Kwa-reyaktif, IgG Natirèl Rekonèt L. Gwo Ankouraje Entènasyon Parazit Pa Selil Dendritik epi Ankouraje Iminite Pwoteksyon

Résumé

Mesaj kle yo

• Sèvi ak diferan sourit jenetikman modifye, nou te jwenn ke antikò sa yo ka IgG, pa sèlman IgM.

Mo kle

Leishmania pi gwo · Selil Dendritik · Selil B · IgG natirèl

Entwodiksyon

Enfeksyon ak Leishmania spp. reprezante yon gwo fado nan peyi endemi yo. Manifestasyon maladi a varye ant leishmanioz kutane ki limite pwòp tèt ou ak maladi ki gaye, renouvlab, mikokutane ak maladi visceral. Leishmanioz visceral ki pa trete se yon gwo menas pou lavi lame a. Yon vaksen poko egziste. Gerizon ak tout laviiminitekont patojèn enpòtan intraselilè sa a depann sou devlopman selil Th1/Tc1 ki pwodui IFN, tandiske pèsistans parazit ak pwogresyon maladi a asosye ak dominasyon selil Th2, selil T regilasyon, ak/oswa repons Th17. Liberasyon IFN mennen nan NO pwodiksyon ki elimine parazit yo.Iminite pwoteksyonse pwovoke pa selil dendritik enfekte (DC). Apre inokulasyon nan Leishmania pi gwo nan po a pa mouchwa a, fòm lavi parazit promastigote yo vale pa macrophages po-rezidan (MΦ) ak netrofil. Nan MΦ, parazit transfòme nan fòm lavi amastigote ki pa flagelize epi replike. Apre sa, lòt selil lame yo pran amastigot ki lage yo, tankou DC. DC enfekte trete antijèn parazit, epi imigre nan nœuds lenfatik drenaj ak selil T premye. Liberasyon IL-12, ansanm ak lòt sitokin ki soti nan DC ki enfekte, dirije edikasyon Th1/Tc1 nan selil T espesifik parazit yo.

Lè nou konsidere ke MΦ itilize reseptè konpleman (CR)3 pou absòpsyon parazit, nan DC, Fc RI/III responsab pouparazitentèrnalizasyon. Enteresan, byen bonè, CR3-absorption parazit ki asosye mennen nan silans nan MΦ ki enfekte a, tandiske nan enfeksyon etabli, Fc Rmedize absòpsyon nan amastigotes pa MΦ pwovoke anti-enflamatwa IL-10 pwodiksyon ankouraje devlopman Th2/Treg. ak pèsistans parazit. Fc R-medyatè absòpsyon parazit nan DC, nan kontras, pwovoke deklanchman selil, CD4 T selil priming, epi tou antijèn kwa-prezantasyon. Se poutèt sa, antikò-medyatè absòpsyon parazit pa DC enpòtan pou devlopman pwoteksyon kont parazit la. Pwodiksyon anti-Leishmania IgG se konsa yon avantou pou efikas (kwa-) priming nan Leishmania-espesifik Th1 / Tc1 selil yo. Nan liy, nan absans selil B yo, devlopman maladi a te pi grav ak pi gwo volim blesi, pi gwo fado parazit, reta priming selil T, ak redwi pwodiksyon IFNΓ. Précédemment, nou te montre ke Leishmania-espesifik IgG te prezan nan sera nan moman DC akimilasyon nan blesi.

Li rete yon kesyon ouvè ki jan premye repons selil B nan parazit nan tèt li devlope nan absans selil B priming pa DC enfekte. Sa yo rele antikò natirèl ki rekonèt Leishmania spp. ka fasilite bonèentènasyon parazitpa DC. Anplis de sa, piske manbràn parazit yo gen fosfatidilserin ki sanble ak kò apoptotik,kwa-reyaktifantikò ka jwe yon wòl. Nan etid la prezan, nou te evalye si antikò anti-fosfolipid ki te pwodwi, pa egzanp, pandan lanmò selil twòp oswa IgG natirèl rekonèt Leishmania prezan nan bèt ki pa iminitè kontribye nan parazit pran DC ankouraje selil B ak selil T. Nou te jwenn ke antikò anti-fosfolipid ki soti nan serom murin oswa imen ak "IgG natirèl" nan serom nòmal sourit (NMS) mare nan parazit Leishmania, ki ase pou ankouraje.parazitentèrnalizasyonpa DC ak ankouraje pi bon rezilta maladi nan vivo.

Materyèl ak metòd

Bèt

Sourit C57BL/6 ki gen sis a uit semèn yo te achte nan men Janvier. Hansjörg Schild, Institute of Immunology, University Medical Center Mainz te bay sourit µMT ki pa gen anpil selil B. Sourit IgGi ak IgMi (tou de sou background C57BL / 6) yo te dekri deja. Tout bèt yo te loje anba kondisyon espesifik san patojèn (SPF) nan Sant Rechèch Animal Translational (TARC) nan Johannes Gutenberg University, Mainz. Tout eksperyans yo te antreprann ak yon lisans apwouve nan Komite Swen ak Itilizasyon Animal nan rejyon Rheinland-Pfalz.

Dapre etid èrbal, li te montre ke cistanche se yon kalite chanpiyon ki te itilize nan medikaman tradisyonèl Chinwa pou syèk. Li se te fè soti nan tij yo sèk ak tij nan chanpiyon an, ki ap grandi nan rejyon twopikal ak subtropikal nan pwovens Lazi. Li se souvan itilizeamelyore iminite, soulaje fatig, ak trete rim sèvo ak lòt enfeksyon.

Rechèch te montre sasistanchka ogmante pwodiksyon an nan antikò, ki ka ede kò a konbat anvayisè etranje tankou viris ak bakteri. Yo te jwenn li ogmante kantite ak aktivite selil T yo, yon kalite globil blan ki responsab pou ede kò a rekonèt ak konbat anvayisè danjere yo.

Anplis de sa, etid yo montre ke cistanche ka diminye gravite rim sèvo, grip, ak lòt enfeksyon viral. Li te jwenn diminye kantite tan li pran pou kò a retabli de enfeksyon viral oswa bakteri. cistanche kapab tou redwi dire lafyèv ki te koze pa sèten viris, osi byen ke diminye risk pou yo devlope enfeksyon segondè.

