transkripsyon ak quantification pa RNA-Seq revele transkripsyon san annote ak chanjman izoform pandan diferansyasyon selilè. Nat. Biotechnol., 28, 511-515.

41. Trapnell,C., Hendrickson,DG, Sauvageau,M., Goff,L., Rinn,JL ak Pachter,L. (2013) Analiz diferans nan règleman jèn nan rezolisyon transkripsyon ak RNA-seq. Nat. Biotechnol., 31, 46-53.

42. Lee, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ ak Dueber, JE (2013) Optimizasyon nan nivo ekspresyon nan yon chemen milti-anzim nan absans yon tès wo-debi. Asid Nukleik Res., 41, 10668-10678.

43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann,S., Agarwala,V., Li,Y., Fine,EJ, Wu,X., Shalem,O. et al. (2013) ADN vize espesifik nan RNA-gide nucleases Cas9. Nat. Biotechnol., 31, 827-832.

44. Nishimasu, H., Ran, F., Hsu, P., Konermann, S., Shehata, S., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F. ak Nureki,O. (2014) Crystal estrikti nan Cas9 nan konplèks ak Gid RNA ak ADN sib. Cell, 156, 935–949.

45. Fu, Y., Rocha, PP, Luo, VM, Raviram, R., Deng, Y., Mazzoni, EO ak Skok, JA (2016) CRISPR-dCas9 ak sgRNA echafodaj pèmèt D 'an de koulè nan sekans satelit. ak repete-anrichi loci endividyèl. Nat. Komin., 7, 11707.

46. ​​Khosravi,S., Schindele,P., Gladilin,E., Dunemann,F., Rutten,T., Puchta,H. ak Houben, A. (2020) Aplikasyon Aptamers Amelyore Imaging Live ki baze sou CRISPR nan Telomeres Plant. Devan. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen,AA and Voigt,CA (2014) Multi-input CRISPR/Cas jenetik sikui ki koòdone lame rezo regilasyon. Mol. Syst. Biol., 10, 763.

48. Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC and Moon, TS (2016) Kontwòl pwogramasyon ekspresyon jèn bakteri ak 44, 2462–2473.

49. Vigouroux,A., Oldewurtel,E., Cui,L., Bikard,D. ak van Teeffelen,S. (2018) Réglage kapasite dCas9 a pou bloke transkripsyon pèmèt gaya, san bri knockdown nan jèn bakteri. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.

50. Zhang,Y., Shang,X., Lai,S., Zhang,G., Liang,Y. ak Wen, T. (2012) Devlopman ak aplikasyon yon sistèm ekspresyon arabinoz-induzibl pa fasilite absorption endiktè nan Corynebacterium glutamicum. Appl. Anviwònman. Microbiol., 78, 5831-5838.

51. Thompson,MG, Sedaghatian,N., Barajas,JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. ak Keasling, JD (2018) Izolasyon ak karakterizasyon nouvo mitasyon nan orijin pSC101 ki ogmante kantite kopi. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke,PM, Link,T., Gatgens,J., Sonntag,C., Otto,M., Bott,M. ak Polen, T. (2020) Yon plasmid ekspresyon L-arabinoz-induzibl tunable pou bakteri asid acetic Gluconobacter oxydans. Appl. Microbiol. Biotechnol., 104, 9267–9282.

53. Nguyen,TT, Nguyen,NH, Kim,Y., Kim,JR ak Park,S. (2021) Karakterizasyon in vivo nan sistèm pwomotè inducible 3-hydroxypropionic dehydrogenase nan Pseudomonas denitrificans. Biotechnol Bioproc E, 26, 612-620.

54. McCarty, NS, Graham, AE, Studena, L. ak Ledesma-Amaro,R. (2020) Teknoloji CRISPR miltiplexe pou koreksyon jèn ak règleman transkripsyon. Nat. Komin., 11, 1281.

55. Yan,Q. ak Fong, SS (2017) Etid nan vitro transkripsyon efè obligatwa ak bri lè l sèvi avèk pwomotè konstititif konbine avèk sekans eleman UP nan Escherichia coli. J. Biol. Ang., 11, 33.