Anplis de sa,sistanchse konnen yo gen pwopriyete anti-enflamatwa, ki ka diminye enflamasyon ki asosye ak sèten maladi. Etid yo montre tou ke dendrobium ka ede amelyore efikasite nan sèten antibyotik.

Klike sou Organic Cistanche Vann Toupre Mwen

Pou plis enfòmasyon tanpri kontakte nou nan:david.deng@wecistanche.com

An jeneral, rechèch sijere ke cistanche ka yon tretman itil pouamelyoreiminiteak konbat divès enfeksyon. Li ka ede amelyore defans natirèl kò a, diminye severite ak dire maladi, epi li ka menm diminye risk pou yo devlope enfeksyon segondè.

Parazit ak enfeksyon 

Amastigotes oswa metacyclic promastigotes nan L. gwo klonaj VI (MHOM/IL/Friedlin) yo te prepare jan sa dekri deja. Amastigotes yo te izole nan zòrèy ki enfekte nan sourit BALB/c oswa µMT ki pa gen selil B, jan sa dekri anvan an. Parazit izole yo te opsonize ak 5 pousan NMS, IMS, oswa anti-PL pou 10 min nan 37 degre epi yo lave anvan enfeksyon in vitro oswa in vivo.

Sera, anrichisman IgG, ak tès obligatwa parazit

Serom nòmal sourit (NMS) te pwodwi nan sourit nayif C57BL/6, tandiske serom iminitè (IS) te pran nan sourit geri ki te enfekte ak 2 × 10E5 metacyclic promastigotes nan L. major pou Greater than or equal jiska 6 semèn. Antikò antifosfolipid (PL) yo te pwodwi pa repete vaksen ak timosit apoptotik. Anvan yo te rekòlte serom, yo te verifye siksè vaksen yo lè yo evalye espesifik IgG obligatwa nan selil apoptotik atravè sitometri koule oswa nan yon ELISA -glycoprotein-espesifik. Gwoup sourit C57BL/6 yo te iminize ak glycoprotein recombinant 2- (2G) nan prezans adjuvant Freud la (FA); serom ki gen anti- 2G te rekòlte apre 4 semèn. Anti-Leishmania IgG Pi gran pase oswa egal a 5–6-semèn L. sourit BALB/c ki enfekte pi gwo, PL- oswa b2G-espesifik IgG, yo te prepare nan seri pisin lè l sèvi avèk kolòn pwoteyin G (Pierce Chemical Co.) swiv pwotokòl manifakti a. Sera yo te estoke nan -20 degre anvan pirifikasyon IgG. Pirifye IgG te estoke nan 4 degre (0.8 mg/mL) nan PBS anvan ou itilize.

Nòmal serom imen (NHS) te soti nan matyè kontwòl ki an sante ak serom ki gen antikò anti-Leishmania yo te jwenn nan pasyan leishmanioz kutane (LM) soti nan Marocco. Sewòm nan pasyan ki gen sendwòm antifosfolipid (PL) te itilize tou.

Parazit (promastigotes oswa amastigotes) te tache pou Ig ki asosye ak sifas lè l sèvi avèk antikò segondè espesifik izotip ki reyaktif ak Ig sourit: anti-IgM (Serotec), anti-IgG1 (A85-1), ak anti-IgG2a/b ( R2-40, tout soti nan BD Biosciences). Apre tach, parazit yo te lave ak PBS / 2 pousan BSA, fiks, epi analize pa sikometri koule.

Eksitasyon vitro

DC ki sòti nan mwèl zo yo te pwodwi nan medya RPMI/5 pousan FCS ki te konplete ak IL-4 (10 µg/mL) ak GM-CSF (10 µg/mL) pou 6 jou jan sa te dekri anvan an. Selil yo te rekòlte nan jou 6 kòm frelikè DC. Yo te kiltive 2 × 105 DC ak amastigot opsonize ki soti nan sourit BALB/c oswa µMT ki enfekte oswa kiltive ak promastigot metacyclic opsonize (MOI 1:5) pou 18h. Apre sa, selil yo te rekòlte ak cytospin yo te pwodwi jan sa te dekri deja. Selil DifQuick-tache yo te analize pou prezans parazit entraselilè ak ekstraselilè. Yo te konte omwen 200 selil pou chak echantiyon.

Enfeksyon nan vivo

Volim blesi yo te mezire chak semèn nan twa dimansyon epi yo rapòte kòm elipsoid [(a/2×b/2×c/2)×4/3×π]. Parazit prezan nan tisi blesi yo te enimere lè l sèvi avèk yon tès dilution limite jan sa te dekri deja.

Pou mezire pwodiksyon cytokine antijèn espesifik yo, yo te refè selil LN drenaj sourit C57BL/6 ki enfekte yo epi yo te prepare sispansyon yon sèl selil. Yon milyon selil LN / 200 μL konplè RPMI 1640 (Biochrome) yo te ajoute nan plak 96-byen an prezans 25 ug/mL SLA. Supernatant yo te rekòlte 48h apre eksitasyon ak analize lè l sèvi avèk ELISA espesifik pou IFNΓ (R&D Systems), osi byen ke IL-4 ak IL-10 (BD).

Myeloid imen DC enfekte ak parazit opsonize

Myeloid imen CD1c plis DC (hDC) te izole nan san periferik dapre enstriksyon manifakti a lè l sèvi avèk yon sistèm izolasyon selil mayetik ak twous izolasyon BDCA-1 imen DC (Miltenyi, Almay). 1.5 × 107 selil yo te plake nan 2.5 mL RPMI 1640/2 pousan otològ plasma. Pou anrichi pite, selil yo te lave ak PBS cho epi finalman kiltive ak X-VIVO 15/plasma (1 pousan) konplete avèk IL-4 recombinant imen (150 U/mL) ak GM-CSF (400 U/mL) . Yo te rekòlte hDC ki pa gen matirite nan jou 6. Yo te kiltive 2 × 105 hDC ak amastigot opsonize ki soti nan sourit µMT ki enfekte oswa kiltive ak promastigot metasiklik opsonize (MOI 1:5) pou 18h. Apre sa, selil yo te rekòlte ak cytospin yo te pwodwi jan sa te dekri deja. Selil DifQuick-tache yo te analize pou prezans parazit entraselilè ak ekstraselilè. Yo te konte omwen 200 selil pou chak echantiyon.

Analiz estatistik

Yo te fè analiz estatistik lè l sèvi avèk lojisyèl StatView ak tès t Elèv ki pa marye.

Rezilta yo

Serom ki gen antikò antifosfolipid kole ak L. major

Depi parazit ka antre nan selil lame yo atravè yon pwosesis ki rele "imitasyon apoptotik" epi paske fòm lavi L. pi gwo eksprime fosfolipid sou sifas yo, nou te pwodwi serom ki gen antikò antifosfolipid (PL) lè l sèvi avèk pwotokòl etabli. Pou objektif sa a, gwoup sourit C57BL/6 yo te enfekte ak L. major, sou iminize ak thymocytes apoptotik nan prezans adjuvant Freud a (FA). Kòm 2-glycoprotein (2G) se antijèn prensipal nan sendwòm antifosfolipid (APS), nou tou vaksinen sourit ak 2G nan prezans FA pou jwenn serom ki gen anti- 2G antikò. Kòm kontwòl, yo te itilize serik sourit nòmal (NMS) ki soti nan sourit C57BL/6 ki pa enfekte ak serom iminitè (IS) ki soti nan sourit L. ki enfekte pi gwo.

Pou teste si diferan seri sourit sa yo ki soti nan sourit nayif oswa iminize yo genyen antikò ki mare nan L. major, nou te premye evalye antikò lyen ak antijèn parazit pa ELISA, lè l sèvi avèk L. major promastigote friz-dekonjle lisat (idrosolubl antijèn Leishmania, SLA) kòm substra. (Fig. 1A, kolòn nwa). Kòm estanda, nou itilize IgG izole nan sera sourit L. pi gwo ki enfekte. Enteresan, IS osi byen ke serom PL te genyen nivo konparab nan antikò obligatwa nan Leishmania lysate, ki te 3-4 fwa pi wo konpare ak obligatwa obsève ak NMS oswa sera soti nan sourit iminize ak adjuvant pou kont li. Anplis de sa, serom ki gen antikò 2G tou mare nan SLA. Sèvi ak yon ELISA espesifik pou 2G (kolòn blan), nou te idantifye wo nivo 2G-IgG nan serom la, tandiske nivo 2G IgG nan tout lòt sera yo te pi ba pase limit deteksyon an.

Fig. 1 Detection of L. major cross-reactive antibodies in serum of mice containing antiphospholipid antibodies. Serum was obtained from groups of C57BL/6 mice that were left untreated (normal mouse serum, NMS) or which were infected for>6 semèn ak 2× 105 L. pi gwo (serom iminitè, IS). Yon lòt gwoup te repete iminize ak timosit apoptotik (anti-fosfolipid Ab, a-PL) oswa recombinant 2-glikoprotein (a{- 2G) nan prezans adjuvant Freuds (FA) enkonplè, yo te itilize FA kòm kontwòl. Yo te teste yon serik pou reyaksyon nan yon ELISA lè l sèvi avèk L. gwo lisat kòm yon substra oswa 2-glikoprotein. ELISA a te devlope lè l sèvi avèk IgG anti-murin. Done yo eksprime kòm mwayen (±SEM, n Pi gran pase oswa egal a 1). B yo te jwenn promastigot metasiklik nan L. pi gwo nan kilti faz estasyonè (n{{10}}). C Amastigotes yo te prepare nan blesi sourit µMT ki pa gen selil B (n=3). B ak C preparasyon parazit yo te opsonize ak diferan sera (5 pousan, 10 min, 37 degre). Antikò obligatwa te evalye pa FACS ak anti-sourit segondè antikò. Liaison Ig la te kalkile sou nivo debaz parazit ki pa opsonize (*p mwens pase oswa egal a 0.05, **p mwens pase oswa egal a 0.005, ak ***p mwens pase oswa egal a 0.002)

Apre sa, nou enkube promastigotes metacyclic etap enfektye nan L. pi gwo ak konsantrasyon diferan nan IgG anrichi nan IS, PL, oswa 2G sera. Nou obsève yon lyezon ki depann de dòz IS- ak 2G-sòti IgG ak yon maksimòm nan 100 ng / mL (figi 1B). Obligasyon IgG ki sòti nan PL ak promastigotes nan L. pi gwo pa te detekte.

Anplis de sa, nou enkube L. pi gwo amastigotes izole nan blesi nan sourit µMT ki pa gen selil B ak diferan sera yo pou 10 min. Lè sa a, parazit yo te lave anpil, epi apre sa, yo te detekte antikò sifas la nan sikometri koule apre etikèt ak PE-konjige anti-IgG1, antiIgG2a / b, oswa anti-IgM (Fig. 1C). Kòm espere, IS te genyen IgM espesifik Leishmania, IgG1, ak IgG2a/b. Nou konfime tou travay anvan, jan nou te detekte Leishmania-espesifik IgM nan pisin nan sa yo rele "Ab natirèl". Enteresan, nou menm tou nou te jwenn IgG ak IgM nan serom PL ki fòtmankwa-reyajiak sifas L. gwo amastigotes. Antikò IgG ki gen anti- 2G pa te mare nan Leishmania, men serom 2G la te gen IgM.kwa-reyaksyonak sifas amastigote.

Antikò kwa-reyaktif medyatè entènalizasyon parazit pa DC

Nou pwochen te gen entansyon evalye si diferan antikò IgG ki kapab mare nan sifas L. gwo amastigotes yo fonksyonèl aktif. Kidonk, nou te pwodwi DC lè l sèvi avèk kilti selil mwèl zo (BM) ki te konplete ak GMCSF ak IL-4. BM-DC yo te rekòlte kòm selil frelikè nan jou 6 ak plake nan 2 × 105 selil / mL. Amastigot parazit ki sòti nan pye ki enfekte sourit BALB/c oswa µMT ki pa gen selil B yo te opsonize ak diferan seri (5 pousan vol), yo lave anpil, epi ajoute nan DC nan yon rapò parazit/selil 5:1. Apre 18h, selil yo te rekòlte, lave, ak cytospin.