56. Seo,SW, ​​Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. ak Jung, GY (2013) Konsepsyon prediksyon rejyon inisyasyon tradiksyon mRNA pou kontwole efikasite tradiksyon prokaryotik. Metab. Ang., 15, 67–74. 57. Kappel,K., Jarmoskaite,I., Vaidyanathan,PP, Greenleaf,WJ, Herschlag,D. ak Das,R. (2019) Tès avèg nan prediksyon afinite RNA-pwoteyin. Pwosedi. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 8336–8341.

58. Zuker,M. (2003) Mfold sèvè entènèt pou plisman asid nikleyik ak prediksyon ibridizasyon. Asid Nukleik Res., 31, 3406-3415.

59. Xiong,B., Zhu,Y., Tian,D., Jiang,S., Fan,X., Ma,Q., Wu,H. ak Xie,X. (2021) Flux répartition nan metabolis kabòn santral pou pwodiksyon efikas nan l-triptofan nan Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao,R., Li,J., Feng,L., Zhang,X. ak Hu,H. (2019) (13)C jeni metabolik Escherichia coli ki gide analiz flux metabolik pou amelyore pwodiksyon asetol nan gliserin. Biotechnol. Biocarburants, 12, 29.

61. Duran,N. ak Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: yon revizyon nan pèspektiv famasi ak industiral. Kritik. Rev Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar, CJ ak Walsh, CT (2006) In vitro byosentèz violacein soti nan L-triptofan pa anzim yo VioA-E soti nan Chromobacterium violaceum. Byochimik, 45, 15444–15457.

63. Gwon,DA, Seok,JY, Jung,GY and Lee,JW (2021) Biosensor-assisted adaptive laboratory evolution for violacein production. Ent. J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez,C., Brana,AF, Mendez,C. ak Salas, JA (2006) Reevalyasyon chemen biosentetik violacein ak relasyon li ak biosentèz endolokarbazòl. Chem. Bio. Chem., 7, 1231–1240.

65. Jones,JA, Vernacchio,VR, Lachance,DM, Lebovich,M., Fu,L., Shirke,AN, Schultz,VL, Cress,B., Linhardt,RJ and Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a apwòch konbinatwa pou balanse transkripsyon nan chemen metabolik yo. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Zhang,Y., Chen,H., Zhang,Y., Yin,H., Zhou,C. ak Wang,Y. (2021) Dirèk RBS Jeni nan gwoup jèn byosentetik pou pwodiktivite efikas nan violacein nan E. coli. Mikwòb. Cell Fact., 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) Chemen ki pa-mevalonate nan biosentèz precurseur isoprenoid. J. Biol. Chem., 282, 21573–21577.

68. Rohmer, M. (1999) Dekouvèt yon chemen mevalonate-endepandan pou biosentèz isoprenoid nan bakteri, alg ak plant ki pi wo. Nat. Prod. Rep., 16, 565–574.

69. Muller,L., Caris-Veyrat,C., Lowe,G. ak Bohm, V. (2016) Lycopene ak wòl antioksidan li nan prevansyon maladi kadyovaskilè - yon revizyon kritik. Kritik. Rev Manje Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura,Y., Kondo,K., Saito,T., Shimada,H., Fraser,PD ak Misawa,N. (1998) Pwodiksyon karotenoid likopèn, beta-karotèn, ak astaxanthin nan ledven manje Candida utilis. Appl. Anviwònman. Microbiol., 64, 1226-1229.

71. Goodall, ECA, Robinson, A., Johnston, IG, Jabbari, S., Turner, KA, Cunningham, AF, Lund, PA, Cole, JA ak Henderson, IR (2018) Genòm esansyèl Escherichia coli K{ {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba,T., Ara,T., Hasegawa,M., Takai,Y., Okumura,Y., Baba,M., Datsenko,KA, Tomita,M., Wanner,BL ak Mori,H. (2006) Konstriksyon Escherichia coli K-12 nan-ankadreman, yon sèl-jèn knockout mutan: koleksyon an Keio. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008.

73. Bertram,R. ak Hillen, W. (2008) Aplikasyon Tet represor nan règleman ak ekspresyon jèn prokaryotik. Mikwòb. Biotechnol., 1, 2-16.