Parazitentèrnalizasyonte detèmine sou glisad DifQuickstained nan 100 × (Fig. 2). Jan sa dekri, absorption de parazit izole nan sourit µMT te siyifikativman andikape. Pre-enkubasyon ak NMS yon ti kras amelyore absorption parazit, tandiske enkubasyon ak IS te mennen nan "nòmalizasyon" to enfeksyon DC nan nivo yo obsève ak amastigotes BALB/c-sòti. Nan nòt, opsonizasyon parazit ak PL te amelyore tou siyifikativman ak klèman to enfeksyon DC yo pa ~ 100 pousan. Nan liy ak nivo ki pi ba yo nan opsonizasyon IgG nan amastigotes ak serom b2G ki gen (konpare Fig. 1C), sa a tou ogmante pousantaj enfeksyon nan DC, men nan yon limit pi piti.

Fig. 2Opsonizasyon L. pi gwo ak antikò kwa-reyaktif mennen nan amelyore absorption parazit pa DC. Imatirite C57BL/6 BMDC(2× 105) yo te ko-kilti ak amastigotes ki soti nan sourit BALB/c oswa selil B µMT (1:3). Anvan ko-enkubasyon, amastigotes yo te opsonize ak serom nòmal sourit (NMS), serom iminitè (IS), serom ki gen antikò anti-fosfolipid yo te jwenn nan vaksinasyon repete ak timosit apoptotik (aPL), oswa serom ki gen anti- 2 glikoprotein. antikò (2G). Apre 18h, pousantaj enfeksyon yo te detèmine sou cytospins pa mikwoskopi limyè (n=3, *p Mwens pase oswa egal a 0.{05,**p Mwens pase oswa egal a 0.005, ak ***p Mwens pase oswa egal a 0.002 an konparezon ak kontwòl san osonizasyon)

Antikò anti-fosfolipid kwa-reyaktif amelyore rezilta maladi nan leishmanioz kutane

Nan eksperyans ki vin apre, nou te vle evalye si opsonizasyon parazit akkwa-reyaktifantikò chanje rezilta maladi nan vivo. Pou sa ka fèt, promastigotes metacyclic izole ak anrichi nan kilti parazit yo te opsonize ak diferan sera jan sa dekri pi wo a. Parazit opsonize ak NMS te sèvi kòm yon kontwòl negatif. Apre anpil lave parazit, gwoup senk sourit C57BL/6 te enfekte intradermally ak 103 L. pi gwo. Devlopman lezyon yo te kontwole pou ~ 4 mwa. Nan liy ak rezilta anvan yo, parazit opsonize ak IS pwovoke pi piti blesi zòrèy nan liy ak yon frekans ogmante nan DC enfekte po nan pwen tan bonè (Fig. 3). Surprenante, parazit opsonize ak PL oswa 2G menm jan an ankouraje rezilta maladi menm jan an menm jan an detèmine pa 50 pousan redwi volim blesi ant semèn 5 ak 8 apre enfeksyon.

Antikò anti-fosfolipid kwa-reyaktif amelyore rezilta maladi nan leishmanioz kutane

Nan eksperyans ki vin apre, nou te vle evalye si opsonizasyon parazit akkwa-reyaktifantikò chanje rezilta maladi nan vivo. Pou sa ka fèt, promastigotes metacyclic izole ak anrichi nan kilti parazit yo te opsonize ak diferan sera jan sa dekri pi wo a. Parazit opsonize ak NMS te sèvi kòm yon kontwòl negatif. Apre anpil lave parazit, gwoup senk sourit C57BL/6 te enfekte intradermally ak 103 L. pi gwo. Devlopman lezyon yo te kontwole pou ~ 4 mwa. Nan liy ak rezilta anvan yo, parazit opsonize ak IS pwovoke pi piti blesi zòrèy nan liy ak yon frekans ogmante nan DC enfekte po nan pwen tan bonè (Fig. 3). Surprenante, parazit opsonize ak PL oswa 2G menm jan an ankouraje rezilta maladi menm jan an menm jan an detèmine pa 50 pousan redwi volim blesi ant semèn 5 ak 8 apre enfeksyon.

Apre sa, nou te itilize µMT amastigotes enkubasyon ak 100 µg IgG anrichi nan NMS, IS, oswa PL (Fig. 4). Yon fwa ankò, nou te obsève ke tou de IgG ki soti nan IS oswa PL te lakòz maladi pi modere ak pi piti blesi, kòm konpare ak parazit unopsonized (Fig. 4A). Nan liy, fado parazit nan tisi lezyonèl jan yo detèmine nan semèn 6 apre enfeksyon revele (siyifikativman) fado parazit ki pi piti nan enfeksyon inisye nan prezans antikò parazit-obligatwa (Fig. 4B). Restimulasyon antijèn espesifik nan selil nœuds lenfatik drenaj ak SLA te revele nivo ki pa chanje nan IFN, tandiske nivo ki pi ba IL-4 ak IL{-10 yo te jwenn nan sourit sa yo ki enfekte ak parazit IgG-opsonize (Fig. 4C) . Sa a se nan liy ak diminye gwosè blesi depi travay anvan yo te montre ke eliminasyon parazit nan sourit se depann sou aktivasyon an nan MΦ enfekte pa IFN blesi, ki se kontrekare pa IL-4 ak - trè enpòtan - IL-10 . Kòm sa yo, efè IL-10 sou MΦ ki enfekte te mennen nan pèsistans parazit. Kidonk, rapò ki genyen ant IFN sou yon bò, ak Th2/Treg-asosye sitokin tankou IL-4 ak IL-10 parèt pi enpòtan pou rezilta maladi a.

Enteresan, sepandan, nan anviwònman sa a, pi piti volim blesi yo te obsève tou, lè yo te itilize IgG ki soti nan NMS pou opsonizasyon ki endike prezans nan.kwa-reyaktifantikò natirèl nan serom nan sourit nayif tou.

Tou de antikò espesifik Leishmania ak kwa-reyaktif ka ranplase mank jenetik IgG.

Pou pi byen analize kontribisyon espesifik subtip imunoglobulin nan repons a Leishmania, nou te sèvi ak sourit IgMi ak IgG1i nou te deja pwodwi. Sourit IgMi yo se sourit kote tout selil B yo eksprime IgM, men yo pa ka chanje klas ni sekrete antikò. Nan sourit IgG1i yo, tout selil B yo devlope lè l sèvi avèk IgG1 kòm reseptè selil B yo, men selil sa yo tou pa ka chanje klas men yo kapab sekrete antikò IgG1. Nou enfekte sourit IgMi ak IgG1i sou background jenetik C57BL/6 ak 103 L. pi gwo. Nou te jwenn ke prezans nan IgG1 nan sera yo te ase pou sourit yo monte yon repons konplè nan parazit la, menm jan ak bèt yo ki kalite sovaj (Fig. 5A). Nan contrast, absans la nan antikò sekrete jan yo wè nan sourit yo IgMi te ase retade rekiperasyon an nan sourit yo (Fig. 5A).

Apre sa, nou rekonstitye sourit IgMi yo oswa kontwòl kalite sovaj ak swa NMS oswa IS ak Lè sa a, enfekte yo ak L. gwo promastigotes. Kòm espere, nan tou de tansyon sourit, rekonstitisyon IS pwovoke blesi siyifikativman pi piti nan vivo ki konfime ke IgG-medyatè absòpsyon akselere parazit pa DC ankouraje amelyore anti-Leishmania.iminite(figi 5B). Finalman, nou te evalye rezilta maladi apre itilizasyon parazit opsonize yo. Anvan enfeksyon sourit IgMi, parazit yo te opsonize ak IgG rich nan NMS, IS, oswa PL serom (Fig. 5C). Nan liy ak eksperyans ki montre nan Fig. 5B, parazit IS-opsonize fasilite defans parazit ranfòse. Yon fwa ankò, antikò antifosfolipid yo te kapab ranplase Leishmania-espesifik IgG soti nan IS nan ke tou de antikò IgG mare nan L. gwo promastigotes anvan enfeksyon ankouraje pi bon rezilta maladi nan sourit IgMi. IS- ak PL-opsonize parazit pwovoke volim blesi siyifikativman pi piti ak geri pi bonè kòm konpare ak parazit unopsonized.

Sa ki enpòtan, administrasyon NMS nan sourit IgMi "normalize" fenotip yo nan rezilta maladi yo obsève nan sourit C57BL / 6 (figi 5B). Konklizyon sa yo nan liy ak done nou yo montre pi wo a sijere ke NMS gen ladan tou yonkwa-reyaktifantikò IgG izotip ki kapab mare nan parazit ak konsekans fonksyonèl ki vin apre nan vitro ak nan vivo. Pli lwen konfimasyon soti nan sourit IgMi ki enfekte ak parazit NMS-kouvwi, ki te tou kapab pi byen kontwole enfeksyon (figi 5C).

Fig. 4Parazit antikò-opsonize pwovoke iminite efikas nan µMT selil B ki pa gen anpil. Parazit yo te opsonize ak serom nòmal sourit (NMS), serom iminitè (IS), serom ki gen antikò antifosfolipid (a-PL), oswa — sourit C57BL/6 sèlman — serom ki gen antikò anti- 2 glikoprotein (2G) nan prezans adjuvant Freud la (FA). Gwoup ki gen plis pase oswa egal a 5 µMT sourit yo te enfekte ak 103 promastigot metasiklik opsonize nan L. major. Devlopman lezyon yo te evalye chak semèn. B Nan semèn 6, yo te detèmine chaj parazit blesi nan sourit µMT ki enfekte lè yo limite tès dilution. Yo montre nimewo parazit endividyèl yo; ba eksprime vle di. C Des cytokine nan drenaj µMT LN selil yo te detèmine pa restimulation ak idrosolubl antijèn Leishmania (SLA). IFNΓ, IL{{10}}, ak IL-10 lage nan 48-h supernatant yo te evalye pa ELISA (mwayèn±SEM, n=15 sourit/gwoup ki soti nan endepandan 3 eksperyans, *p Mwens pase oswa egal a 0.05, **p Mwens pase oswa egal a 0.005, ak ***p Mwens pase oswa egal a 0.002 an konparezon ak sourit ki enfekte ak parazit unopsonized)

Serom imen gen antikò fonksyonman aktif, parazit kwa-reyaktif

Pou teste enpòtans rezilta nou yo pou moun, promastigot oswa amastigot izole nan sourit µMT ki pa gen selil B yo te opsonize ak serom nòmal imen (NHS), serom ki soti nan pasyan L. gwo enfekte (LM), oswa serom nan pasyan APS (APS). ). Yo te detèmine IgG ki gen andigman sou parazit lè l sèvi avèk sitometri koule. Enteresan, LM serom mare fèb nan sifas promastigotes, men fòtman nan amastigotes. Enteresan, serom APS te genyen menm nivo IgGkwa-reyaktifak sifas parazit (figi 6A).

IgG te vin anrichi nan seri LM lè l sèvi avèk kolòn pwoteyin A (figi 6B). Sa a ak diferan konsantrasyon nan imunoglobulin venn (IVIG) yo itilize pou tretman divès maladi (iminitè) pasyan yo te pwochen itilize pou opsonizasyon parazit anvan sitometri koule. Leishmania IgG siyifikativman mare nan promastigotes ak amastigotes nan L. major. Enteresan, IVIG ki disponib nan Commerce te genyen IgG sakwa-reyajitou de ak promastigote kòm byen ke preparasyon parazit amastigote.

Finalman, CD1c plis prensipal myeloid imen DC soti nan manto buffy yo te enkubate ak µMT amastigotes nan L. pi gwo enkubasyon ak serom LM oswa serom soti nan pasyan APS oswa IVIG (MOI 3; Fig. 7). Konfime done muri nou yo lè l sèvi avèk selil imen nou obsève ke prezans IgG (kwa-reyaktifoswa Leishmania-espesifik) sou sifas Leishmania se ase ankouraje amelyoreparazitentèrnalizasyonpa DC. Serom APS te ogmante pousantaj DC ki enfekte pa prèske 100 pousan, tandiske serom LM ak IVIG te ogmante absòpsyon parazit pa 30 pousan konpare ak parazit ki pa gen okenn pèsonalite. Enteresan, serom NMS tou te genyen pwomosyon IgG parazit-reyaktifparazitentèrnalizasyon.

Fig. 5 C57BL/6, IgMi, ak IgGi sourit rekonstitye ak diferan sera oswa enfekte ak diferan pirifye IgG opsonized L. gwo egzibisyon rezilta maladi amelyore. Yon Gwoup ki gen plis pase oswa egal a 5 sourit C57BL/6, C57BL/6 IgMi, oswa IgGi te enfekte ak inokula fizyolojik ki ba nan L. major (103 promastigot metacyclic). B Yon semèn anvan enfeksyon, sourit C57BL/6 ak B6 IgMi yo te rekonstitye ip de fwa ak 100 µL swa serom nòmal sourit (NMS) oswa serom iminitè (IS). C Anvan enfeksyon sourit IgMi yo, parazit yo te opsonize ak IgG ki te anrichi nan sera pa lye nan kolòn pwoteyin A [nòmal serom sourit (NMS), serom iminitè (IS), oswa serom ki gen antikò anti-fosfolipid (a-PL)]. Yo te evalye devlopman lezyon A–C chak semèn (mwayèn±SEM, n=10 sourit/gwoup ki soti nan 2 eksperyans endepandan, *p mwens pase oswa egal a 0.05, **p mwens pase oswa egal a 0.005, ak *** p Mwens pase oswa egal a 0.002 konpare ak C57BL/6 [A], C57BL/6 oswa IgMi [B], oswa okenn [C])

Fig. 6Antikò antifosfolipid nan seri imen kwa-reyaksyon ak molekil sifas L. pi gwo. Promastigotes metacyclic ki soti nan kilti faz estasyonè oswa amastigotes lesional nan L. pi gwo izole nan sourit µMT yo te opsonize ak diferan kalite seri imen (5 pousan) oswa IgG pirifye. Nòmal seri imen (NHS) yo te jwenn nan matyè kontwòl ki an sante. Sera ki soti nan pasyan ki gen pwouve leishmanioz kutane (LM, akeri nan Marocco, n=4) ak nan pasyan ki gen sendwòm antifosfolipid (PL, n=3) yo te itilize tou. B IgG te anrichi nan seri LM lè l sèvi avèk kolòn pwoteyin A (n=3). Yo te itilize diferan konsantrasyon imunoglobulin venn (IVIG, n=2) (µg/mL). A ak B Parazit yo te analize pou lyezon sifas nan total Ig imen lè l sèvi avèk sikometri koule. Liaison Ig la te kalkile anrapò ak nivo debaz parazit ki pa opsonize yo (mwayèn±SEM, *p Mwens pase oswa egal a 0.05, **p Mwens pase oswa egal a {{10} }}.005, ak ***p mwens pase oswa egal a 0.002)

Diskisyon

Gerizon nan leishmanioz kutane mande pou priming selil T efikas ak lage IFN, tou de depann sou DC enfekte yo prezante antijèn nan selil T nayif. Kontrèman ak CR3-fagositoz depandan pa MΦ, nou te montre saparazitentèrnalizasyonpa DC rive atravè Fc RI ak Fc RIII, ki ka ranplase youn ak lòt. Kòm sa yo, Fc -, Fc RI/Fc RIII-defisi sourit, ak selil B ki pa gen anpil sourit µMT (tout sou C57BL/6 background) te devlope pi gwo blesi ak reta gerizon, lè yo konpare ak sourit sovaj, akòz pwoblèm DC-. depandan priming selil T. Etid nou an konfime obsèvasyon anvan sa a, men anplis de sa, done nou yo lè l sèvi avèk sourit IgMi ak IgGi tou sijere ke tout bon antikò sekrete, epi yo pa sèlman prezans nan selil B, yo enpòtan anpil pou monte yon repons efikas nan parazit la. Kòm sa yo, menm jan ak sourit B selil ki manke, sourit IgMi ak selil B ki pa kapab pwodwi IgG te montre pi gwo gwosè blesi konpare ak sourit IgGi yo oswa sourit sovaj.

Paske tou de NMS ak IS-opsonize amastigotes yo te pran jiska limit menm jan ak NMS-opsonize promastigotes pa te fagocytosed pa DCs (ak obligatwa efikas nan IgM nan sifas yo), nou te deja konkli ke IgM pa obligatwa pou absorption parazit. Nan etid prezan an, nou te kapab konfime rezilta sa yo lè nou itilize seri sourit nòmal nan sourit ki swa manke selil B yo oswa sèlman antikò sekrete. Anplis de sa, nou te kapab montre ke IgG1-ki gen seri yo te kapab amelyore antre amastigotes nan DC imen ak sourit.

Li te rete san rezoud kijan premye repons selil B la devlope nan absans DC ki enfekte. Youn nan posibilite yo te ke nan pisin nan "natirèl" IgG,kwa-reyaktifantikò yo ka rekonèt parazit epi sèvi kòm ranplasan pou antikò espesifik Leishmania ki devlope pita (ap monte ant semèn 4 ak semèn 6 apre enfeksyon). Anplis de antikò espesifik antijèn, sa yo rele antikò natirèl yo pwodui nan selil B-1 nan sourit ak imen apre nesans. Gen kèk ki gen kapasite pou rekonèt pwòp tèt ou-antijèn; pou yon tan long, yo te kwè yo manke espesifik pou antijèn etranje yo. Apre sa, done yo bay prèv pou IgM natirèl rekonèt divès antijèn mikwòb ak kontribiye nan eliminasyon patojèn. Dènyèman, sepandan, plizyè etid revele ke IgG natirèl jwe yon wòl nannatirèl iminiteosi byen. Li te montre yo kominike avèk patojèn ki asosye lektin (egzanp, MBL), ak fòme konplèks iminitè yo netwaye patojèn yo. Yo espere tou IgG natirèl ki gen patojèn yo kominike avèk lòt PRR, tankou C1q, pou aktive chemen konpleman klasik la. Li te montre ke IgG natirèl espesyalman kolabore ak lektin patojèn ki asosye pou pwovoke yon aksyon antimikwòb efikas kont enfeksyon opòtinis Pseudomonas aeruginosa ak Staphylococcus aureus.

Pandan lanmò selil apoptotik, yo obsève ekspoze fosfatidylserin (PS) sou kò apoptotik. Rekonesans lame nan PS sou sifas la nan mouri oswa selil mouri atravè antikò se yon etap enpòtan nan clearance yo. Nan yon pwosesis ki rele "imitasyon apoptotik," parazit Leishmania yo konnen tou ekspoze PS sou pwòp sifas yo sèvi kòm yon siyal "manje-m" pou selil fagositik, menm jan ak sa yo wè nan selil apoptotik yo. Anplis de sa, kèk nan pwomastigot nan etap enfektye yo mouri (san patisipasyon caspases) epi ekspoze PS tèt yo. Fòm lavi amastigote entraselilè obligatwa, sepandan, tout ekspoze PS sou sifas yo ki pèmèt yo antre nan selil lame yo avèk efikasite. Kounye a nou evalye si antikò PL atifisyèlman pwovoke yo kapab rekonèt parazit Leishmania epi si sa yo fonksyonèl aktif pou fasilite antre parazit nan selil lame ki enpòtan yo. Nou te obsève ke antikò murin ak imen anti-fosfolipid mare fòm lavi Leishmania. Sèvi ak diferan apwòch, nou te idantifyekwa-reyaktifantikò nan serom PL ki parèt preferansyèlman mare nan fosfolipid sifas nan L. major. Enteresan, menm si parazit promastigote eksprime fosfolipid sa yo tou jan yo demontre lè l sèvi avèk antijèn parazit idrosolubl ki soti nan fòm lavi parazit sa a nan yon ELISA, fosfolipid sifas yo parèt pi fò sou amastigotes. Anplis de sa, nou te montre ke opsonizasyon IgG sa a te ase pou ankouraje absòpsyon parazit pa DC. Sa ki enpòtan, nan vivo, parazit PL-opsonize pwovoke yon rezilta maladi amelyore ak pi piti volim blesi ak rezolisyon blesi pi bonè. Kidonk, nan liy ak obsèvasyon anvan nan gwoup nou an, akòz enfeksyon DC ranfòse nan prezans(kwa-reyaktif)IgG sou parazit yo, yo te pwovoke yon endiksyon preferansyèl nan selil Th1 / Tc1 ki asosye ak kantite diminye selil Th2 ak Treg, e konsa pi bon rezilta maladi a.

Figi 7Prensipal myeloid DC soti nan san imen preferans entèn parazit akkwa-reyaktifantifosfolipid IgG mare nan sifas yo. CD1a plis myeloid imen DC te izole nan manto buffy lè l sèvi avèk pèl MACS ak plake nan 2 × 105 selil/mL. Amastigotes izole nan sourit µMT yo te enkube ak 5 pousan serom oswa 10 µg/mL IVIG anvan koinkubasyon ak DC (1:3). Apre 18h, pousantaj enfeksyon yo te detèmine sou cytospins pa mikwoskòp limyè (n=3, *p Mwens pase oswa egal a 0.05, ak ***p Mwens pase oswa egal a 0.002 an konparezon ak kontwòl unopsonized)

Enteresan, nou te jwenn ke parazit opsonize ak NMS ankouraje pi bon rezilta maladi konpare ak parazit unopsonized ki endike prezans nan IgG natirèl nan NMS ki kapab rekonèt Leishmania. Sa a te pi byen vizib nan IgMi (sans selil B ki kapab pwodwi nenpòt IgG) ranplase ak NMS. Isit la, gwosè blesi klèman pi gwo sourit IgMi yo te redwi a sourit C57BL/6 sovaj (figi 5). Sepandan, prezans nan natirèl, Leishmaniakwa-reyaktifYo te obsève IgG tou nan sourit sovaj ki enfekte ak parazit NMS-opsonize konpare ak parazit unopsonized. Espesifik IgG natirèl sa yo nan serom murin ak imen pa klè jiskaprezan. Li se tante yo espekile ke sa yo se tou antikò rekonèt PS sou sifas parazit paske yo preferansyèlman mare nan amastigotes ak li te ye pi wo ekspoze nan PS konpare ak promastigotes tou.

Nou te jwenn ke serik la nan sijè ki an sante kontwòl imen (ki soti nan yon rejyon kote leishmaniasis sèlman rapòte kòm yon maladi vwayaj ak pa gen okenn istwa nan ansyen enfeksyon) tou te genyen IgG ki kapab obligatwa nan L. gwo amastigotes ak ankouraje absòpsyon parazit amelyore pa DC. Li enpòtan sonje ke IVIG yo itilize pou etid nou an prepare nan Almay (ki pa endemik pou leishmanioz). Enteresan, IgG imen anrichi soti nan IVIG soti nan Leishmania-negatif moun konsa genyen IgG ki te kapab obligatwa tou de promastigotes ak (pwobableman akòz pi wo ekspoze PS) L. gwo amastigotes. Nan liy, serik la nan pasyan APS ak nivo segondè nan antikò antifosfolipid ki genyen IgG ki preferans mare nan amastigotes, pi piti a promastigot. Tou de IgG ki soti nan APS sera osi byen ke IgG ki soti nan IVIG ankouraje absorption parazit amelyore pa DC imen prensipal nan yon degre konparab (oswa menm pi bon nan ka a nan PL ki gen seri APS) ak IgG iminitè ki sòti nan serom ki soti nan pasyan leishmanioz.

An rezime, done nou yo montre ke sourit nòmal osi byen ke seri imen, menm pran nan men moun ki pa janm ekspoze a Leishmania, gen antikò IgG ki kapab lye nan parazit sa a, fasilite anglouti li pa DCs, ak amelyore yon repons iminitè pwoteksyon nan lame. Menmsi antijèn Leishmania (yo) rekonèt pa totalman klè, kèk nan reyaksyon an ka dirije kont fosfolipid ki pi abondan sou amastigote, konpare ak sifas promastigote. Konklizyon nou yo ka pave wout la nan konsepsyon pi bon terapi pou parazit sa a epi yo ka menm sèvi kòm yon prekosyon premye liy pou moun ki vwayaje nan zòn Leishmania ki enfekte.

Rekonesans

Otè yo sensèman remèsye Mark C. Udey ak Philipp von Landenberg pou diskisyon itil yo ak pou bay echantiyon pasyan yo.

Kontribisyon otè 

FD, SLK, ak ST fè eksperyans yo dekri nan maniskri sa a. ST, AW, ak EvS te asire finansman an pou pwojè a epi sipèvize travay la. AW ak EvS te ekri maniskri a.

Finansman

Finansman Open Access pèmèt ak òganize pa Projekt DEAL. Etid la te sipòte pa lajan ki soti nan DFG (SFB 490 pou EvS ak AW ak SFB 1292 pou EvS, AW, ak ST) ak Sant pou Medsin Molekilè (CMMC) Cologne pou EvS.

Disponibilite done ak materyèl 

Pa aplikab.

Deklarasyon

Apwobasyon etik ak konsantman pou patisipe

Tout eksperyans ak sourit yo te fè selon konsèy eta Rhineland Pfalz.

Konsantman pou piblikasyon

Tout otè dakò pou piblikasyon.

Enterè konpetisyon

Otè yo pa deklare okenn enterè konpetisyon.

Aksè Lib Atik sa a gen yon lisans Creative Commons Attribution 4.0 Entènasyonal Lisans, ki pèmèt itilizasyon, pataje, adaptasyon, distribisyon, ak repwodiksyon nan nenpòt mwayen oswa fòma, toutotan ou bay otè orijinal la kredi apwopriye. (s) ak sous la, bay yon lyen ki mennen nan lisans Creative Commons, epi endike si yo te fè chanjman. Imaj yo oswa lòt materyèl twazyèm pati nan atik sa a enkli nan lisans Creative Commons atik la sof si yo endike otreman nan yon liy kredi nan materyèl la. Si materyèl pa enkli nan lisans Creative Commons atik la epi itilizasyon ou gen entansyon pa otorize pa règleman lalwa oswa depase itilizasyon otorize a, w ap bezwen jwenn pèmisyon dirèkteman nan detantè copyright la.

Referans

1.Burza S, Croft SL, Boelaert M (2018) Leishmaniasis Lancet 392: 951-970.

2. von Stebut E, Tenzer S (2018) Cutaneous leishmaniasis: fonksyon diferan nan selil dendritik ak makrofaj nan entèraksyon an nan sistèm iminitè lame a ak Leishmania pi gwo. Int J Med Microbiol 308:206–214.

3. Sacks D, Noben-Trauth N (2002) Iminoloji nan sansiblite ak rezistans nan Leishmania pi gwo nan sourit. Nat Rev Immunol 2:845–858.

4. de Freitas ESR, von Stebut E (2021) Débouyé wòl pòs iminitè yo nan leishmanioz. Front Immunol 12:620144.

5. Schonlau F, Scharfetter-Kochanek K, Grabbe S, Pietz B, Sorg C, Sunderkotter C (2000) Nan defisyans eksperimantal leishmaniasis CD18 rezilta nan difizyon parazit ki asosye ak fonksyon makwofaj ki chanje ak repons selil Th1 enkonplè. Eur J Immunol 30: 2729–2740.

6. Woelbing F, Kostka SL, Moelle K, Belkaid Y, Sunderkoetter C, Verbeek S, Waisman A, Nigg AP, Knop J, Udey MC, et al (2006). fasilite akizisyon iminite pwoteksyon. J Exp Med 203:177–188

7. Nagele EP, Han M, Acharya NK, DeMarshall C, Kosciuk MC, Nagele RG (2013) Otoantikò IgG natirèl yo abondan ak omniprésente nan seri imen ak nimewo yo enfliyanse pa sèks laj, ak maladi. PLoS ONE 8:e60726.

8. Lutz HU, Binder CJ, Kaveri S (2009) Otoantikò ki rive natirèlman nan omeyostazi ak maladi. Tandans Immunol 30:43–51.

9. Wanderley JL, Barcinski MA (2010) Apoptoz ak mimik apoptotik: koneksyon Leishmania. Cell Mol Life Sci 67:1653–1659.

10. Waisman A, Croxford AL, Demircik F (2008) Nouvo zouti pou etidye wòl selil B nan enfeksyon cytomegalovirus. Med Microbiol Immunol 197:145-149

11. Von Stebut E, Ehrchen JM, Belkaid Y, Kostka SL, Molle K, Knop J, Sunderkotter C, Udey MC (2003) Interleukin 1alpha fè pwomosyon diferansyasyon Th1 ak inibit pwogresyon maladi nan sourit BALB/c Leishmania pi gwo-sansib. J Exp Med 198:191–199

12. Levine JS, Subang R, Nasr SH, Fournier S, Lajoie G, Wither J, Rauch J (2006) Vaksinasyon ak yon pwoteyin apoptotik selil-obligatwa rezime nefrit la ak aparisyon otoantikò sekans nan lupus sistemik eritematos. J Immunol 177:6504–6516.

13. Wanderley JLM, DaMatta RA, Barcinski MA (2020) Apoptotic mimicry kòm yon estrateji pou etablisman enfeksyon parazit: parazit ak lame ki sòti fosfatidylserine kòm yon molekil kle. Cell Commun Signal 18:10.

14.McDonnell T, Wincup C, Buchholz I, Pericleous C, Giles I, Ripoll V, Cohen H, Delcea M, Rahman A (2020) Wòl beta-2-glycoprotein I nan sante ak maladi ki asosye estrikti ak fonksyon. : plis pase jis APS. San Rev 39:100610.

15. Dominguez M, Torano A (1999) Opsonophagocytosis iminitè aderans: mekanis enfeksyon Leishmania. J Exp Med 189:25–35.

16. Belkaid Y, Hofmann KF, Mendez S, Kamhawi S, Udey MC, Wynn TA, Sacks DL (2001) Wòl interleukin (IL) -10 nan pèsistans Leishmania pi gwo nan po a apre gerizon ak la. potansyèl terapetik anti-IL-10 reseptè antikò pou geri esteril. J Exp Med 194:1497–1506.

17. Waisman A, Kraus M, Seagal J, Ghosh S, Melamed D, Song J, Sasaki Y, Classen S, Lutz C, Brombacher F et al (2007) CD22 inibit siyal reseptè selil B IgG1 B epi li ankouraje devlopman nan Selil B ki gen siviv mwens depann sou Ig{alfa}/{beta}. J Exp Med 204:747–758

18. Panda S, Ding JL (2015) Antikò natirèl pon iminite natirèl ak adaptasyon. J Immunol 194:13–20.

19. Puga I, Cerutti A (2013) Pwoteksyon pa IgG natirèl: yon patenarya dous ak lektin idrosolubl fè jwe fent la! EMBO J 32:2897–2899.

20. Duncan AR, Winter G (1988) Sit la obligatwa pou C1q sou IgG. Nature 332:738–740.

21. Panda S, Zhang J, Tan NS, Ho B, Ding JL (2013) Antikò IgG natirèl bay pwoteksyon natirèl kont bakteri kolon-opsonize. EMBO J 32:2905–2919.

22. El-Hani C, Borges V, Wanderley JL, Barcinski M (2012) Apoptoz ak mimik apoptotik nan Leishmania: yon pèspektiv evolisyonè. Selil Front Enfekte Microbiol 2:96.

Pou plis enfòmasyon tanpri kontakte nou nan:david.deng@wecistanche.com tel:0013632399501